JBSNF-000088   中文名称: 6-甲氧基-3-吡啶羧胺

human NNMT (IC50 = 1.8 µM); monkey NNMT (IC50 = 2.8 µM); mouse NNMT (IC50 = 5.0 µM)
The primary target of JBSNF-000088 is Nicotinamide N-methyltransferase (NNMT), an enzyme that catalyzes the N-methylation of nicotinamide (a form of vitamin B3) using S-adenosylmethionine (SAM) as a methyl donor. NNMT plays a critical role in regulating cellular methylation potential and energy metabolism. Overexpression of NNMT is associated with metabolic disorders such as obesity, insulin resistance, and non-alcoholic fatty liver disease. JBSNF-000088 acts as a potent inhibitor of NNMT, reducing the conversion of nicotinamide to 1-methylnicotinamide (MNA).

JBSNF-000088（6-羧酰胺烟酰胺）对U2OS细胞和分泌型3T3L1细胞的IC50值分别为1.6 μM和6.3 μM [1]。体外实验表明，JBSNF-000088对人NNMT的IC50值为1.8 µM，对猴NNMT的IC50值为2.8 µM，对小鼠NNMT的IC50值为5.0 µM。作为烟酰胺类似物，它与烟酰胺竞争结合NNMT活性位点。该化合物对NNMT的抑制作用可降低MNA的产生并调节细胞甲基化状态。其在多种物种中的高效性使其成为研究NNMT在临床前模型中功能的宝贵工具。

JBSNF-000088（6-羧酰胺烟酰胺）（50 mg/kg；4 周粉剂疗效）在第 21 天显示出统计学意义上的显著体重减轻百分比，并导致糖尿病血糖显著降低 [1] JBSNF-000088（50 mg/kg；临界灌胃；每天两次，持续 4 周）导致终点耐受性显著改善，并在第 28 天使终点耐受性正常化 [1]。 JBSNF-000088（1 mg/kg；静脉注射；持续 4 小时）在三个重复周期中，其血管清除率较低，分别为 21 mL/min·kg 和 0.7 L/kg，且静脉注射后半衰期极短（0.5 小时）[1]。JBSNF-000088（10 mg/kg；胃内灌注；持续 4 小时）的 Cmax 为 3568 ng/mL，Tmax 为 0.5 小时，表明其在肠腔内吸收和破坏迅速，胃内灌注的半衰期为 0.4 小时。
在体内，JBSNF-000088（50 mg/kg）可降低饮食诱导肥胖 (DIO) 小鼠模型的内脏白色脂肪组织 (WAT) 中 MNA 水平、体重、餐后血糖水平以及血浆和肝脏甘油三酯水平。它还能改善口服葡萄糖耐量。 JBSNF-000088 治疗可降低高脂饮食 (HFD) 诱导的肥胖小鼠的体重，提高胰岛素敏感性，并使葡萄糖耐量恢复至瘦型对照小鼠的水平。这些发现表明该化合物具有治疗肥胖等代谢性疾病的潜力。

基于荧光法的NNMT酶活性测定[1]
采用荧光酶活性测定法测定NNMT活性。NNMT反应中生成的MNA在KOH和甲酸存在下与苯乙酮反应，生成荧光产物2,7-萘啶。JBSNF-000088使用人、小鼠和猴的NNMT酶进行筛选。将不同浓度的抑制剂与酶在室温下预孵育30分钟。加入SAM和烟酰胺混合物（人、小鼠和猴NNMT测定中SAM浓度分别为7 µM、20 µM和8 µM，烟酰胺浓度分别为6 µM、20 µM和9 µM）引发反应，并在37 °C下反应60分钟。最终的检测反应混合物包含 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) 缓冲液、0.04% BSA、2 mM 二硫苏糖醇和 1% DMSO。孵育结束后，加入乙醇：苯乙酮混合物（75% 乙醇：25% 苯乙酮）和用 50% 乙醇配制的 5 M 氢氧化钾溶液终止反应。反应继续孵育 15 分钟后，加入 100 µL 60% 甲酸。反应在室温下继续孵育 60 分钟。使用 Tecan 酶标仪，在 375 nm 激发波长和 430 nm 发射波长下测定荧光产物 2,7-萘啶的荧光强度。使用 GraphPad Prism 软件，通过四参数 S 型剂量反应曲线拟合抑制曲线（抑制率与抑制剂浓度的关系）来确定 IC50 值。

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采用LC-MS/MS检测法测定人NNMT酶活性[1]
采用适用于此的LC-MS/MS方法测定人NNMT反应中生成的MNA。将不同浓度的抑制剂与5ng/孔的人NNMT酶在室温下预孵育30分钟。加入浓度分别为7 µM和20 µM的SAM和烟酰胺混合物启动反应，并在37 °C下孵育60分钟。最终的反应体系包含100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）、0.04% BSA、2 mM二硫苏糖醇和1% DMSO。向孔中加入100 µL含有内标d4-MNA（20ng/mL）的乙腈溶液，并在室温下孵育10分钟。向孔中加入 70 µL 高压灭菌水并轻轻混匀。将反应板在室温下以 5000 g 离心 10 分钟。取 150 µL 上清液转移至 96 孔板中，并用 LC-MS/MS 进行分析。使用四参数 S 型剂量反应图拟合抑制曲线（抑制率与抑制剂浓度的关系），从而确定 IC50 值。
对于 NNMT 抑制剂，标准的无细胞检测方法是使用烟酰胺和 SAM 作为底物来测定重组 NNMT 的酶活性。通过 HPLC、LC-MS 或分光光度法测定 1-甲基烟酰胺 (MNA) 的生成量来确定 IC50 值。通过测量 MNA 生成量的减少来评估化合物对 NNMT 活性的抑制作用。

基于细胞的U2OS检测[1]
人骨肉瘤（U2OS）细胞系购自ATCC，并在含有10%热灭活胎牛血清和青霉素-链霉素（过滤除菌）的DMEM/F-12培养基中，于37℃、5% CO₂条件下培养。计数细胞后，将10,000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，并在37℃、5% CO₂和95%湿度条件下培养24小时。之后，用100 µL不同浓度的培养基/抑制剂混合物替换培养基，并在37℃、5% CO₂和95%湿度条件下继续培养24小时。移除培养基/化合物混合物，并用乙腈洗涤两次，然后向孔中加入100 µL含有内标d4-MNA（20 ng/mL）的乙腈溶液。将培养板以 5000 g 离心 10 分钟。取 150 µL 上清液转移至 96 孔板（Costar 3364），并用 LC-MS/MS 进行分析。使用四参数 S 型剂量反应图拟合抑制曲线（抑制率与抑制剂浓度的关系），从而确定 IC50 值。

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基于细胞的 3T3L1 检测[1]
3T3-L1 细胞系源自小鼠 3T3 细胞，购自 ATCC，并在含有 10% 热灭活胎牛血清和青霉素-链霉素的 DMEM 高糖培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养。计数细胞后，将 5000 个细胞/孔接种于 96 孔细胞培养板中，并在 37 °C、5% CO2、95% 湿度条件下培养至 100% 汇合。细胞汇合24小时后，将培养基更换为含有500 μM IBMX、1 μM DEXA和1 μg/ml胰岛素的分化诱导培养基，并隔天更换培养基。细胞分化最多持续14天：三天后，将诱导培养基更换为添加了10% FBS和1 μg/ml胰岛素的DMEM培养基。从第5天开始，细胞在常规生长培养基中培养。分化后，将细胞与化合物在37 °C、5% CO2和95%湿度下孵育24小时。用DPBS洗涤细胞，并在孔中加入100 μl含有内标d4-MNA（终浓度为20 ng/mL）的乙腈溶液。使用100%乙腈从细胞中提取MNA。将培养板在室温下孵育 20 分钟，加入 100 µL 高压灭菌水并轻轻混匀。将培养板以 5000 g 离心 10 分钟。将上清液转移至 96 孔板（Costar 3364）中，并进行 LCMS/MS 分析。使用四参数 S 型剂量反应图拟合抑制曲线（抑制率与抑制剂浓度的关系），从而确定 IC50 值。

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细胞毒性试验[1]
人肝癌 (HepG2) 细胞系购自 ATCC，并在含有 10% HI FBS 和 1% 青霉素-链霉素（过滤除菌）的 DMEM Glut Max 培养基中，于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。当细胞在细胞培养瓶中汇合度达到 80% 时，用 0.25% 胰蛋白酶消化细胞。细胞计数后，将5万个细胞/孔接种于96孔不透明壁多孔板中，并在37℃、5% CO₂、95%湿度条件下培养过夜。将细胞培养基替换为100 µL培养基/抑制剂混合物（含0.5% DMSO），并设置对照组，在37℃、5% CO₂、95%湿度条件下继续培养48或72小时。最大对照样品（与0.5% DMSO完全反应）和最小对照样品（与已知抑制剂完全反应）均以1:1的比例加入到所有含有培养基的孔中（例如，在96孔板中，将100 µL试剂加入到100 µL含有细胞的培养基中）。将混合物在摇床上振荡2分钟以诱导细胞裂解。然后将培养板在室温下孵育10分钟以稳定发光信号。使用Victor或Top Count发光计数器记录发光值。计算相对于DMSO对照组的细胞活力。
对于NNMT抑制剂，标准细胞检测包括用测试化合物处理细胞（例如肝细胞、脂肪细胞）24-48小时。通过LC-MS测定细胞裂解液或培养基中的MNA水平。评估细胞甲基化潜能（SAM/SAH比值）。还可以测量代谢指标，例如葡萄糖摄取、脂质积累和线粒体功能。

动物/疾病模型：高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠[1]
剂量：50 mg/kg
给药途径：口服给药，持续4周；阻断生物利用度约为40%[1]。每日两次（灌胃）给药，持续4周
实验结果：口服给药在第21天显示出显著的体重减轻（%）和餐后血糖显著降低。第28天，口服葡萄糖耐量出现统计学意义上的显著改善，而灌胃给药使其恢复正常。

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动物/疾病模型：C57BL/6小鼠[1]
剂量：1 mg/kg（静脉（iv）给药）； 10 mg/kg（口服灌胃）（药代动力学/PK/PK 研究）
给药途径：静脉注射（iv）和口服灌胃（po）；4 小时
实验结果：静脉注射（iv）后，血浆清除率低至 21 mL/min·kg，稳态分布容积为 0.7 L/kg，血浆半衰期极短，为 0.5 小时。结果表明，Cmax 为 3568 ng/mL，Tmax 为 0.5 小时，表明 ra

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疗效研究[1]
瘦对照组 + 载体组和高脂饮食组 + 载体对照组（G1 和 G2）小鼠均给予载体。将高脂饮食（HFD）+ JBSNF-000088（50 mg kg⁻¹，口服，每日两次）的剂量方案，以 5 mL kg⁻¹ 体重的剂量体积，灌胃给予 G3 小鼠。ob/ob 小鼠和 db/db 小鼠的研究也采用了类似的给药方案。每只动物的给药体积根据研究期间最近一次记录的体重计算。在整个研究期间，观察所有动物的死亡率和发病率。每天对动物进行笼边观察，记录可见的临床症状。每周记录两次每只动物的体重。
研究开始时，ob/ob 小鼠为 12 周龄，db/db 小鼠为 8 周龄。DIO 小鼠为 20 周龄。在每项研究中，非糖尿病瘦鼠作为对照组，接受赋形剂（0.5% w/v HEC 和 0.5% v/v Tween 80）处理；肥胖或糖尿病小鼠根据体重和非空腹血糖水平随机分为两组，分别接受赋形剂（0.5% w/v HEC 和 0.5% v/v Tween 80）或 JBSNF-000088（50 mg kg⁻¹，口服，每日两次，持续 30 天）处理。研究期间，每周两次记录每只动物的体重、食物和饮水消耗量。在 DIO、ob/ob 和 db/db 疗效研究中，每组均包含 10 只动物。动物以每笼 5 只的方式饲养，并在研究期间每周两次记录每只动物的体重、食物和饮水消耗量。食物消耗量以累积能量摄入量表示。在治疗后第 7、14 和 21 天测量餐后血糖和胰岛素水平。

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OGTT[1]
在治疗后第 28 天，对 DIO 小鼠和 ob/ob 小鼠进行口服葡萄糖耐量试验 (OGTT)，并在治疗后第 26 天对 db/db 小鼠进行 OGTT，以评估 JBSNF-000088 对葡萄糖耐量的影响。DIO 和 ob/ob 小鼠禁食 4 小时后口服葡萄糖 (2 g kg−1)，而 db/db 小鼠禁食 16 小时后口服葡萄糖 (1 g kg−1)。在葡萄糖给药前一小时，小鼠经口给予赋形剂或JBSNF-000088，剂量为50 mg kg−1。
分别于给药前（-60分钟）、给药前（0分钟）以及给药后15、30、60、120和180分钟采集尾部采血进行血糖测定。在给药后0分钟和15分钟采集血液样本用于测定血浆胰岛素水平。HOMA-IR的计算公式为：[HOMA-IR = (空腹血浆胰岛素，ng ml−1 × 空腹血糖，mmol l−1) / 22.5]。在最后一次血糖测定后，动物恢复正常喂食，并持续给药直至第30天结束。

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研究结束[1]
在治疗的第30天，动物禁食4小时后，采用二氧化碳窒息法处死。在处死前 1 小时，小鼠经口给予载体或 JBSNF-000088（50 mg kg−1）。从每只动物采集血液和组织样本（肝脏、皮下脂肪、肾脏脂肪、附睾脂肪和肠系膜脂肪）。血浆和组织样本储存在 −80 °C 直至分析。

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使用野生型 (WT) 和 NNMT 敲除 (KO) 动物进行饮食诱导肥胖 (DIO) 研究[1]
使用 VelociGene® 技术³¹构建了 C57BL/6 背景的 NNMT^fl/fl 小鼠。在包含基因启动子的转录起始位点上游 1.6 kb 处放置一个 loxP 位点。在 NNMT 外显子 1 下游 212 bp 处插入一个 loxP-Frt-Hyg-Frt 盒。floxed 坐标为 chr9:48,412,881–48,414,698。将NNMT^fl/fl小鼠与ZP3-cre小鼠（C57BL/6，Jackson Laboratories）杂交，以获得全身NNMT基因敲除小鼠。DIO小鼠研究符合德国动物保护法以及国际动物福利法规和规则。雌性野生型和NNMT基因敲除小鼠饲喂高脂饮食（Ssniff HFD，TD.97366）18周，然后分别接受
（50 mg/kg，每日两次，灌胃）或载体处理4周（每组n = 9-10）。整个研究期间，小鼠饲养于温度为23℃、光暗周期为12小时：12小时（上午6:00开灯）的环境控制室中，并自由摄取食物和水。在治疗第25天进行口服葡萄糖耐量试验：小鼠禁食过夜。在口服葡萄糖推注（2 g kg⁻¹）前 60 分钟，通过灌胃给予 JBSNF-000088（50 mg kg⁻¹）或载体（0.5% HEC + 0.5% Tween80）。为进行血糖分析，在葡萄糖推注后 15、30、60 和 120 分钟，从清醒小鼠尾部采集血液样本。
NNMT 抑制剂的体内评价常用动物模型包括饮食诱导肥胖 (DIO) 小鼠、ob/ob 小鼠或其他代谢疾病模型。该化合物通常口服给药 2-4 周。终点指标包括体重、脂肪组织质量、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性、血浆和肝脏甘油三酯水平以及组织中 MNA 水平。JBSNF-000088 已在 DIO 小鼠模型中进行过评价。

JBSNF-000088 的分子量为 152.15，分子式为 C7H8N2O2，也称为 6-甲氧基烟酰胺。作为一种小分子药物，预计其具有良好的口服生物利用度。该化合物具有口服活性。开发其治疗用途需要进行全面的药代动力学研究。

现有资料中未提供JBSNF-000088的详细毒理学数据。作为一种靶向NNMT的研究化合物，其治疗开发需要进行标准的临床前毒理学研究。该化合物对正常组织中烟酰胺代谢和细胞甲基化潜能的影响需要进行评估。该化合物仅供研究使用，不得用于治疗用途。

[1]. A small molecule inhibitor of Nicotinamide N-methyltransferase for the treatment of metabolic disorders. Sci Rep. 2018 Feb 26;8(1):3660.

烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）是一种胞质酶，催化辅因子S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）上的甲基转移至底物烟酰胺（NA）上，生成1-甲基烟酰胺（MNA）。NNMT表达和MNA浓度升高与肥胖和2型糖尿病相关。本文报道了一种小分子NA类似物JBSNF-000088，该化合物可抑制NNMT活性，降低MNA水平，并促进胰岛素敏感性，调节血糖，降低代谢疾病动物模型的体重。在高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠中，JBSNF-000088治疗可降低体重，改善胰岛素敏感性，并将葡萄糖耐量恢复至瘦鼠水平。在HFD喂养的NNMT基因敲除小鼠中未观察到这些作用，证实了JBSNF-000088的特异性。该化合物也能改善ob/ob和db/db小鼠的葡萄糖代谢，尽管程度较轻，且不会引起体重减轻。共晶体结构分析表明，JBSNF-000088的N-甲基化产物与NNMT蛋白结合。在接受JBSNF-000088治疗的小鼠血浆中也检测到了该N-甲基化产物。因此，JBSNF-000088可能作为一种慢周转底物类似物发挥作用，从而产生观察到的代谢益处。[1]我们尝试利用X射线晶体衍射技术，结合小鼠和人NNMT蛋白，来确定JBSNF-000088的结合模式。结果表明，JBSNF-000088发生了甲基化，并且甲基化的JBSNF-000088与两种蛋白的活性底物结合位点结合，同时辅因子SAM转化为去甲基化形式（SAH）。这支持了JBSNF-000088可能作为底物类似物发挥作用的假设，它与天然底物NA竞争，抑制NA与酶活性位点的结合。一旦与活性位点结合，SAM上的甲基转移导致N-甲基化JBSNF-000088的形成。有趣的是，在接受未甲基化小分子（JBSNF-000088）的动物的循环血浆中也发现了N-甲基化产物，尽管含量非常低。这可能是因为JBSNF-000088是NNMT的强效结合剂，但其底物活性较弱，导致周转缓慢。然而，在NNMT共晶体中，由于酶浓度较高，可以清晰地检测到N-甲基化化合物的形成。 JBSNF-000088 的 N-甲基化产物本身对 NNMT 的抑制活性较弱，IC50 值 > 30 µM（30 µM 浓度下抑制率为 20%）。因此，JBSNF-000088 可能作为一种竞争性底物类似物发挥作用，其转化为 N-甲基化产物的速度非常缓慢。据我们所知，这是首个在代谢疾病动物模型中验证 NNMT 小分子调节剂药理学益处的概念验证研究。我们的研究为开发 NNMT 小分子调节剂用于代谢紊乱患者的临床试验开辟了道路。[1]
JBSNF-000088 又名 6-甲氧基烟酰胺，是烟酰胺 (NA) 的类似物。它是一种强效且口服有效的NNMT抑制剂，对NNMT的IC50值分别为1.8 µM（人）、2.8 µM（猴）和5.0 µM（小鼠）。该化合物可降低DIO小鼠模型的体重、餐后血糖、血浆和肝脏甘油三酯水平，并改善其口服葡萄糖耐量。目前尚未发现任何监管机构的批准。

C7H8N2O2

152.15

152.059

C, 55.26; H, 5.30; N, 18.41; O, 21.03

7150-23-4

7150-23-4

250810

White to light yellow solid powder

1.213g/cm3

301.6ºC at 760mmHg

136.2ºC

1.55

0.889

65.21

1

3

2

11

149

0

O(C([H])([H])[H])C1C([H])=C([H])C(C(N([H])[H])=O)=C([H])N=1

KXDSMFBEVSJYRF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C7H8N2O2/c1-11-6-3-2-5(4-9-6)7(8)10/h2-4H,1H3,(H2,8,10)

6-methoxypyridine-3-carboxamide

JBSNF-000088; 6-Methoxynicotinamide; 6-METHOXYNICOTINAMIDE; 7150-23-4; 6-methoxypyridine-3-carboxamide; CHEMBL4206972; 3-Pyridinecarboxamide,6-methoxy-; NSC70628; MFCD00229166; JBSNF 000088; JBSNF000088

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~30 mg/mL (~197.2 mM)
Ethanol: ~7 mg/mL (~46 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (13.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (13.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (13.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2.94 mg/mL (19.32 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。