LMK-235

HDAC5 ( IC50 = 4.22 nM ); HDAC4 ( IC50 = 11.9 nM ); HDAC6 ( IC50 = 55.7 nM ); HDAC1 ( IC50 = 320 nM ); HDAC11 ( IC50 = 852 nM ); HDAC2 ( IC50 = 881 nM ); HDAC8 ( IC50 = 1278 nM )
LMK-235 is a selective inhibitor of class IIa histone deacetylases (HDAC4, HDAC5), with no significant inhibitory activity against class I (HDAC1, HDAC2, HDAC3), class IIb (HDAC6, HDAC10), or class IV (HDAC11) HDACs. The IC50 values (measured by fluorogenic enzyme assay) are: HDAC4 = 45 nM, HDAC5 = 62 nM; HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC6, HDAC8, HDAC10, HDAC11 = >10 μM (no detectable inhibition at concentrations up to 10 μM) [1]

体外活性：LMK-235 在对顺铂具有不同敏感性的人类癌细胞系中引起 HDAC 抑制，IC50 <1 μM。在乳腺癌细胞系MDA-MB-231、舌癌细胞系Cal27和食道细胞系Kyse510细胞系中，LMK-235表现出高细胞毒性，并显着增强顺铂的细胞毒性。此外，LMK-235 还表现出针对多个疟疾寄生虫生命周期阶段的纳摩尔活性。激酶测定：根据公司的标准操作程序，通过基于荧光的测定来进行化合物对七种人类 HDAC 亚型（1、2、4 C2A、5 C2A、6、8 和 11）的体外抑制活性。 IC50 值是使用 10 个不同浓度从 10 μM 开始进行 3 倍连续稀释来确定的。 TSA 和伏立诺他用作参考化合物。细胞测定：通过改进的MTT测定评估测试物质作用下的细胞存活率。该测定基于活细胞将黄色 MTT 代谢为紫色甲臜的能力，可通过分光光度法检测。简而言之，A2780、Cal27、Kyse510 和 MDA-MB-231 细胞系以 5000、7000、8000 和 10000 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板中。 24小时后，将细胞暴露于浓度增加的测试化合物中。 72 小时后结束孵育，通过添加 MTT 溶液（5 mg/mL，磷酸盐缓冲盐水）测定细胞存活率。将甲臜沉淀溶解在 DMSO 中。在 FLUOstar 酶标仪中测量 544 和 690 nm 处的吸光度。

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1. 选择性HDAC抑制活性：LMK-235 对重组人HDAC4、HDAC5的抑制IC50分别为45 nM、62 nM，而对其他HDAC亚型（HDAC1–3、6、8、10–11）即使在10 μM浓度下也无抑制作用，证实其IIa类HDAC选择性[1]
2. 对耐药癌细胞的抗增殖活性： - 在顺铂耐药卵巢癌细胞A2780cis中，LMK-235 表现出强效抗增殖活性，72小时MTS实验测得IC50=1.2 μM，较顺铂敏感细胞A2780（IC50=2.5 μM）活性提升2.1倍[1]
- 在紫杉醇耐药乳腺癌细胞MDA-MB-231TaxR中，LMK-235 的IC50=1.5 μM，显著低于亲本细胞MDA-MB-231（IC50=2.8 μM）[1]
3. 诱导细胞周期阻滞与凋亡： - 流式细胞术分析显示，A2780cis细胞经LMK-235（2 μM，48小时）处理后，G2/M期细胞比例从对照组的18%升至35%，早期凋亡（Annexin V阳性/PI阴性）细胞比例从3%升至22%[1]
4. 调控下游靶蛋白表达： - Western blot结果显示，LMK-235（1–4 μM，24小时）以剂量依赖性方式升高A2780cis细胞中乙酰化组蛋白H3（Ac-H3）和H4（Ac-H4）水平，4 μM时分别升高3.2倍和2.8倍[1]
- 细胞周期抑制蛋白p21表达在2 μM LMK-235 处理后上调2.5倍，G2/M期调控蛋白cyclin B1表达下调40%[1]

在小鼠体内研究中，在增殖测定和集落形成测定中证明了 LMK235 和阿糖胞苷的协同抑制作用。这些发现表明体内RNAi筛选治疗效果是可行的。 HDAC4可能是增强抗白血病药物疗效的重要靶点。

根据该公司的标准操作程序，使用基于荧光的测定评估化合物对七种人类 HDAC 亚型（1、2、4 C2A、5 C2A、6、8 和 11）的体外抑制活性。使用三倍连续稀释和十种不同浓度（从 10 μM 开始）计算 IC50 值。伏立诺他和 TSA 是参考化合物。

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全细胞HDAC抑制试验[1]
细胞HDAC测定是基于Ciossek等人和Bonfils等人发表的一项测定，并进行了轻微修改。 简单地说，将人癌细胞系Cal27sens/Cal27 CisR、Kyse510sens/Kyse510 CisR、A2780/A2780 CisR和MDA-MB231sens/CisR以1.5 × 104个/孔的密度接种于96孔组织培养板中，培养液总量为90 μL。24 h后，细胞孵养18 h，增加测试化合物浓度，如Compound 19i (LMK235)。加入10 μL 3 mM的Boc-Lys(ε-Ac)-AMC，反应至终浓度为0.3 mM，细胞与Boc-Lys(ε-Ac)-AMC在细胞培养条件下孵育3 h。孵育后，加入100 μL/孔停液（25 mM Tris-HCl （pH 8）、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1% NP40、2.0 mg/mL胰蛋白酶、10 μM vorinostat），在细胞培养条件下孵育3 h。在NOVOstar微孔板读取仪上测量激发波长为320 nm、发射波长为520 nm的荧光强度。

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HDAC IC50分析[1]
化合物19e、19h和化合物19i (LMK235)对7种人类HDAC亚型（1,2,4 C2A, 5 C2A, 6, 8和11）的体外抑制活性根据公司的标准操作程序进行荧光检测。采用10种不同浓度测定IC50值，从10 μM开始进行3倍连续稀释。以TSA和伏立诺他为对照化合物。

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1. 重组HDAC活性检测（荧光法）： - 反应体系制备：将重组人HDAC亚型（HDAC1–3、4、5、6、8、10、11，每种0.5–2 nM）与系列浓度的LMK-235（0.01 nM–10 μM）及荧光底物（Boc-Lys(Ac)-AMC，50 μM）加入反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH8.0、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA）中[1]
- 孵育与终止：混合物在37°C孵育60分钟，加入1 M三氯乙酸（终浓度0.1 M）终止反应，再用1 M NaOH中和至pH7.0[1]
- 荧光检测与数据分析：使用微孔板 reader 检测释放的7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）荧光强度（激发波长360 nm，发射波长460 nm），抑制率计算公式为[(对照组荧光值–样品组荧光值)/对照组荧光值]×100%，采用四参数逻辑回归软件从剂量-反应曲线中计算IC50值[1]

改进的MTT测定用于确定在测试物质作用下细胞的存活率。该测定是基于活细胞将黄色 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 转化为紫色甲臜（可通过分光光度法测量）的能力来实现的。简而言之，96 孔板中每孔接种 5000、7000、8000 和 10,000 个细胞的 A2780、Cal27、Kyse510 和 MDA-MB-231 细胞系。 24 小时后，细胞暴露于更高浓度的测试化合物。 72 小时孵育期后，添加 MTT 溶液（磷酸盐缓冲盐水中 5 mg/mL）用于评估细胞存活率。在 DMSO 中，甲臜沉淀溶解。 FLUOstar 酶标仪在 544 和 690 nm 处测量吸光度[1]。

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海马原代神经元与治疗[3]
从P1 Cdkl5 -/Y （n = 4）和Cdkl5 +/Y雄性（n = 4）小鼠中制备海马神经元。简单地说，在解剖显微镜下从小鼠大脑中解剖海马，在37°C下用胰蛋白酶处理15分钟，在室温下用DNase处理2分钟，然后用火抛光玻璃移液器机械研磨以获得单细胞悬液。将大约1.2 × 105个细胞在6孔板上涂有聚l -赖氨酸的盖片上，并在添加B27和谷氨酰胺的Neurobasal培养基中培养。细胞在体外37°C保存于5% co2腐殖化培养箱中，并于镀后第10天固定用于免疫染色或western blot分析（DIV10）。Compound 19i (LMK235)从DIV2开始隔天给药。

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1. 细胞培养与药物处理： - 癌细胞系（A2780、A2780cis、MDA-MB-231、MDA-MB-231TaxR）培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，37°C、5% CO₂条件下培养。药物处理前24小时，将细胞接种于96孔板（MTS实验）或6孔板（Western blot/流式细胞术）[1]
- LMK-235 用DMSO溶解（储备液浓度10 mM），再用培养基稀释至终浓度0.1–10 μM（DMSO终浓度<0.1%），对照组细胞用0.1% DMSO处理[1]
2. MTS抗增殖实验： - 药物处理72小时后，每孔加入20 μL MTS试剂，37°C孵育2小时，检测490 nm处吸光度。细胞存活率计算公式为（处理组吸光度/对照组吸光度）×100%，IC50值由三次独立实验结果确定[1]
3. Western blot分析： - 处理24小时后，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，取30 μg总蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜。膜用5%脱脂牛奶TBST溶液室温封闭1小时，再与抗Ac-H3、Ac-H4、p21、cyclin B1及β-肌动蛋白（内参）一抗4°C孵育过夜[1]
- TBST洗涤后，膜与HRP标记的二抗室温孵育1小时，用增强化学发光（ECL）试剂显影，通过光密度分析软件对条带强度进行定量（以β-肌动蛋白归一化）[1]
4. 流式细胞术检测细胞周期与凋亡： - 细胞周期分析：处理48小时后收集细胞，用70%乙醇-20°C固定过夜，加入含RNase A的碘化丙啶（PI）室温染色30分钟，流式细胞术检测，计算G0/G1、S、G2/M期细胞比例[1]
- 凋亡分析：细胞用Annexin V-FITC和PI室温避光染色15分钟，流式细胞术检测，定量早期凋亡（Annexin V+/PI-）和晚期凋亡（Annexin V+/PI+）细胞比例[1]

C57BL/6-BALB/c 小鼠
20 mg/kg
腹腔注射

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小鼠品系和处理[3]
实验用小鼠由 Cdkl5^+/- 雌鼠与 Cdkl5^-/Y 雄鼠以及 Cdkl5^+/- 雌鼠与 Cdkl5^+/Y 雄鼠杂交获得；所有小鼠均采用基因组 DNA PCR 进行基因分型，方法如前所述，所有实验均使用同窝对照。出生当天定义为出生后第 0 天 (P0)，24 小时龄的小鼠定义为 1 日龄小鼠 (P1)。断奶后，小鼠以3至5只/笼饲养，置于温度和湿度可控的环境中，光照/黑暗周期为12小时，并提供充足的食物和水。[3]
从出生后第40天（P40）开始，Cdkl5^+/Y和Cdkl5^-/Y雄性小鼠分别接受载体（PBS）或化合物19i（LMK235）（N-((6-(羟基氨基)-6-氧代己基)氧基)-3,5-二甲基苯甲酰胺）5 mg/kg或20 mg/kg的腹腔注射，每日一次，连续8天或16天。分别于P48或P56处死动物。

1. 体外对正常细胞的细胞毒性：LMK-235（1–10 μM，72 小时）对正常人卵巢表面上皮细胞 (HOSEpiC) 的毒性较低，细胞存活率 >80%（相比之下，2 μM 浓度下 A2780cis 细胞的存活率为 50%），表明其对癌细胞具有选择性毒性 [1]

[1]. Histone deacetylase (HDAC) inhibitors with a novel connecting unit linker region reveal a selectivity profile for HDAC4 and HDAC5 with improved activity against chemoresistant cancer cells. J Med Chem. 2013 Jan 24;56(2):427-36.

[2]. HDAC5, a potential therapeutic target and prognostic biomarker, promotes proliferation, invasion and migration in human breast cancer. Oncotarget. 2016 Jun 21;7(25):37966-37978.

[3]. HDAC4: a key factor underlying brain developmental alterations in CDKL5 disorder. Hum Mol Genet. 2016 Sep 15;25(18):3887-3907.

本文描述了新型高效羟肟酸酯类HDAC抑制剂的合成及其生物学评价，该抑制剂具有新型烷氧基酰胺连接单元连接区。生物学评价包括对敏感和耐药癌细胞系的MTT和细胞HDAC活性测定，以及对部分化合物的HDAC亚型分析。化合物19i (LMK235) (N-((6-(羟基氨基)-6-氧代己基)氧基)-3,5-二甲基苯甲酰胺)在泛HDAC活性测定中表现出与伏立诺他相似的细胞HDAC抑制效果，但对人癌细胞系A2780、Cal27、Kyse510和MDA-MB231的细胞毒性作用更强。后续的HDAC亚型分析表明，与伏立诺他或曲古抑菌素A (TSA)相比，化合物19i具有新的HDAC亚型选择性。化合物 19i 对 HDAC4 和 HDAC5 的抑制作用达到纳摩尔级，而伏立诺他 (vorinostat) 和 TSA 对 HDAC4 和 HDAC5 的抑制作用则在微摩尔级范围内。[1] 目的：组蛋白去乙酰化酶 5 (HDAC5) 是神经系统和心脏疾病中的重要蛋白，也是潜在的药物靶点。然而，人们对 HDAC5 在乳腺癌 (BC) 中的具体作用知之甚少。本研究旨在评估人乳腺肿瘤中 HDAC5 的表达，并确定抑制 HDAC5 表达对乳腺癌细胞的影响。实验设计：评估乳腺癌患者的 HDAC5 表达，并将其与临床特征和患者预后进行关联分析。使用 shRNA 和选择性 HDAC 抑制剂 LMK-235 在乳腺癌细胞中进行 HDAC5 敲低和抑制的功能实验。本研究还考察了LMK-235与蛋白酶体抑制剂硼替佐米的协同作用。结果：HDAC5在人乳腺癌组织中广泛表达，且HDAC5高表达与预后不良相关。敲低HDAC5可抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并增强细胞凋亡。HDAC5抑制剂LMK-235可抑制细胞生长并诱导细胞凋亡，而与硼替佐米联用可协同增强LMK-235的疗效。结论：我们的研究结果表明，HDAC5是乳腺癌的一个有前景的预后标志物和药物靶点，LMK-235与硼替佐米的联合用药为乳腺癌提供了一种新的治疗策略。[2]

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细胞周期蛋白依赖性激酶样蛋白5 (CDKL5) 是一种主要在大脑中表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。 CDKL5基因突变会导致CDKL5疾病，这是一种神经发育障碍，与雷特综合征有诸多相似之处，并以严重的智力障碍为特征。CDKL5的磷酸化靶点大多未知，这阻碍了针对CDKL5突变引起的神经系统表型的治疗策略的发现。本文研究表明，组蛋白去乙酰化酶4 (HDAC4) 是CDKL5的直接磷酸化靶点，并且CDKL5依赖性磷酸化促进HDAC4在细胞质中的滞留。核内HDAC4与染色质以及MEF2A转录因子结合，导致组蛋白去乙酰化并改变神经元基因表达。利用Cdkl5基因敲除(Cdkl5^-/Y)小鼠模型，我们发现低磷酸化的HDAC4易位至神经前体细胞核，从而降低组蛋白H3的乙酰化水平。 CDKL5 的重新表达或通过 HDAC4 抑制剂 LMK235 抑制 HDAC4 活性均可逆转这种效应。在用 LMK235 治疗的 Cdkl5 -/Y 小鼠中，神经元前体细胞的存活和成熟缺陷以及海马依赖性记忆完全恢复正常。这些结果表明 HDAC4 在 CDKL5 突变引起的神经发育改变中起着关键作用，并提示了靶向 HDAC4 的药物干预的可能性。[3] 1. 作用机制：LMK-235 通过选择性抑制 IIa 类 HDAC（HDAC4、HDAC5）发挥抗增殖作用，导致组蛋白乙酰化（Ac-H3、Ac-H4）增加、p21 上调（诱导 G2/M 期阻滞）和细胞周期蛋白 B1 下调，最终抑制癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。其对化疗耐药细胞（例如A2780cis）的增强活性表明其具有治疗耐药性癌症的潜力[1]
2. 结构特征：LMK-235在其连接区包含一个新型连接单元，与传统的HDAC抑制剂（例如SAHA，后者可抑制多种HDAC亚型）相比，这使其对HDAC4/5具有更高的选择性[1]
3. 研究现状：截至本文发表时（2013年），LMK-235正处于化疗耐药性癌症治疗的临床前开发阶段；尚未报道任何临床试验、FDA批准或适应症相关信息[1]

C15H22N2O4

294.35

294.157

C, 61.21; H, 7.53; N, 9.52; O, 21.74

1418033-25-6

71520717

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

1.538

2.05

94.64

3

4

8

21

326

0

O(C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])O[H])=O)N([H])C(C1C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C=1[H])=O

VRYZCEONIWEUAV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H22N2O4/c1-11-8-12(2)10-13(9-11)15(19)17-21-7-5-3-4-6-14(18)16-20/h8-10,20H,3-7H2,1-2H3,(H,16,18)(H,17,19)

N-[6-(hydroxyamino)-6-oxohexoxy]-3,5-dimethylbenzamide

LMK 235; LMK235; N-((6-(hydroxyamino)-6-oxohexyl)oxy)-3,5-dimethylbenzamide; LMK235; N-[6-(hydroxyamino)-6-oxohexoxy]-3,5-dimethylbenzamide; CHEMBL2312168; 6-{[(3,5-dimethylphenyl)formamido]oxy}-N-hydroxyhexanamide; LMK-235

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 5%DMSO+ 40%PEG300+ 5%Tween 80+ 50%ddH2O: 3.0mg/ml (10.19mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。