JBSNF-000088   中文名称: 6-甲氧基-3-吡啶羧胺

human NNMT (IC50 = 1.8 µM); monkey NNMT (IC50 = 2.8 µM); mouse NNMT (IC50 = 5.0 µM)

JBSNF-000088（6-甲酰胺烟酰胺）针对 U2OS 或分泌型 3T3L1 细胞的 IC50 值分别为 1.6 μM 和 6.3 μM [1]。

JBSNF-000088（6-甲酰胺烟酰胺）（50 毫克/公斤；4 周粉末功效）在第 21 天表现出统计显着的体重减轻百分比，并导致糖尿病血糖显着降低 [1] JBSNF -000088（50 毫克/公斤；4 周粉末功效）临界强饲法；每天两次，持续 4 周）导致终点耐受性显着改善，并在第 28 天使终点耐受性正常化 [1]。 JBSNF-000088（1 mg/kg；静脉拓扑；持续时间 4 小时）在三个重复周期中产生 21 mL/min·kg 和 0.7 L/kg 的低组织清除率，静脉注射后半衰期非常短（ 0.5 )[1 JBSNF-000088（10 mg/kg；灌胃；4 小时持续时间）导致 Cmax 为 3568 ng/mL，Tmax 值为 0.5 小时，表明快速腔内吸收和破坏，半衰期为0.4小时灌胃。

基于荧光的NNMT酶分析[1]
用荧光酶法测定NNMT活性。NNMT反应中形成的MNA在KOH和甲酸的存在下与苯乙酮反应，形成荧光产物2,7-萘啶JBSNF-000088使用人、小鼠和猴子NNMT酶进行筛选。不同浓度的抑制剂与酶在室温下预孵育30分钟。通过在37°C下加入SAM和烟酰胺混合物（分别用于人、小鼠和猴子NNMT测定的7µM、20µM、8µM SAM和6µM、二十µM、9µM烟酰胺）60分钟来引发反应。最终的测定反应混合物包含100mM Tris-Hcl pH 7.5的缓冲液、0.04%BSA、2mM二硫苏糖醇和1%DMSO。在孵育结束时，通过加入乙醇：苯乙酮混合物（75%乙醇：25%苯乙酮）和用50%乙醇制备的5M氢氧化钾来停止反应。将反应物温育15分钟，然后加入100µL 60%甲酸。将反应物在室温下再温育60分钟。荧光产物2，7-萘啶使用Tecan阅读器在375 nm处激发，430 nm处发射进行测量。IC50值是通过使用GraphPad Prism软件使用四参数S形剂量反应拟合抑制曲线（抑制百分比与抑制剂浓度）来确定的。

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使用LC-MS/MS检测的人NNMT酶测定[1]
使用适合目的的LC-MS/MS方法测量人NNMT反应中形成的MNA。将不同浓度的抑制剂与5ng/孔的人NNMT酶在室温下预孵育30分钟。通过分别加入7µM和20µM的SAM和烟酰胺混合物引发反应，并在37°C下孵育60分钟。最终的测定反应混合物包含100mM Tris-Hcl pH 7.5的缓冲液、0.04%BSA、2mM二硫苏糖醇和1%DMSO。向孔中加入100µL含内标d4-MNA（20ng/mL）的乙腈，并在室温下孵育10分钟。向孔中加入70µL高压灭菌水并轻轻混合。将该板在室温下以5000g离心10分钟。将150µL上清液转移到96孔板中，并通过LC-MS/MS进行分析。通过使用四参数S形剂量反应图垫棱镜拟合抑制曲线（抑制百分比与抑制剂浓度）来确定IC50值。

基于细胞的U2OS检测[1]
人骨骨肉瘤（U2OS）细胞系购自ATCC，并在含有10%热灭活胎牛血清和penstrep（过滤器灭菌）的DMEM F-12生长培养基中在37°C和5%CO2下维持。计数细胞，将每孔10K细胞接种到96孔细胞培养板中，然后在37°C、5%CO2和95%湿度下孵育24小时。将细胞培养基替换为100µl不同浓度的培养基/抑制剂混合物，并在37°C、5%CO2和95%湿度下孵育24小时。移除培养基/化合物混合物并洗涤两次，然后向孔中加入100µL含乙腈的内标d4-MNA（20ng/mL）。将该板在5000g下离心10分钟。将150µL上清液转移到96孔板（Costar 3364）中，并通过LC-MS/MS进行分析。通过使用四参数S形剂量反应图垫棱镜拟合抑制曲线（抑制百分比与抑制剂浓度）来确定IC50值。

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基于细胞的3T3L1检测[1]
3T3-L1是一种来源于小鼠3T3细胞的细胞系，从ATCC获得，并在含有10%热灭活胎牛血清和5%CO2的DMEM高糖生长培养基中在37°C下保持。计数细胞，将每孔5K细胞接种到96孔细胞培养板中，在37°C、5%CO2、95%湿度下孵育，直至达到100%融合。融合24小时后，用含有（500μM，IBMX+1μM DEXA+1μg/ml胰岛素）的分化诱导培养基替换培养基，并隔日更换培养基。细胞分化长达14天：三天后，用补充了10%FBS和1µg/ml胰岛素的DMEM代替诱导培养基。从第5天开始，细胞在常规生长培养基中培养。
分化后，细胞与化合物在37°C、5%CO2和95%湿度下孵育24小时。用DPBS洗涤细胞，并将100µl含内标d4 MNA（终浓度20ng/mL）的乙腈加入孔中。使用100%乙腈从细胞中提取MNA。将平板在室温下孵育20分钟，加入100µL高压水并轻轻混合。将该板在5000g下离心10分钟。将上清液转移到96孔板（Costar 3364）中，并提交LCMS/MS。通过使用四参数S形剂量反应图垫棱柱拟合抑制曲线（抑制百分比与抑制剂浓度）来确定IC50值。

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细胞毒性试验[1]
人肝癌癌症（HepG2）细胞系从ATCC获得，并在含有10%HI FBS和1%Pen-Strep（过滤灭菌）的DMEM Glut Max生长培养基中，在37°C、含5%CO2的培养箱中维持。当细胞在细胞培养瓶中80%融合时，用0.25%胰蛋白酶分离细胞。计数细胞，将每孔50 K细胞接种到96孔不透明壁多孔板中，然后在37°C、5%CO2、95%湿度下孵育过夜。将细胞培养基替换为100µL培养基/抑制剂混合物（含0.5%DMSO）和对照，并在37°C、5%CO2、95%湿度下孵育48或72小时。将最大对照样品（与0.5%DMSO完全反应）和最小对照样品（和已知抑制剂完全反应）Cell Titer Glo®试剂以1:1的比例添加到所有含有培养基的孔中（例如，将100µL试剂添加到96孔板的100µL含有细胞的培养基中）。将内容物在轨道振荡器上混合2分钟以诱导细胞裂解。然后将该板在室温下孵育10分钟以稳定发光信号。发光记录在Victor或Top Count发光计数器中。计算DMSO对照的细胞存活率。

动物/疾病模型：高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠[1]
剂量：50 mg/kg
给药途径：口服给药，持续4周；阻断生物利用度约为40%[1]。每日两次（灌胃）给药，持续4周
实验结果：口服给药在第21天显示出显著的体重减轻（%）和餐后血糖显著降低。第28天，口服葡萄糖耐量出现统计学意义上的显著改善，而灌胃给药使其恢复正常。

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动物/疾病模型：C57BL/6小鼠[1]
剂量：1 mg/kg（静脉（iv）给药）； 10 mg/kg（口服灌胃）（药代动力学/PK/PK 研究）
给药途径：静脉注射（iv）和口服灌胃（po）；4 小时
实验结果：静脉注射（iv）后，血浆清除率低至 21 mL/min·kg，稳态分布容积为 0.7 L/kg，血浆半衰期极短，为 0.5 小时。结果表明，Cmax 为 3568 ng/mL，Tmax 为 0.5 小时，表明 ra\n

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\n\n疗效研究[1]
\n瘦对照组 + 载体组和高脂饮食组 + 载体对照组（G1 和 G2）小鼠均给予载体。将HFD + JBSNF-000088（50 mg kg−1，口服，每日两次）的剂量方案，以5 mL kg−1体重的剂量体积，灌胃给予G3小鼠。ob/ob小鼠和db/db小鼠的研究也采用了类似的给药方案。每只动物的给药体积根据研究期间最近一次记录的体重计算。在整个研究期间，观察所有动物的死亡率/发病率。每天对动物进行笼边观察，记录可见的临床症状。每周记录两次每只动物的体重。\n

\n研究开始时，ob/ob小鼠为12周龄，db/db小鼠为8周龄。DIO小鼠为20周龄。在每项研究中，非糖尿病瘦鼠作为对照组，接受赋形剂（0.5% w/v HEC 和 0.5% v/v Tween 80）处理；肥胖或糖尿病小鼠根据体重和非空腹血糖水平随机分为两组，分别接受赋形剂（0.5% w/v HEC 和 0.5% v/v Tween 80）或 JBSNF-000088（50 mg kg⁻¹，口服，每日两次，持续 30 天）处理。研究期间，每周两次记录每只动物的体重、食物和饮水消耗量。在 DIO、ob/ob 和 db/db 疗效研究中，每组均包含 10 只动物。动物以每笼 5 只的方式饲养，并在研究期间每周两次记录每只动物的体重、食物和饮水消耗量。食物消耗量以累积能量摄入量表示。在治疗后第 7、14 和 21 天测量餐后血糖和胰岛素水平。\n

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\n口服葡萄糖耐量试验 (OGTT)[1]
\n在治疗后第 28 天，对 DIO 小鼠和 ob/ob 小鼠进行口服葡萄糖耐量试验 (OGTT)，并在治疗后第 26 天对 db/db 小鼠进行 OGTT，以评估 JBSNF-000088 对葡萄糖耐量的影响。DIO 和 ob/ob 小鼠禁食 4 小时后口服葡萄糖 (2 g kg−1)，而 db/db 小鼠禁食 16 小时后口服葡萄糖 (1 g kg−1)。在葡萄糖给药前一小时，小鼠经口给予赋形剂或JBSNF-000088，剂量为50 mg kg−1。\n

\n分别于给药前（-60分钟）、给药前（0分钟）以及给药后15、30、60、120和180分钟采集尾部采血进行血糖测定。在给药后0分钟和15分钟采集血液样本用于测定血浆胰岛素水平。HOMA-IR的计算公式为：[HOMA-IR = (空腹血浆胰岛素，ng ml−1 × 空腹血糖，mmol l−1) / 22.5]。在最后一次血糖检测后，动物重新喂食，并继续给药直至第30天终止。\n

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\n研究终止[1]
\n在治疗的第30天，动物禁食4小时，并用二氧化碳窒息法处死。处死前1小时，小鼠经口给予赋形剂或JBSNF-000088，50 mg kg−1。从每只动物采集血液和组织样本（肝脏、皮下脂肪、肾脏脂肪、附睾脂肪和肠系膜脂肪）。血浆和组织样本储存在−80 °C直至分析。\n

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\n\n使用野生型和NNMT KO动物进行DIO研究[1]
\n使用VelociGene®技术31构建了C57BL/6背景的NNMT fl/fl小鼠。在包含基因启动子的转录起始位点上游 1.6 kb 处放置了一个 loxP 位点。在 NNMT 外显子 1 下游 212 bp 处插入了一个 loxP-Frt-Hyg-Frt 盒。loxP 盒的坐标为 chr9:48,412,881–48,414,698。将 NNMT^fl/fl 小鼠与 ZP3-cre 小鼠（C57BL/6，Jackson Laboratories）杂交，以获得全身 NNMT 敲除小鼠。DIO 小鼠研究符合德国动物保护法以及国际动物福利法规和规则。将雌性野生型和 NNMT 敲除小鼠喂食高脂饮食（Ssniff HFD 调整 TD.97366）18 周，然后分别给予
（50 mg/kg，每日两次，灌胃）或载体处理 4 周（每组 n = 9–10）。在整个研究过程中，小鼠饲养于温度为23℃、光暗周期为12小时：12小时（上午6:00开灯）的环境控制室中，并可自由摄取食物和水。在治疗第25天进行口服葡萄糖耐量试验：动物禁食过夜。在口服葡萄糖推注（2 g kg⁻¹）前60分钟，通过灌胃给予JBSNF-000088（50 mg kg⁻¹）或载体（0.5% HEC + 0.5% Tween80）。为了进行血糖分析，在葡萄糖推注后15、30、60和120分钟，从清醒小鼠的尾部采集血液样本。

[1]. A small molecule inhibitor of Nicotinamide N-methyltransferase for the treatment of metabolic disorders. Sci Rep. 2018 Feb 26;8(1):3660.

烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）是一种胞质酶，催化辅因子S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）上的甲基转移到底物烟酰胺（NA）上，生成1-甲基烟酰胺（MNA）。NNMT表达和MNA浓度升高与肥胖和2型糖尿病相关。本文报道了一种NA小分子类似物JBSNF-000088，它能抑制NNMT活性，降低MNA水平，并在代谢疾病动物模型中促进胰岛素敏感性、调节血糖并减轻体重。在高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠中，JBSNF-000088治疗可降低体重，改善胰岛素敏感性，并将葡萄糖耐量恢复至瘦小鼠水平。在HFD喂养的NNMT敲除小鼠中未观察到这些作用，证实了JBSNF-000088的特异性。该化合物也能改善ob/ob和db/db小鼠的葡萄糖代谢，尽管程度较轻，且未引起体重减轻。共晶体结构分析显示，JBSNF-000088的N-甲基化产物与NNMT蛋白结合。在接受JBSNF-000088治疗的小鼠血浆中也检测到了该N-甲基化产物。因此，JBSNF-000088可能作为一种慢周转底物类似物发挥作用，从而驱动观察到的代谢益处。[1]

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我们尝试利用X射线晶体衍射技术，通过小鼠和人NNMT蛋白来确定JBSNF-000088的结合模式，结果表明JBSNF-000088被甲基化，并且甲基化的JBSNF-000088与两种蛋白的活性底物结合位点结合，同时辅因子SAM转化为去甲基化形式（SAH）。这支持了JBSNF-000088可能作为底物类似物发挥作用的假设，它与天然底物NA竞争，并抑制NA与酶活性位点的结合。一旦与活性位点结合，SAM上的甲基转移可导致N-甲基化JBSNF-000088的形成。有趣的是，在服用未甲基化小分子（JBSNF-000088）的动物的循环血浆中也发现了N-甲基化产物，尽管含量很低。后者可能是由于JBSNF-000088是NNMT的强效结合剂，但作为底物活性较弱，导致其周转缓慢。然而，在NNMT共晶体中，由于酶浓度较高，可以清晰地检测到N-甲基化化合物的形成。 JBSNF-000088 的 N-甲基化产物本身对 NNMT 的抑制作用较弱，IC50 值 > 30 µM（30 µM 时抑制率为 20%）。因此，JBSNF-000088 可能作为一种竞争性底物类似物发挥作用，其转化为 N-甲基化产物的速度非常缓慢。据我们所知，这是首个利用 NNMT 小分子调节剂在代谢疾病动物模型中验证其药理学益处的概念验证研究。我们的研究为开发 NNMT 小分子调节剂并用于代谢紊乱患者的临床试验开辟了可能性。[1]

C7H8N2O2

152.15

152.059

C, 55.26; H, 5.30; N, 18.41; O, 21.03

7150-23-4

7150-23-4

250810

White to light yellow solid powder

1.213g/cm3

301.6ºC at 760mmHg

136.2ºC

1.55

0.889

65.21

1

3

2

11

149

0

O(C([H])([H])[H])C1C([H])=C([H])C(C(N([H])[H])=O)=C([H])N=1

KXDSMFBEVSJYRF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C7H8N2O2/c1-11-6-3-2-5(4-9-6)7(8)10/h2-4H,1H3,(H2,8,10)

6-methoxypyridine-3-carboxamide

JBSNF-000088; 6-Methoxynicotinamide; 6-METHOXYNICOTINAMIDE; 7150-23-4; 6-methoxypyridine-3-carboxamide; CHEMBL4206972; 3-Pyridinecarboxamide,6-methoxy-; NSC70628; MFCD00229166; JBSNF 000088; JBSNF000088

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~30 mg/mL (~197.2 mM)
Ethanol: ~7 mg/mL (~46 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (13.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (13.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (13.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2.94 mg/mL (19.32 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。