LOC14

PDI (Kd = 62 nM)
The primary target of LOC14 is protein disulfide isomerase (PDI), a multifunctional enzyme in the endoplasmic reticulum that catalyzes the formation, reduction, and isomerization of disulfide bonds in proteins. PDI plays a critical role in protein folding, quality control, and the unfolded protein response (UPR). LOC14 is a potent PDI modulator with high affinity (Kd = 62 nM). It binds to PDI and modulates its enzymatic activity, impacting protein folding and stability. LOC14 suppresses PDI's activity and forces PDI to adopt an oxidized conformation.

LOC-14（0.01-100 μM；24 小时）能够抑制重组 (r)PDIA3，IC50 值约为 5 μM。与 PDI 抑制剂处理后，LOC-14 可抑制肺上皮细胞中的 PDIA3 活性，降低 H1N1 (A/PR8/34) 和 H3N2 (X31, A/Aichi/68) 感染的肺上皮细胞中 HA 的分子内二硫键及其后续的寡聚化（成熟）[2]。

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LOC-14 是通过对约 10,000 个先导化合物进行高通量筛选而发现的，这些化合物能够有效挽救表达突变亨廷顿蛋白的 PC12 细胞的活力，随后在体外筛选中评估了这些化合物对 PDI 还原酶活性的影响。等温滴定量热法和荧光实验表明，LOC14与PDI的结合是可逆的，Kd值为62 nM，这表明LOC14是迄今为止报道的最有效的PDI抑制剂。利用二维异核单量子相关核磁共振实验，我们确定了LOC14的结合位点位于活性位点附近，并观察到LOC14的结合迫使PDI呈现氧化构象。此外，我们发现LOC14诱导的PDI氧化不仅在细胞培养中，而且在皮质纹状体脑片培养中也具有神经保护作用[1]。体外实验表明，LOC14以500 nM的EC50值抑制PDI活性。它与PDI具有高亲和力（Kd = 62 nM）。LOC14调节PDI的酶活性，影响蛋白质的折叠和稳定性。该化合物除了抑制PDI的活性外，还迫使PDI呈现氧化构象。作为一种强效的 PDI 抑制剂，LOC14 是研究 PDI 在蛋白质折叠、内质网应激及相关疾病中的作用的宝贵工具。

LOC-14（灌胃给药；20 mg/kg；每日一次；12-28 周）可延长 N171-82Q HD 小鼠的生存期，减轻脑萎缩，并显著改善其运动功能。雄性 N171-82Q HD 小鼠为动物模型。剂量为 20 mg/kg。每日一次，口服给药，持续 12 至 28 周。结果显示 HD 小鼠的运动能力得到改善。LOC-14 的制备方法为：首先将其与 1-甲基-2-吡咯烷酮 (NMP) 混合，配制成 80 mg/ml 的储备液，然后用 0.5% 甲基纤维素稀释至所需浓度（40 倍稀释）[3]。
在体内，LOC-14 用于研究 PDI 在蛋白质折叠、内质网应激及相关疾病中的功能。该化合物通过抑制PDI，在体内调节蛋白质折叠和未折叠蛋白反应。然而，现有文献中并未详细列出动物模型中的具体体内疗效数据。该化合物调节PDI活性的能力使其成为研究内质网应激相关疾病（包括神经退行性疾病、癌症和代谢紊乱）的宝贵工具。

酶促胰岛素还原测定。[1]
该测定在384孔黑色透明底板中进行。每个孔中含有80 μL反应混合物，该混合物溶于缓冲液A（10 mM Tris·HCl，pH 8，150 mM NaCl和2 mM EDTA）中，并含有5 μM PDIa、100 μM牛胰岛素、350 μM DTT和75 μM待测化合物。所有实验均重复两次。将测定板在25 °C下孵育1小时，然后使用Tecan Infinite 200微孔板读数仪，每隔5分钟连续读取650 nm处的吸光度，持续1小时。吸光度增加表明胰岛素β链聚集并从溶液中沉淀出来[1]。
对于PDI抑制剂，标准的无细胞检测方法是使用肽底物（例如RNase A或胰岛素）测量重组PDI的异构酶活性。将化合物与酶和底物一起孵育，并通过浊度变化（胰岛素沉淀法）或荧光（使用荧光底物）监测异构化反应。结合亲和力（Kd）通过表面等离子共振（SPR）或等温滴定量热法（ITC）测定。

MTEC细胞浓度：0.01 μM；0.1 μM；0.5 μM；1 μM；5 μM；10 μM；100 μM，孵育24小时；结果：重组(r)PDIA3活性降低。
原代MTEC细胞按照先前描述的方法，从年龄和性别匹配的野生型(WT) C57BL/6NJ小鼠中分离培养。细胞以2 × 10⁶个/皿的密度接种，当细胞汇合度超过90%时，用小鼠适应性H1N1甲型流感病毒Puerto Rico 8/34 (PR8)或H3N2 A X-31、A/Aichi/68 (X31)以2.5个卵感染单位(EIU)/细胞的剂量，在不含生长因子的DMEM/F12 (Gibco)培养基中感染。使用经紫外线 (UV) 照射的复制缺陷型病毒（模拟病毒）作为对照。感染后，将细胞在 37 °C 下孵育 1 小时，然后用 2 mL PBS 洗涤两次以去除未结合的病毒，并加入不含生长因子的培养基。在病毒感染期间和病毒感染后 1 小时，用 10 μM LOC14 预处理 MTEC 细胞 2 小时，DMSO 作为对照。所有处理均在不含生长因子的培养基中进行[2]。

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LOC 文库的高通量筛选。将浓度为 4 mg/mL 的化合物 LOC 母板解冻，并在使用前离心（215 × g，20 °C，1 分钟）。所有液体转移和混合均使用 Biomek FX 机器人液体分配器完成。将母板中2 μL化合物转移至含有98 μL不含选择剂遗传霉素的PC12培养基的384孔透明圆底聚丙烯深孔板（D1）中，制备出浓度为80 μL/mL（溶于2% (v/v) DMSO）的化合物复制子板（D1）。然后，将D1板中50 μL浓度为80 μL/mL的化合物转移至子板D2中50 μL PC12培养基中，混匀，重复此步骤制备剩余的三个子板，进行两倍系列稀释。最终，使用浓度分别为80 μL/mL、20 μL/mL和5 μL/mL的子板D1、子板D3和子板D5进行筛选。将经特布芬诺嗪诱导的PC12 mHTTQ103细胞以每孔7500个细胞的密度接种于384孔黑色透明底板中，每孔加入57 μL不含遗传霉素的PC12培养基。从子板（D1、D3和D5）中分别取3 μL化合物加入到实验板中，使最终化合物浓度分别为4、1和0.25 μL/mL。每块板中还设置4个含有未诱导PC12 mHTTQ103细胞的孔和4个仅含培养基的孔作为对照。实验板在37 °C、9.5% CO2条件下培养48小时。将20微升40% (v/v) Alamar Blue（货号DAL1100；Life Technologies）的PC12培养基溶液（终稀释度为1:10）加入每个孔中，并在37℃、9.5% CO2条件下孵育12-24小时。使用荧光酶标仪读取Alamar Blue的荧光值，激发波长为530 nm，发射波长为590 nm。每种化合物浓度均进行三次重复测试。[1]
对于PDI抑制剂，标准细胞检测方法是将细胞用测试化合物处理4-24小时。PDI活性通过测量PDI底物的氧化还原状态或使用细胞渗透性PDI活性探针进行评估。内质网应激标志物（例如，BiP/GRP78、CHOP、XBP1剪接）通过Western blot或qPCR进行检测。蛋白质折叠和聚集可通过免疫沉淀或去垢剂溶解度测定进行评估。

长期给予可逆、可穿透血脑屏障的小分子PDI调节剂LOC14（20 mg/kg/天）可显著改善N171-82Q亨廷顿病（HD）小鼠的运动功能，减轻脑萎缩并延长其生存期。此外，LOC14还能维持HD小鼠纹状体中多巴胺和环磷酸腺苷调节的分子量为32000的磷蛋白（DARPP32）的水平。机制研究表明，LOC14抑制了mHtt诱导的内质网应激，表现为抑制了HD模型中异常上调的内质网应激蛋白。这些研究结果表明，LOC14有望进一步优化用于亨廷顿病（HD）的临床试验，而调节内质网应激相关的信号通路可能是一种降低mHtt毒性并识别HD新治疗靶点的有效方法。[3]
对于PDI抑制剂的体内评估，标准动物模型包括内质网应激相关疾病模型，例如神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）、癌症和代谢紊乱。该化合物通常经口服或腹腔注射给药2-4周。评估指标包括内质网应激标志物、蛋白质聚集和疾病特异性终点。

LOC14 的分子量为 317.41，分子式为 C16H19N3O2S。其化学名称为 2-[[4-(环丙基羰基)-1-哌嗪基]甲基]-1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮。它在 DMSO 中的溶解度为 25 mg/mL (78.76 mM)，HPLC 纯度为 98%。需要进行全面的药代动力学研究才能进行治疗开发。

现有资料中未提供LOC14的详细毒理学数据。作为一种靶向PDI的研究化合物，其治疗开发需要进行标准的临床前毒理学研究。该化合物对正常组织中蛋白质折叠的影响也需要进行评估。该化合物仅供研究使用，不得用于治疗用途。

[1]. Small molecule-induced oxidation of protein disulfide isomerase is neuroprotective. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Apr 28;112(17):E2245-52.

[2]. Lung epithelial protein disulfide isomerase A3 (PDIA3) plays an important role in influenza infection, inflammation, and airway mechanics. Redox Biol. 2019 Apr;22:101129.

[3]. Small molecule modulator of protein disulfide isomerase attenuates mutant huntingtin toxicity and inhibits endoplasmic reticulum stress in a mouse model of Huntington's disease. Hum Mol Genet. 2018 May 1;27(9):1545-1555

蛋白二硫键异构酶 (PDI) 是一种内质网分子伴侣蛋白，在涉及蛋白质错误折叠的神经退行性疾病小鼠模型和患者脑组织中表达上调。然而，PDI 在这些疾病中的作用尚不明确。本文报道了一种可逆性神经保护先导化合物 (LOC)14 的发现，该化合物可作为 PDI 的调节剂。LOC14 的筛选方法包括对约 10,000 个先导化合物进行高通量筛选，以鉴定出能够有效挽救表达突变亨廷顿蛋白的 PC12 细胞活力的化合物；然后，通过体外筛选评估这些化合物对 PDI 还原酶活性的影响。等温滴定量热法和荧光实验表明，LOC14 与 PDI 的结合是可逆的，解离常数 (Kd) 为 62 nM，表明 LOC14 是迄今为止报道的最有效的 PDI 抑制剂。我们利用二维异核单量子相关核磁共振实验确定了LOC14的结合位点位于活性位点附近，并观察到LOC14的结合迫使PDI呈现氧化构象。此外，我们发现LOC14诱导的PDI氧化不仅在细胞培养中，而且在皮质纹状体脑片培养中也具有神经保护作用。LOC14在小鼠肝微粒体和血浆中表现出高稳定性、低固有微粒清除率和低血浆蛋白结合率。这些结果表明，LOC14是一种有前景的先导化合物，可用于评估在动物疾病模型中调节PDI的潜在治疗效果。[1]蛋白质二硫键异构酶（PDI）是一类氧化还原伴侣蛋白，可催化蛋白质中二硫键的形成或异构化。既往研究表明，PDIA3蛋白家族成员之一可与甲型流感病毒（IAV）血凝素（HA）相互作用，且该相互作用对于HA在体外的有效氧化折叠至关重要。然而，这些宿主-病毒蛋白相互作用是否发生在病毒感染过程中，以及此类相互作用是否可作为流感感染的潜在治疗靶点，目前尚不清楚。本研究证实，PDIA3在IAV感染的小鼠或人肺上皮细胞中特异性上调，且PDIA3与IAV-HA直接相互作用。使用PDI抑制剂LOC14处理可抑制肺上皮细胞中PDIA3的活性，并减少H1N1（A/PR8/34）和H3N2（X31，A/Aichi/68）感染的肺上皮细胞中HA的分子内二硫键形成及其后续的寡聚化（成熟）。二硫键形成的减少显著降低了病毒载量，并抑制了肺上皮细胞的促炎反应。在小鼠肺上皮细胞中特异性敲除PDIA3基因，显著降低了流感病毒（IAV）感染后的病毒载量和肺部炎症免疫标志物水平，并显著改善了气道力学。总之，这些结果表明PDIA3对于流感病毒在体内的有效致病性至关重要，PDIA3的药理学抑制有望成为流感大流行和严重流感季的一种新型抗流感治疗策略。[2] 亨廷顿病（HD）是由亨廷顿蛋白（HTT）基因中胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤（CAG）三核苷酸重复序列的扩增引起的，该基因编码亨廷顿蛋白（Htt）N端延伸的多聚谷氨酰胺序列，导致Htt错误折叠、异常蛋白聚集，并逐渐出现疾病症状。由突变型亨廷顿蛋白（mHtt）引起的内质网（ER）应激的慢性激活会导致细胞功能障碍，最终导致细胞死亡。蛋白二硫键异构酶（PDI）是一种位于内质网的分子伴侣蛋白。我们之前的研究表明，mHtt会导致PDI在与线粒体相关的内质网膜上积累，并诱导细胞死亡。然而，如在亨廷顿病（HD）的细胞和脑片模型中所报道的那样，PDI活性的小分子调节剂可以保护细胞免受mHtt的毒性作用。在本研究中，我们证实PDI在HD患者的脑组织、细胞和小鼠模型中高表达。长期给予可逆的、能够穿透血脑屏障的小分子PDI调节剂LOC14（20 mg/kg/天）可显著改善N171-82Q HD小鼠的运动功能，减少脑萎缩，并延长其生存期。此外，LOC14 维持了亨廷顿病 (HD) 小鼠纹状体中 DARPP32（一种受多巴胺和环磷酸腺苷调节的 32,000 分子量磷蛋白，是中等大小棘状神经元的标志物）的水平。机制研究表明，LOC14 通过抑制 HD 模型中异常上调的内质网应激蛋白，从而抑制 mHtt 诱导的内质网应激。这些发现提示 LOC14 可能在 HD 的临床试验中得到进一步优化，并且调节内质网应激反应的信号通路可能是降低 mHtt 毒性并寻找 HD 新治疗靶点的有效途径。[3]
LOC14 是一种强效、高亲和力的蛋白二硫键异构酶 (PDI) 抑制剂和调节剂。其 PDI 结合的 EC50 为 500 nM，Kd 为 62 nM。 LOC14抑制PDI的活性，并迫使PDI呈现氧化构象。该化合物是研究PDI在蛋白质折叠、内质网应激及相关疾病中功能的重要工具。目前尚未发现任何监管部门批准该化合物。

C16H19N3O2S

317.405962228775

317.12

C, 60.55; H, 6.03; N, 13.24; O, 10.08; S, 10.10

877963-94-5

877963-94-5

9117962

White to off-white solid powder

1.3

69.2Ų

0

4

3

22

460

0

YVBSNHLFRIVWFQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H19N3O2S/c20-15(12-5-6-12)18-9-7-17(8-10-18)11-19-16(21)13-3-1-2-4-14(13)22-19/h1-4,12H,5-11H2

2-[[4-(cyclopropanecarbonyl)piperazin-1-yl]methyl]-1,2-benzothiazol-3-one

LOC14; LOC 14; LOC-14; 2-[(4-cyclopropanecarbonylpiperazin-1-yl)methyl]-2,3-dihydro-1,2-benzothiazol-3-one; 2-[[4-(Cyclopropylcarbonyl)-1-piperazinyl]methyl]-1,2-benzisothiazol-3(2H)-one; LOC-14; CHEMBL4637290; 2-((4-(Cyclopropanecarbonyl)piperazin-1-yl)methyl)benzo[d]isothiazol-3(2H)-one; 2-[[4-(cyclopropanecarbonyl)piperazin-1-yl]methyl]-1,2-benzothiazol-3-one;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光。  (2). 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~50 mg/mL (~157.5 mM)
Water: ˂1 mg/mL
Ethanol: ~19 mg/mL (~60 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.55 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.55 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.55 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。