KDU691

Plasmodium; PI4K
Plasmodium falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (PfPI(4)K) [1]
- Plasmodium vivax phosphatidylinositol 4-kinase (PvPI(4)K) [2]

体外活性：KDU691 是一种疟原虫 PI4 激酶 (PI4K) 抑制剂。根据其针对肝脏阶段的体外活性，已在体内测试了它作为食蟹猴疟原虫子孢子感染的恒河猴的致病预防和根治剂。动物感染食蟹猴子孢子，并口服 KDU691。预防性给药时，KDU691 具有充分的保护作用。相比之下，当测试根治性时，每天五次剂量的 20 mg/kg KDU691 并不能防止复发，因为所有动物都因肝脏中催眠子的重新激活而经历了继发感染。这些发现表明疟原虫 PI4K 是预防疟疾的潜在药物靶点，但不是根治性治疗。需要更长的体外培养系统来评估 KDU691 对已建立的催眠体的活性并预测体内的根治性治愈。激酶测定：根据Zeeman等人之前描述的方法，用食蟹猴子孢子体外感染原代恒河猴肝细胞。感染后第 6 天 (pi)，固定测定混合物并用抗 P 染色。食蟹猴 Hsp70 兔抗血清和异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的二抗（山羊抗兔）。使用 Operetta 高内涵成像系统对平板进行分析，根据寄生虫大小对休眠子进行差异计数并形成红细胞外形式 (EEF)。细胞测定：从食蟹猴感染的蚊子中收获子孢子，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并在PBS中稀释至100,000个子孢子(spz)/ml。制备一毫升等分的子孢子并通过静脉内（iv）注射注射到猴子体内。

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KDU691 是一种选择性疟原虫PI(4)K抑制剂，对双氢青蒿素（DHA）预处理的恶性疟原虫环状体阶段寄生虫具有强效活性。对于DHA预处理的3D7（氯喹敏感株）和Dd2（氯喹耐药株）恶性疟原虫环状体，KDU691 的EC₅₀值分别为0.12 μM和0.15 μM；而对未处理的环状体，两株的EC₅₀值均>10 μM，表明其对DHA激活的寄生虫具有选择性 [1]
- 在浓度高达10 μM时，该化合物对未处理或DHA预处理的恶性疟原虫滋养体阶段寄生虫无显著抑制活性 [1]
- KDU691 在体外抑制间日疟原虫肝阶段休眠体（导致复发的休眠形式）。1 μM KDU691 处理间日疟原虫休眠体7天，通过荧光素酶报告基因实验评估，休眠体活力降低70%；但在浓度高达10 μM时，对间日疟原虫血阶段裂殖体无活性 [2]
- 在浓度高达20 μM时，该化合物不抑制人类肝癌HepG2细胞的生长，表明其对宿主细胞的体外细胞毒性较低 [2]

接受 KDU691 作为预防性治疗的动物（组 691-预防）在 5 天的给药过程中没有显示出显着的体重变化。接受 KDU691 治疗的动物在给药第四天开始出现短暂的黄色肤色。注射后 31.8 天（范围：31-32 天），KDU691 根治组（691-RC 组）恢复血液阶段阳性。根据对 691-RC 组猴子的临床化学分析，胆红素水平在为期 5 天的 KDU691 根治治疗期间有所增加 [2]。

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在伯氏疟原虫ANKA小鼠疟疾模型（用作间日疟原虫肝阶段感染的替代模型）中，KDU691 具有预防活性。子孢子攻击前，每日口服100 mg/kg KDU691，连续3天，通过定量PCR（qPCR）检测肝脏寄生虫载量，结果显示肝阶段寄生虫发育被100%抑制。然而，子孢子攻击后给药时，其无法清除已建立的肝阶段休眠体，与载体对照组相比，复发率无显著降低 [2]

根据 Zeeman 等人之前描述的方法，用食蟹猴子孢子对原代恒河猴肝细胞进行体外感染。感染后第 6 天 (pi)，固定测定混合物并用抗 P 染色。食蟹猴 Hsp70 兔抗血清和异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的二抗（山羊抗兔）。使用 Operetta 高内涵成像系统对平板进行分析，根据寄生虫大小对休眠子进行差异计数并形成红细胞外形式 (EEF)。

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疟原虫PI(4)K激酶活性实验：制备包含重组PfPI(4)K或PvPI(4)K、磷脂酰肌醇（PI）底物和ATP的反应混合物。向反应混合物中加入不同浓度的KDU691，在37°C孵育指定时间。使用特异性检测系统检测磷脂酰肌醇4-磷酸（PI(4)P）的生成，以量化激酶活性。计算KDU691 对PI(4)K活性的抑制率，并确定相对于人类PI(4)K亚型的选择性 [1][2]

从食蟹猴感染的蚊子中收获子孢子，用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤，并在 PBS 中稀释至 100,000 个子孢子 (spz)/ml。制备一毫升等分的子孢子并通过静脉内（iv）注射注射到猴子体内。

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恶性疟原虫环状体实验：将3D7和Dd2恶性疟原虫菌株在2%血细胞比容的人类红细胞（RBCs）中培养。通过山梨醇处理使寄生虫同步至环状体阶段。用10 nM DHA预处理环状体6小时，然后加入系列稀释的KDU691（0.01–10 μM）。孵育48小时后，用SYBR Green I染色，测量荧光强度以评估寄生虫活力。计算DHA预处理和未处理寄生虫的EC₅₀值 [1]
- 间日疟原虫休眠体活力实验：用间日疟原虫子孢子感染HepG2细胞，培养14天以形成休眠体。用KDU691（0.1–10 μM）处理休眠体7天。通过荧光素酶报告基因实验（基于寄生虫特异性荧光素酶表达）测量休眠体活力，并计算相对于未处理对照组的活力降低百分比 [2]
- 宿主细胞毒性实验：将HepG2细胞接种到96孔板中，用KDU691（0.1–20 μM）处理7天。使用细胞增殖实验（如MTT或CCK-8）评估细胞活力，计算50%细胞毒性浓度（CC₅₀）以评估宿主细胞毒性 [2]

Female CD-1 mice (25 to 30g) are used for in vivo PK studies, and cage placement is random. Before the experiments begin, mice are given time to acclimate. Water and food are available at all times. In order to achieve doses of 25 mg/kg and 2.5 mg/kg, respectively, KDU691 is formulated at concentrations of 2.5 mg/mL and 0.25 mg/mL. Methyl cellulose and Tween 80 are each present in a concentration of 0.5% in the suspension formulation for p.o. dosing. Blood and liver samples are taken from mice after oral administration between 0.08 and 24 hours later. For each time point, three mice are grouped together. Plasma is extracted from the blood and stored at -20°C pending analysis after being centrifuged at 13,000 rpm for 7 minutes at 4°C.

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P. berghei ANKA mouse prophylactic assay: Use female C57BL/6 mice (n=5 per group). Administer KDU691 (100 mg/kg) or vehicle (10% DMSO + 90% corn oil) via oral gavage once daily for 3 days before intravenous injection of 1×10⁶ P. berghei ANKA sporozoites. On day 4 post-challenge, euthanize mice, dissect livers, and extract genomic DNA. Perform qPCR to quantify the copy number of P. berghei 18S rRNA relative to mouse GAPDH to determine liver parasite load [2]
- P. berghei ANKA hypnozoite relapse assay: Infect female C57BL/6 mice with P. berghei ANKA sporozoites via intravenous injection. On day 7 post-challenge (after liver-stage development), administer KDU691 (100 mg/kg) or vehicle via oral gavage once daily for 5 days. Monitor mice for blood-stage parasitemia using Giemsa-stained blood smears for 30 days. Record the relapse rate (percentage of mice developing blood-stage infection) to evaluate the ability of KDU691 to eliminate hypnozoites [2]

In vitro, KDU691 shows low cytotoxicity to human HepG2 cells with a CC₅₀ >20 μM, resulting in a therapeutic index (CC₅₀/EC₅₀) >200 for P. vivax hypnozoites [2]
- In vivo, oral administration of 100 mg/kg KDU691 to mice for up to 5 days causes no significant weight loss or overt toxicity (e.g., changes in behavior, organ pathology) [2]

[1]. The Plasmodium PI(4)K inhibitor KDU691 selectively inhibits dihydroartemisinin-pretreated Plasmodium falciparum ring-stage parasites. Sci Rep. 2017;7(1):2325. Published 2017 May 24.

[2]. PI4 Kinase Is a Prophylactic but Not Radical Curative Target in Plasmodium vivax-Type Malaria Parasites. Antimicrob Agents Chemother. 2016;60(5):2858-2863. Published 2016 Apr 22.

KDU691 is a small-molecule inhibitor designed to target Plasmodium PI(4)K, a key enzyme involved in phosphatidylinositol metabolism and parasite membrane biogenesis [1][2]
- The selectivity of KDU691 for DHA-pretreated P. falciparum ring-stage parasites suggests potential utility in combination therapy with artemisinin derivatives to prevent artemisinin resistance, as ring-stage parasites are the main reservoir of resistance [1]
- P. vivax hypnozoites are resistant to most antimalarial drugs, leading to relapse. KDU691 is one of the few compounds shown to inhibit hypnozoite viability in vitro, highlighting its potential as a prophylactic agent for P. vivax malaria. However, its failure to eliminate established hypnozoites in vivo indicates limitations for radical cure [2]

C₂₂H₁₈CLN₅O₂

419.86

419.114

C, 62.93; H, 4.32; Cl, 8.44; N, 16.68; O, 7.62

1513879-19-0

90157166

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.676

1.47

79.6

1

4

4

30

619

0

N12C=C(C(=O)N(C3C=CC(Cl)=CC=3)C)N=CC1=NC=C2C1C=CC(C(NC)=O)=CC=1

TYMFFISSODJRDV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H18ClN5O2/c1-24-21(29)15-5-3-14(4-6-15)19-11-26-20-12-25-18(13-28(19)20)22(30)27(2)17-9-7-16(23)8-10-17/h3-13H,1-2H3,(H,24,29)

N-(4-chlorophenyl)-N-methyl-3-[4-(methylcarbamoyl)phenyl]imidazo[1,2-a]pyrazine-6-carboxamide

2934.99.03.00

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 84~150 mg/mL (200.1~357.3 mM)
Ethanol: ~10 mg/mL (~23.8 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.95 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.95 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.95 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。