JAK1/Janus-associated kinase 1

体外活性：Itacitinib（也称为 INCB39110）是一种有效的、选择性的、口服生物可利用的 JAK1（Janus 相关激酶 1）抑制剂，对 JAK1 的选择性是 JAK2 的 >20 倍，是 JAK3 和 TYK2 的 >100 倍（IC50）对于 JAK1、2、3 和 TYK2，分别为 2、63、>2000 和 795 nM）。它具有潜在的抗肿瘤活性，目前正处于治疗骨髓纤维化、类风湿性关节炎和斑块状银屑病的二期临床试验中。 Janus 激酶 (JAK) 是由四种酶组成的家族； JAK1、JAK2、JAK3 和酪氨酸激酶 2 (TYK2) 在细胞因子信号转导中至关重要，并且与癌症和炎症性疾病密切相关。激酶测定：Itacitinib 对 JAK1 的选择性是 JAK2 的 >20 倍，是 JAK3 和 TYK2 的 >100 倍（JAK1、2、3 和 TYK2 的 IC50 分别为 2、63、>2000 和 795 nM）。 Itacitinib (INCB039110) 是一种有效的选择性 JAK1 抑制剂，对 JAK1 的选择性是 JAK2 的 20 倍以上，是 JAK3 和 TYK2 的 100 倍以上。骨髓纤维化研究采用 itacitinib [1]。

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伊塔替尼减少巨噬细胞产生IL-6[3]
最近的证据表明，宿主巨噬细胞是CAR-T细胞治疗后IL-6的主要生产者。因此，我们质疑伊塔替尼是否会阻止宿主巨噬细胞产生IL-6。首先，用粒细胞集落刺激因子在体外扩增小鼠骨髓来源的巨噬细胞，并在第6天将伊塔替尼加入培养物中。在第7天将LPS加入培养物中以激活巨噬细胞。阿替尼的预防性治疗以剂量依赖的方式减少了IL-6的产生，表明阿替尼在减少炎性细胞因子产生方面的活性并非仅限于T细胞（图2A）。我们还观察到其他几种细胞因子（即IL-10、IL-12p70、KC/GRO，补充图S2）的减少趋势并不显著

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伊塔替尼减少CAR T细胞因子的产生[3]
尽管宿主免疫系统产生细胞因子是CRS的主要原因，但CAR-T细胞产生炎性细胞因子也是主要原因。在证明伊塔替尼能够减少宿主免疫系统产生炎性细胞因子后，我们接下来想研究伊塔替尼是否能减少CAR T细胞产生炎性因子。在与临床试验中达到的人体剂量相当的托珠单抗或伊塔替尼浓度下扩增人CD19-CAR T细胞。扩增3天后，CAR T细胞与表达CD19的NAMALWA靶细胞共培养，6小时后收集上清液以定量细胞因子。伊塔替尼，而不是托珠单抗，能够显著降低许多炎性细胞因子（即IL-2、IFN-γ、IL-6和IL-8）的水平（图3）。作为内部对照（背景），我们还测量了非转导T细胞产生的细胞因子（图3）。

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临床相关浓度的伊塔替尼不影响PBMC增殖[3]
由于T细胞起着重要的抗肿瘤作用，因此研究了伊塔替尼对T细胞的影响，以确定治疗是否可能导致广泛的免疫抑制，从而可能干扰正常的T细胞增殖和功能。T细胞是从健康成年人的新鲜分离的人外周血单个核细胞中获得的。在用抗CD3/抗CD28包被的珠子激活后，T细胞在浓度增加的伊塔替尼存在下扩增，并通过流式细胞术测量增殖。与二甲基亚砜（DMSO）对照组相比，与IC50相关的伊塔替尼浓度（50-100nM）对抗CD3/抗CD28诱导的人T细胞扩增没有显著影响（图4A），表明伊塔替尼治疗对T细胞增殖能力没有负面影响。作为内部控制，与JAK/STAT信号活性的破坏一致，更高浓度的伊塔替尼（1000 nM）阻断了T细胞增殖（图4A）。

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伊塔替尼不影响CAR-T细胞增殖[3]
为了研究阿替尼对CAR T细胞扩增和细胞溶解活性的特异性影响，在阿替尼浓度从100 nM增加到500 nM的情况下，用抗CD3/抗CD28包被的珠子扩增GD2-CAR T细胞。再次，与DMSO对照组相比，100-250nM的伊塔替尼对CD3/CD28诱导的GD2-CAR T细胞扩增没有显著影响，而500nM足以阻断CAR T细胞增殖（图4B）。重要的是，在低浓度（100和250 nM）伊塔替尼存在下扩增的GD2-CAR T细胞能够有效裂解表达GD2的肿瘤细胞（图4C）。作为阴性（背景）对照，我们还测量了非转导（非特异性）T细胞的靶细胞裂解。正如预期的那样，GD2-CAR T细胞在高剂量伊塔替尼（500 nM）存在下扩增，无法诱导靶细胞裂解超过背景水平（图4C）。综上所述，这些数据表明，IC50相关剂量的伊塔替尼不会干扰CAR-T细胞增殖或体外抗肿瘤活性。 接下来，我们询问伊塔替尼是否对CAR-T细胞抗原特异性增殖有影响。EGFR-CAR T细胞用抗CD3/CD28珠扩增2周，然后在伊塔替尼或DMSO对照存在下用EGFR珠重新刺激。同样，与IC50相关的伊塔替尼剂量（100或250 nM）不影响CAR-T细胞抗原特异性增殖（图4D）。

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伊塔替尼在体外不影响CD19-CAR T细胞溶解活性[3]
为了研究阿替尼对靶向CD19抗原的人CAR T细胞的影响，我们用阿替尼或抗IL-6受体（托珠单抗）处理CD19-CAR T细胞3天，然后测量它们对表达CD19的靶细胞的细胞溶解活性。尽管模拟人类药理活性的托珠单抗浓度显著降低了CAR T细胞的细胞溶解活性，但与对照CAR T细胞相比，100 nM的伊塔替尼没有显示出显著效果（图6A）。用更高剂量的伊塔替尼（300 nM，约为细胞IC50的五倍）扩增的CAR T细胞对抗肿瘤活性显示出适度但具有统计学意义的抑制作用（图6A）。作为内部对照，还测试了未转染的PBMCs的抗肿瘤活性。未转导的T细胞不能特异性裂解靶细胞，并且不受超过背景水平的伊塔替尼或托珠单抗治疗的影响（图6B）。

Itacitinib 能够以临床相关剂量抑制小鼠人胰腺异种移植模型中的肿瘤生长，无论是作为单一疗法还是与吉西他滨等细胞毒性药物联合使用。

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伊塔替尼/Itacitinib降低急性恶性炎症小鼠模型中的细胞因子水平[3]
由于CRS是与CAR T细胞治疗相关的最常见的副作用，我们研究了伊塔替尼是否能够降低与导致CRS的急性过度活化相关的细胞因子水平。因此，我们进行了实验，用ConA挑战天真动物，ConA是一种强效的T细胞有丝分裂原，能够诱导广泛的炎症细胞因子释放和增殖。与经历CRS的个体相似，接受ConA治疗的动物血清中多种炎性细胞因子水平升高，并出现行为变化，如发烧、不适、低血压、缺氧、毛细血管渗漏、多器官毒性和潜在死亡。为了研究伊塔替尼在该模型中的作用，相应的动物被预防性地给予60或120mg/kg的伊塔替尼来达到与临床试验中观察到的JAK1抑制覆盖率相当的效果。与赋形剂给药动物相比，伊塔替尼能够以剂量依赖的方式显著降低CRS中许多细胞因子（即IL-6、IL-12和IFN-γ）的血清水平（图1A）。正如预期的那样，伊塔替尼对独立于JAK1途径的细胞因子（即IL-5，图1A）没有显著影响。然而，并非所有JAK介导的细胞因子都显著降低（即IL-4，图1A）。此外，在ConA攻击后30分钟给动物服用伊塔替尼的治疗模式中，伊塔替尼也能够剂量依赖性地减少CRS相关的细胞因子（图1B）。

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为了证实伊塔替尼/Itacitinib减少恶性炎症的能力，用抗CD3攻击幼稚动物以诱导非特异性T细胞活化和细胞因子反应。同样，相应的动物被预防性或治疗性地给予120mg/kg的伊塔替尼。与载体治疗的小鼠相比，伊塔替尼能够显著降低CRS中许多细胞因子的血清水平，但对独立于JAK1途径的细胞因子没有影响（补充图S1A）[3]。

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在确定伊塔替尼能够在体外减少IL-6的产生后，我们接下来将我们的研究扩展到体内环境，以评估伊塔替尼对小鼠活化巨噬细胞的影响。在接受腹腔注射LPS之前，用伊塔替尼或赋形剂对小鼠进行预防性治疗3天，以达到稳定状态。注射后两小时，从腹腔灌洗液中测量细胞因子。如图2B所示，模拟临床试验中JAK1抑制覆盖率的伊塔替尼剂量显著降低了体内活化巨噬细胞的IL-6产生。因此，来自体外和体内系统的数据表明，在实验诱导的CRS模型中，伊塔替尼能够下调炎症性IL-6的主要细胞来源[3]。

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伊塔替尼在体内不会损害T细胞抗肿瘤活性[3]
为了进一步测试伊塔替尼对抗原特异性T细胞增殖和体内抗肿瘤活性的影响，我们从OT-1小鼠中分离出脾细胞，OT-1小鼠是针对肽OVA257-264（SIINFEKL）特异性TCR Vα2Vβ5的转基因小鼠（36）。在浓度逐渐增加的伊塔替尼存在下，用SIINFEKL肽扩增OT-1 T细胞，并通过流式细胞术测量其扩增情况。正如预期的那样，与IC50相关的伊塔替尼浓度对扩增速率的影响很小（补充图S3A）。与最大游离浓度相关的伊塔替尼浓度（分别为189和244 nM，在没有或存在强效CYP3A4抑制剂的情况下）诱导了T细胞增殖的适度减少（补充图S3A）。为了评估伊塔替尼对OT-1 CD8体内抗肿瘤疗效的影响，我们进行了将OVA特异性CD8细胞过继转移到先前移植了OVA表达肿瘤细胞系（EG7）的C57BL/6小鼠体内的实验。肿瘤攻击后五天，相应的动物口服赋形剂或60或120mg/kg的伊塔替尼，每日两次，持续两周。肿瘤接种八天后，动物接受了OVA特异性OT-1幼稚CD8细胞的过继转移。与对照组相比，过继转移OT-1 CD8能够显著减少肿瘤生长（图4）。重要的是，与JAK1覆盖目标剂量相当的伊塔替尼剂量不会影响OT-1细胞的抗肿瘤疗效（图5）。

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伊塔替尼不影响体内CD19-CAR T细胞的抗肿瘤活性[3]
为了测试伊塔替尼的体内作用，我们研究了口服Itacitinib对CD19-CAR T细胞抗肿瘤作用的影响。用表达CD19+nalm6荧光素酶的人淋巴瘤细胞攻击免疫缺陷小鼠（NSG）。一旦肿瘤被植入（第4天），小鼠接受了3×106个人CD19-CAR T细胞的过继转移。在该模型中，CAR T细胞能够控制肿瘤生长，通过荧光素表达进行测量（图7）。重要的是，动物每日口服依他替尼剂量（120mg/kg）不影响过继转移的CAR T细胞的抗肿瘤活性，因此表明，在靶向剂量下，依他替尼对CAR T细胞抗肿瘤活性没有显著影响。

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最后，为了确认伊塔替尼在更具攻击性的模型上不会影响CAR T细胞活性，用5×106 CD19+NAMALWA荧光素酶表达的人淋巴瘤细胞攻击免疫缺陷小鼠（NSG）。一旦肿瘤被植入（第7天），小鼠接受了人CD19-CAR T细胞的过继转移。与接受对照细胞的动物相比，接受CAR T细胞过继转移的动物具有显著的肿瘤生长延迟，这可以通过荧光素表达（补充图S4B）和存活率扩大（P=0.0014）（补充图S46）来衡量。即使在这种侵袭性肿瘤模型中，动物每天口服依他替尼也不会影响过继转移的CAR T细胞的抗肿瘤活性（P=0.1860），从而证实了预防性服用依他替尼来预防CRS的安全性[3]。

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联合使用Janus激酶1（JAK1）和JAK2抑制治疗可有效减轻脾肿大和与骨髓纤维化相关的症状负担，但与剂量依赖性贫血和血小板减少症有关。在这项开放标签II期研究中，我们评估了三种剂量水平的强效选择性口服JAK1抑制剂Itacitinib/INCB039110在中度或高危骨髓纤维化患者中的疗效和安全性，血小板计数≥50×109/L。在10、45和32名参加100mg每日两次、200mg每日两次和600mg每日一次队列的患者中，分别有50.0%、64.4%和68.8%完成了第24周。在第12周（主要终点）和第24周，200mg每日两次队列中35.7%和28.6%的患者以及600mg每日一次队列中32.3%和35.5%的患者的总症状评分分别降低了≥50%。相比之下，100 mg每日两次队列中的两名患者（20%）在第12周和第24周的总症状评分降低了≥50%。对于200mg每日两次和600mg每日一次的队列，第12周脾脏体积减少的中位数分别为14.2%和17.4%。此外，在开始治疗前12周内需要输注红细胞的21/39（53.8%）患者在研究第1-24周内输注的红细胞数量减少了≥50%。只有一名患者因3级血小板减少症而停药。非血液学不良事件大多为1级或2级；最常见的是疲劳。INCB039110治疗导致临床上有意义的症状缓解，脾脏体积适度减少，骨髓抑制有限[1]。

Janus kinase (JAK)抑制剂(也称为Jakinibs)是一类靶向各种JAK亚型(JAK1、JAK2、JAK3和/或Tyk2)的小药物。它们发挥抗炎特性，部分与促炎M1巨噬细胞激活状态的调节有关。然而，JAK抑制剂对巨噬细胞更广泛激活状态的确切影响仍有待确定，特别是在涉及促炎M1巨噬细胞和促纤维化M2巨噬细胞同时激活的疾病背景下。在自身免疫性肺纤维化如硬皮病相关间质性肺疾病(ILD)中尤其如此，其中M1和M2巨噬细胞起关键的致病作用。在本研究中，我们直接比较了三种JAK抑制剂的抗炎和抗纤维化作用(ruxolitinib (JAK2/1抑制剂);tofacitinib (JAK3/2抑制剂)和itacitinib (JAK1抑制剂)对五种不同激活状态的人单核细胞源性巨噬细胞(MDM)的影响。这三种JAK抑制剂对巨噬细胞具有抗炎作用，这可以通过IFNγ和LPS或单独IFNγ激活的M1巨噬细胞中关键极化标志物(CD86、MHCII、TLR4)的表达下调和关键促炎细胞因子(CXCL10、IL-6和TNFα)的分泌有限来证明。我们还强调，这些JAK抑制剂可以限制由IL-4和IL-13诱导的巨噬细胞的M2a活化，特别是通过下调M2a相关表面标记物CD206和CCL18的分泌来证明。此外，这些JAK抑制剂降低了IL-10和地塞米松(M2c +指数)或单独IL-10 (M2c MDM)诱导的交替活化巨噬细胞中CXCL13、MARCO和SOCS3等标志物的表达。在所有极化态下，Jakinibs对JAK2的抑制作用在1 μM和0.1 μM范围内均达到最高。[2]

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激酶生化分析[4]
使用具有重组表位标记激酶结构域（JAK1，837–1142；JAK2，828–1132；JAK3，718–1124；TYK2，873–1187）和肽底物（生物素EQEDEPEGDYFLEX）的均相时间分辨荧光测定法进行酶测定。在测定缓冲液中，在有或没有测试化合物（11点稀释）、JAK酶、500 nM肽、三磷酸腺苷（ATP；1 mM）和2.0%二甲亚砜的情况下进行每种酶反应。50%抑制浓度（IC50）计算为抑制50%荧光信号所需的化合物浓度。使用每种激酶的ATP Km浓度，在标准筛选条件下测试100 nMItacitinib/INCB039110，评估了针对60种非JAK家族激酶的额外活性。与对照值相比，显著抑制被定义为大于或等于30%（重复测定的平均值）。

极化标记物的验证和考虑的JAK抑制剂在两种与人血浆水平相关的浓度下各自的毒性[2]
与未受M0刺激的MDM相比，CXCL10、IL-6、IL1Ra和TNFα在IFNγ诱导的M1i MDM和(IFNγ + LPS)诱导的M1Li MDM中均显著过表达(图1A-B)。CCL18、PDGFbb、PPARγ和tenascin C (TenaC)在(IL-4/IL-13)诱导的M2a MDM中与未刺激的M0 MDM相比显著过表达(图1C-D)。在IL-10诱导的M2c MDM和(IL-10/地塞米松)诱导的M2c + Dex中，CXCL13、IL-10、MARCO和SOCS3均上调(图1E)。

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T细胞增殖试验[3]
使用Ficoll-Hypaque分离法从人全血样本中制备外周血单核细胞（PBMCs），然后通过离心淘析从PBMCs中获得T细胞。T细胞在RPMI 1640培养基中维持，该培养基补充了10%胎牛血清、1%HEPES、2 mM L-谷氨酰胺、0.05 mM 2-巯基乙醇和100μg/mL链霉素，以及100单位/mL青霉素（完全RPMI或CM）。T细胞用Dynabeads（针对CD3/CD28的固定激动剂抗体）以3:1的比例激活，以0.5×106个细胞/mL的密度重新悬浮在24孔板中，并用不同浓度（50至1000 nM）的Itacitinib/伊塔替尼处理。将平板在37°C的5%CO2气氛中孵育10天，每隔一天通过珠基方法测定增殖情况。每隔一天用新鲜的CM补充培养物。

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细胞毒性试验[3]
将表达萤光素酶的SY5Y神经母细胞瘤细胞（GD-2+）以50000个细胞/孔的速度铺在96孔板中。24小时后，将150000个CAR-T细胞加入相应的孔中，最终体积为200μL。平行接种单独的靶细胞，以量化最大萤光素酶表达（相对发光单位；RLUmax）。17小时后，向共培养物中加入100μL荧光素底物。使用EnVision平板阅读器在孵育10分钟后测量发光。细胞裂解百分比通过以下计算获得：[1−（RLU实验）/（RLUmax）]×100。实验一式三份。

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单核细胞趋化蛋白（MCP）-1测定[4]
人外周血单个核细胞在37°C、5%CO2下用伊塔替尼预孵育10分钟，并在RPMI培养基中以1.5×106个细胞/ml的速度培养。通过添加30 ng/ml的人重组IL-6刺激孔，并在37°C、5%CO2下孵育48小时。收集上清液，并通过商业ELISA分析人MCP-1的水平。使用GraphPad Prism 5.0软件通过曲线拟合进行ItacitinibIC50测定。

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细胞增殖试验[4]
然后从PBMCs中获得人T细胞，并将其保存在含有10%胎牛血清的RPMI中。对于IL-2刺激的细胞增殖分析，首先用10μg/ml的植物血凝素处理细胞3天，以刺激IL-2受体的表达。随后洗涤细胞，以每孔6000个细胞的速度重新悬浮在RPMI培养基中，并在100 U/ml人IL-2的存在下用伊塔替尼处理。将平板在37°C的5%CO2中孵育3天，通过添加CellTiter Glo®试剂并检测发光来确定增殖情况。ItacitinibIC50测定使用GraphPad Prism 5.0软件进行。

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IL-17/IL-22细胞因子分析[4]
人外周血单个核细胞在添加10%胎牛血清的RPMI中维持，T细胞用1μg/ml抗CD3和5μg/ml抗CD28抗体激活。2天后，用IL-23（100ng/ml）、IL-2（10ng/ml）和伊塔替尼洗涤细胞并重新培养。细胞在37°C下再孵育4天。ELISA法测定上清液中IL-17和IL-22的浓度。

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人磷酸化STAT3（pSTAT3）全血测定[4]
将健康人类志愿者 的血液收集到肝素化管中。血液在37°C下与不同浓度的伊塔替尼一起孵育10分钟。随后，在37°C下用100ng/ml的IL-6刺激细胞15分钟。使用低渗条件裂解红细胞，并通过离心去除上清液。将白细胞制成颗粒并裂解，以制备总细胞提取物。使用商业化的磷酸-STAT3特异性ELISA分析提取物中的pSTAT3。

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新出现的证据表明肿瘤相关炎症在胰腺导管腺癌的发生和进展中的重要性。具体来说，炎症相关的IL-6/JAK/STAT3信号通路的组成性激活在胰腺肿瘤中已被报道，并被认为是晚期疾病患者总生存率的不良预后因素。本研究的目的是评估IL-6/JAK/STAT3信号抑制对体外胰腺细胞生长和体内肿瘤生长的影响。INCB039110是一种JAK1选择性抑制剂，目前处于多个2期临床试验中，用于阻断细胞中IL-6/JAK/STAT3信号通路。我们发现，虽然INCB039110抑制IL-6/JAK/STAT3信号通路对传统2D单层细胞培养条件下生长的胰腺细胞系的增殖没有影响，但该抑制剂在3d球形培养系统中对胰腺肿瘤细胞系Hs700T和BxPC-3表现出生长抑制活性。重要的是，在这些细胞中添加刺激JAK/STAT3信号通路的细胞因子可显著促进球状体的生长，而INCB039110可完全逆转这一过程。此外，在联合研究中，JAK1抑制增强了吉西他滨对Hs700T和BxPC-3球体的细胞毒性。另一种新型Jak1选择性抑制剂INCB052793也证实了这一结果，该抑制剂目前正处于晚期恶性肿瘤患者的1期临床试验中。[2]

\n\n基于这些体外结果，我们还在HOCl诱导的ILD模型中，探索了鲁索替尼对JAK2/1抑制剂在体内对小鼠巨噬细胞的影响，该模型模拟了硬皮病相关的ILD。在本模型中，我们发现鲁索替尼显著抑制了促炎性M1标志物（TNFα、CXCL10、NOS2）和促纤维化M2标志物（Arg1和Chi3L3）的上调。这些结果与皮肤和肺部受累的改善相关。总的来说，我们的结果表明，JAK2/1抑制剂的抗炎和抗纤维化联合特性可能与靶向自身免疫性和炎症性肺部疾病中的肺巨噬细胞相关，而目前尚无有效的疾病修饰药物。[2]

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\n\n伊他替尼调节小鼠CRS模型[3]
\n通过静脉注射（IV）刀豆蛋白A（ConA；20 mg/kg）或100 μg抗CD3ε抗体（克隆145-2C11）在BALB/c小鼠中诱导CRS。相应的动物在 CRS 诱导前 60 分钟（预防性）或 CRS 诱导后 30 分钟（治疗性）口服 60 或 120 mg/kg 的伊他替尼。ConA 或抗 CD3 注射两小时后，处死小鼠，并将血液收集到 K2EDTA 抗凝管中用于细胞因子测定。\n

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\n\n活化巨噬细胞模型 [3]
\n从 6 至 8 周龄的 C57BL-6 雌性小鼠中取出脾脏，并进行机械分离。将脾细胞培养于添加 10% 胎牛血清和巨噬细胞集落刺激因子的 RPMI 培养基中。在第6天，细胞用伊他替尼（Itacitinib）处理，然后在第7天用5 ng/mL脂多糖（LPS）处理。第二天，收集上清液并按以下所述方法测定细胞因子。6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠预防性地口服给予载体或60或120 mg/kg的伊他替尼，每日两次（bid），连续3天。然后，小鼠接受腹腔注射LPS（每只5 μg）。注射两小时后，处死小鼠，并向腹腔内注射3 mL无菌生理盐水进行腹腔灌洗。后续细胞因子测定按如下所述进行。\n

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\n\nOT-1 T 细胞扩增和抗肿瘤活性[3]
\nOT-1 品系转基因小鼠携带针对 OVA257–264 肽段 (SIINFEKL) 的 TCR VαVβ5，且该 TCR 仅限于 H2-Kb。使用 Naïve CD8a+ T 细胞分离试剂盒，通过阴性选择从 OT-1 小鼠脾脏中分离出幼稚 OT-1 CD8 细胞。

\n\n为测定 OT-1 CD8+ 细胞扩增，将细胞用 CFSE (2 μM) 标记，并以 5 × 106 个细胞/mL 的浓度重悬于完全 RPMI 培养基中，培养基中含有 20 IU IL-2、2 μg/mL SIINFEKL 肽段以及浓度递增的伊他替尼 (Itacitinib)，浓度范围为 0 至 1000 nM。三至五天后，收集OT-1细胞，用APC-抗CD8抗体染色，并通过流式细胞术测量不同条件下羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）的相对荧光强度来计算细胞分裂次数。\n

\n为了研究伊他替尼对CD8 OT-1细胞抗肿瘤活性的影响，将0.5 × 10⁶个表达OVA的EG7肿瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠右侧剃毛的腹部。第7天，对相应小鼠进行每日两次口服伊他替尼，剂量为60或120 mg/kg；第10天，对相应小鼠进行尾静脉注射5 × 10⁶个未处理的OT-1 CD8细胞。每周至少三次使用数字游标卡尺测量肿瘤在两个垂直轴上的大小。肿瘤体积采用以下公式计算：\n
\nV=(W⁢2×L)/2，其中 V 为肿瘤体积，W 为肿瘤宽度，L 为肿瘤长度。\n

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\n\n抗肿瘤活性（Nalm6 模型）[3]
\n为了研究 JAK1 抑制是否影响 CAR T 细胞的抗肿瘤作用，我们采用了先前报道的异种移植模型。简而言之，将 2.5 × 10⁶ 个表达荧光素酶的 Nalm6 急性淋巴细胞白血病细胞经尾静脉注射到 6 至 10 周龄的免疫缺陷型 NOD-SCID γc−/− (NSG) 小鼠体内。相应的动物在肿瘤接种后第 1 天开始，每 10 天口服 120 mg/kg 的伊他替尼（每日两次）。随后将小鼠随机分组，分别于第4天经静脉注射3 × 10⁶个CAR T细胞、未转导细胞或载体进行过继转移。每周一次，使用Xenogen IVIS Spectrum系统对麻醉小鼠进行成像。小鼠腹腔注射D-荧光素（150 mg/kg）。使用Living Image 4.4软件，通过在小鼠周围绘制面积相同的矩形（从头部延伸至尾长50%）来量化总荧光通量。对每张图像分别扣除背景生物发光。每日监测动物，并比较各组的存活率。\n

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\n\n\n大鼠佐剂诱导关节炎模型[4]
\n疾病的诱导方法如前所述（Fridman，2010）。简而言之，将100 μl完全弗氏佐剂乳剂注射到Lewis大鼠尾根部。通过目测观察，对每只大鼠的爪子进行评分，评分范围为0-3分（0分=正常；1分=趾部发红和轻微肿胀；2分=趾部和/或爪子中度肿胀；3分=趾部和/或爪子严重肿胀）。将每只动物的爪子评分相加，记录为四只爪子评分的总和，并报告各组评分的平均值。在出现炎症性关节肿胀后（通常在佐剂注射后2周发生），将动物随机分配到不同的治疗组。实验结束时，对后爪进行组织学分析。用福尔马林固定的后爪/踝关节组织，用5%甲酸脱钙，石蜡包埋，沿矢状面切片，然后染色。所有组织均由经认证的兽医病理学家进行显微镜检查。佐剂性关节炎踝关节的评分标准为0-7分，评分指标包括以下四个参数（炎症、骨吸收、血管翳浸润和软骨损伤）。每个关节还计算了包含所有四个组织学参数的总分（见补充表1）。

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\n\n小鼠恶唑酮诱导结肠炎模型[4]
\n雄性BALB/c小鼠（BALB/cAnNCrl品系#028）购自商业渠道。第0天，将恶唑酮（150 μL，3%丙酮/橄榄油混合液，4:1 v/v）涂抹于预先剃毛的小鼠背部进行致敏。第5天，再次用恶唑酮致敏。小鼠在直肠内给予恶唑酮激发前禁食。通过结肠内灌注恶唑酮溶液（1 mg溶于0.1 ml 40%乙醇）诱导远端结肠炎，之后将动物竖直放置30秒，以确保溶液留在结肠内。假手术对照组小鼠仅灌注0.1 ml 40%乙醇。腹泻程度采用0-3分制进行量化（0 = 正常；1 = 软便但仍成形；2 = 非常软便；3 = 腹泻）。粪便隐血采用S-Y型隐血试纸进行检测，结果采用0-3分制（0 = 阴性；1 = 阳性；2 = 可见血迹；3 = 直肠出血）。第8天，对安乐死的小鼠测量结肠长度和重量。此外，打开腹腔后，观察结肠与其他器官之间的粘连情况以及是否存在结肠溃疡。宏观评分采用0-9分制。标准化结肠重量代表相对于假手术对照组小鼠的组织增加量。\n

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\n\n白细胞介素-10基因敲除（IL-10）自发性结肠炎模型[4]
\nBALB/c品系背景的雌性IL-10纯合基因敲除小鼠由Taconic USA公司提供。伊他替尼治疗从6周龄开始。腹泻程度采用0至3分制进行量化（0 = 正常；1 = 稀便但仍成形；2 = 非常稀便；3 = 腹泻）。研究结束时，对结肠长度和重量进行量化。组织病理学检查由经认证的兽医病理学家完成。疾病病理评分采用 0 至 12 分制，炎症浸润、糜烂/溃疡和全层炎症的大小和频率权重相同（0 分 - 正常，3 分 - 广泛）。

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\n\n小鼠三硝基苯磺酸 (TNBS) 诱导结肠炎模型 [4]
\n雄性 BALB/c (BALB/cAnNCrl 品系 # 028) 小鼠购自查尔斯河实验室 (Charles River Laboratories)。一组动物接受了结肠插管术。简而言之，动物在手术前禁食 4 小时。在腹部正中线做切口，将导管插入结肠，穿过腹壁，经皮下隧道到达背部切口，在肩胛区域引出并固定。手术在实验开始前至少 10 天进行。通过结肠内灌注TNBS（1 mg溶于0.1 ml 50%乙醇）诱导远端结肠炎。伊他替尼通过灌胃或结肠内插管给药。在TNBS致敏后第3-5天，采用0至3分制对腹泻进行量化（0 = 正常；1 = 软但仍成形；2 = 非常软；3 = 腹泻）。

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\n\n小鼠急性移植物抗宿主病（GvHD）模型[4]
\n雄性C57BL/6和BALB/c小鼠购自商业渠道。 BALB/c 小鼠于第 -1 天接受单次 8 Gy 全身照射，随后于第 0 天静脉注射脾细胞和去除 T 细胞的骨髓细胞混合物。动物接受来自 BALB/c 小鼠（同基因对照）或 C57BL/6 小鼠的细胞移植以诱导移植物抗宿主病 (GvHD)，并通过流式细胞术分析每周两次经眼眶后静脉丛取血收集的细胞来监测移植情况。伊他替尼于第 -3 天（预防性）或第 14 天（治疗性）开始，每日两次通过灌胃给药。每日称量动物体重，并根据体重减轻、姿势、活动、毛发质地和皮肤完整性，采用 0 至 2 分的评分标准（0 = 正常，1 = 中度，2 = 重度）对 GvHD 进展进行评分（见补充表 4）。将结肠样本切成 5 μm 厚的切片，并用 CD4+、CD8+、CD3+/pSTAT+ 和总 pSTAT3+ 进行染色。使用 Aperio AT2 扫描仪对切片进行数字化扫描，并使用 Visiopharm 软件进行图像分析。采用 ELISA 法定量组织匀浆中 IL-1β、TNFα 和 IFNγ 的浓度。\n

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不适用

小鼠人胰腺异种移植模型

伊他替尼在小鼠体内多次口服给药后的药代动力学研究[4]
在雌性BALB/c小鼠中，分别以20、40和80 mg/kg的剂量每日两次口服给药，连续12天，测定了伊他替尼的药代动力学（图4）。平均血浆峰浓度（Cmax）和曲线下面积值随剂量增加而增加，但并非呈比例关系。

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药代动力学研究[4]
在市售雌性BALB/c小鼠（BALB/cAnNCrl品系#028，查尔斯河实验室）中测定了伊他替尼的口服吸收情况。伊他替尼溶于0.5%甲基纤维素溶液中，以20、40或80 mg/kg的剂量每日两次灌胃给药，连续12天。在最后一次给药后1、2、8和16小时采集眼眶后静脉丛血样。所有血液样本均使用EDTA作为抗凝剂采集，并离心以获得血浆样本。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），使用Sciex API-4000质谱仪的正离子接口和多反应监测（MRM）模式测定血浆中itacitinib的浓度。使用WinNonlin® 5.0.1版软件，通过标准非房室模型方法，利用血浆浓度-时间数据确定药代动力学参数。本文介绍了一项3期随机、双盲研究的群体药代动力学（PopPK）分析和暴露-反应分析结果，该研究比较了itacitinib联合糖皮质激素与安慰剂联合糖皮质激素治疗aGVHD的疗效。分析内容包括主要疗效终点——急性移植物抗宿主病（aGVHD）第28天的应答率——以及部分安全性指标（血小板减少症、高甘油三酯血症和巨细胞病毒感染的发生率）。 PopPK 数据集包含来自急性移植物抗宿主病 (aGVHD) 患者的少量数据以及来自健康志愿者的部分富集数据。结构模型为二室模型，具有一级消除动力学和剂量依赖性非线性吸收动力学，以及具有滞后时间的双一级吸收途径。强效细胞色素 P450 (CYP) 3A 抑制剂的联合用药、中度肾功能损害以及受试者人群（健康志愿者与 aGVHD 患者）是表观清除率的协变量。受试者人群也是表观室间清除率和次级吸收室滞后时间的协变量。强效 CYP3A 抑制剂联合用药使表观清除率降低了 42%。模拟结果支持以下与强效 CYP3A 抑制剂联合用药时的剂量减少方案：每日一次 300 mg 减少至每日一次 200 mg，每日一次 400 mg 减少至每日一次 300 mg，以及每日一次 600 mg 减少至每日一次 400 mg。根据其他协变量在模型中保留时的影响程度，不建议对其进行剂量调整。采用线性逻辑回归模型分析了伊他替尼暴露量与第28天aGVHD缓解概率之间的暴露-反应关系。伊他替尼暴露量和aGVHD风险状态均为缓解的显著预测因子。伊他替尼暴露量与血小板减少症、高甘油三酯血症或巨细胞病毒感染之间无相关性。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36601737/

安全性和耐受性[1]
每日两次100 mg组的INCB039110中位（范围）暴露时间为102（23–519）天，每日两次200 mg组为268（22–535）天，每日一次600 mg组为197（58–343）天。表2列出了最常见的非血液学不良事件（无论其因果关系如何）；大多数为1级或2级。发生于多例患者的≥3级非血液学不良事件包括：肺炎、呼吸困难和高血压（各3例），以及充血性心力衰竭、直肠出血、乏力、发热、尿路感染、高钾血症、碱性磷酸酶升高和急性肾功能衰竭（各2例）。这25例不良事件发生在18名不同的患者中。虽然感染较为常见（44.8%），其中19.5%的患者发生上呼吸道感染（见在线补充表S1），但大多数感染为轻度或中度，仅有4例（支气管炎、毛囊炎、单纯疱疹和尿路感染各1例）被研究者认为与治疗相关。这4例均为2级，不属于严重不良事件，且均在未改变研究治疗方案的情况下痊愈。研究期间有2名患者死亡（均在每日一次600 mg剂量组）：一名62岁患者在接受治疗约5个月后死于肺炎，另一名61岁患者在接受治疗近4个月后死于不明原因，可能与疾病进展有关。研究者认为这两例死亡均与治疗无关。

[1]. Primary analysis of a phase II open-label trial of INCB039110, a selective JAK1 inhibitor, in patients with myelofibrosis. Haematologica. 2017 Feb;102(2):327-335.

[2]. Combined Anti-Fibrotic and Anti-Inflammatory Properties of JAK-inhibitors on Macrophages in Vitro and in Vivo: Perspectives for Scleroderma-Associated Interstitial Lung Disease. Biochem Pharmacol. 2020 Jun 17;114103.

[3]. Itacitinib (INCB039110), a JAK1 inhibitor, Reduces Cytokines Associated with Cytokine Release Syndrome Induced by CAR T-Cell Therapy. Clin Cancer Res. 2020 Sep 30;26(23):6299–6309.

[4]. Preclinical characterization of itacitinib (INCB039110), a novel selective inhibitor of JAK1, for the treatment of inflammatory diseases. Eur J Pharmacol. 2020 Oct 15:885:173505.

伊他替尼己二酸盐是伊他替尼的己二酸盐形式，是一种口服生物利用度高的Janus激酶1 (JAK1)抑制剂，具有潜在的抗肿瘤和免疫调节活性。口服后，伊他替尼选择性抑制JAK-1，从而抑制信号转导和转录激活因子 (STAT) 蛋白的磷酸化以及其他细胞因子（包括白细胞介素-23 (IL-23) 和白细胞介素-6 (IL-6)）诱导的促炎因子的产生。JAK-STAT通路在许多细胞因子和生长因子的信号传导中起着关键作用，并参与细胞增殖、生长、造血和免疫反应； JAK激酶在炎症性疾病、骨髓增生性疾病和多种恶性肿瘤中可能上调。

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伊他替尼已用于黑色素瘤、癌、转移性癌症、子宫内膜癌和B细胞恶性肿瘤等多种疾病的治疗试验。
伊他替尼是一种口服生物利用度高的Janus激酶1 (JAK1)抑制剂，具有潜在的抗肿瘤和免疫调节活性。口服后，伊他替尼选择性抑制JAK-1，从而抑制信号转导和转录激活因子 (STAT) 蛋白的磷酸化以及其他细胞因子（包括白细胞介素-23 (IL-23) 和白细胞介素-6 (IL-6)）诱导的促炎因子的产生。JAK-STAT通路在许多细胞因子和生长因子的信号传导中起着关键作用，并参与细胞增殖、生长、造血和免疫反应； JAK激酶在炎症性疾病、骨髓增生性疾病和多种恶性肿瘤中可能上调。

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药物适应症
治疗急性移植物抗宿主病。

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Janus激酶（JAK）抑制剂（也称为JAK抑制剂）是一类靶向JAK不同亚型（JAK1、JAK2、JAK3和/或酪氨酸激酶2 (Tyk2)）的小分子药物。它们发挥抗炎作用，部分原因在于其能够调节促炎性M1巨噬细胞的活化状态。然而，JAK抑制剂对更广泛的巨噬细胞活化状态的确切影响仍有待确定，尤其是在促炎性M1巨噬细胞和促纤维化M2巨噬细胞同时活化的疾病中。在自身免疫性肺纤维化（例如硬皮病相关间质性肺病 (ILD)）中，M1 和 M2 巨噬细胞发挥着关键的致病作用，这种情况尤为突出。本研究直接比较了三种 JAK 抑制剂（鲁索替尼（JAK2/1 抑制剂）、托法替尼（JAK3/2 抑制剂）和伊他替尼（JAK1 抑制剂））对五种不同激活状态的原代人单核细胞来源巨噬细胞 (MDM) 的抗炎和抗纤维化作用。这三种 JAK 抑制剂对巨噬细胞具有抗炎特性，表现为关键极化标志物（CD86、MHCII、TLR4）表达下调，以及在 IFNγ 和 LPS 联合激活或单独 IFNγ 激活的 M1 巨噬细胞中关键促炎细胞因子（CXCL10、IL-6 和 TNFα）分泌减少。我们还强调，这些JAK抑制剂可以限制IL-4和IL-13诱导的巨噬细胞M2a活化，这主要表现为M2a相关表面标志物CD206的下调和CCL18分泌的减少。此外，这些JAK抑制剂还能降低IL-10和地塞米松（M2c+dex）或单独IL-10（M2c MDM）诱导的替代活化巨噬细胞中CXCL13、MARCO和SOCS3等标志物的表达。对于所有极化状态，在1 μM或0.1 μM浓度下，对JAK2具有抑制作用的JAK抑制剂均表现出最强的抑制效果。基于这些体外实验结果，我们还在HOCl诱导的ILD模型（该模型模拟硬皮病相关ILD）中，探索了鲁索替尼对JAK2/1抑制作用对小鼠巨噬细胞体内的影响。在本模型中，我们发现鲁索替尼显著抑制了促炎性M1标志物（TNFα、CXCL10、NOS2）和促纤维化M2标志物（Arg1和Chi3L3）的上调。这些结果与皮肤和肺部受累的改善相关。总体而言，我们的结果表明，JAK2/1抑制剂的抗炎和抗纤维化联合特性可能与靶向自身免疫性和炎症性肺部疾病中的肺巨噬细胞相关，而这些疾病目前尚无有效的疾病修饰药物。[2]

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目的：
表达嵌合抗原受体的T细胞（CAR-T细胞）是一种很有前景的癌症免疫疗法。此类靶向疗法已在B细胞白血病和淋巴瘤患者中显示出长期无复发生存期。然而，细胞因子释放综合征（CRS）是CAR-T细胞疗法中常见的一种严重且可能危及生命的副作用。细胞因子释放综合征 (CRS) 表现为由过量炎症细胞因子（包括干扰素-γ 和白细胞介素-6）释放驱动的快速（过度）免疫反应。
实验设计：
已知许多与 CRS 相关的细胞因子通过 Janus 激酶-信号转导和转录激活因子 (JAK-STAT) 通路传递信号。本研究旨在探讨阻断 JAK 通路信号对 CAR-T 细胞增殖、抗肿瘤活性以及细胞因子水平的影响，并分别在体外和体内模型中进行研究。
结果：
我们发现，强效选择性 JAK1 抑制剂伊他西替尼能够显著且剂量依赖性地降低多种与 CRS 相关的细胞因子水平，并在多个体外和体内模型中得到验证。重要的是，我们还报告说，在模拟人类 JAK1 药理抑制的临床相关剂量下，itacitinib 并未显著抑制三种不同的人类 CAR T 细胞构建体（GD2、EGFR 和 CD19）的增殖或抗肿瘤杀伤能力。最后，在体内模型中，过继转移至CD19+荷瘤免疫缺陷动物体内的CD19-CAR T细胞的抗肿瘤活性并未因口服itacitinib治疗而减弱。
结论：
综上所述，这些数据表明itacitinib具有作为预防CAR T细胞诱导的细胞因子释放综合征（CRS）的药物的潜力，目前已启动itacitinib预防CAR T细胞治疗诱导的CRS的II期临床试验（NCT04071366）。[3]

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Janus激酶（JAK）家族的药理学调控已在治疗炎症和造血系统疾病方面取得了具有临床意义的疗效。目前正在对几种JAK1选择性化合物进行临床研究，以确定其抗炎潜力。我们利用重组酶和原代人淋巴细胞评估了itacitinib (INCB039110) 的JAK1特异性，并研究了其对信号转导和转录激活因子 (STAT) 信号通路的抑制作用。随后，我们利用啮齿动物关节炎和炎症性肠病模型，阐明了口服itacitinib对炎症发病机制的疗效。与JAK家族其他成员相比，itacitinib是一种强效且选择性的JAK1抑制剂。在啮齿动物中，口服itacitinib后，其药代动力学暴露量呈剂量依赖性，且与STAT3药效通路抑制高度相关。itacitinib以剂量依赖的方式改善了已建立的实验性关节炎的症状和病理改变。此外，itacitinib在三种不同的炎症性肠病小鼠模型中均能有效延缓疾病发作、减轻症状严重程度并加速康复。低剂量伊他替尼经导管直接注入结肠，对TNBS诱导的结肠炎疗效显著，且全身药物暴露量极低，提示局部JAK1抑制足以改善疾病症状。在急性移植物抗宿主病（GvHD）模型中，伊他替尼治疗可迅速降低淋巴细胞和靶组织内的炎症标志物水平，从而显著改善疾病症状。这是首篇报道伊他替尼作为一种强效且选择性的JAK1抑制剂，在多种临床前疾病模型中均表现出抗炎活性的论文。这些数据为正在进行的针对特定GvHD患者群体的伊他替尼临床试验提供了科学依据。[4]

C₃₂H₃₃F₄N₉O₅

699.66

699.254

C, 54.93; H, 4.75; F, 10.86; N, 18.02; O, 11.43

1334302-63-4

Itacitinib;1334298-90-6

67390313

White to light yellow solid powder

194

3

15

10

50

1090

0

CEGWJIQFBNFMHQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C26H23F4N9O.C6H10O4/c27-20-18(1-7-32-22(20)26(28,29)30)24(40)37-9-3-17(4-10-37)38-13-25(14-38,5-6-31)39-12-16(11-36-39)21-19-2-8-33-23(19)35-15-34-21;7-5(8)3-1-2-4-6(9)10/h1-2,7-8,11-12,15,17H,3-5,9-10,13-14H2,(H,33,34,35);1-4H2,(H,7,8)(H,9,10)

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.57 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.57 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.57 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。