LOC14

PDI (Kd = 62 nM)

LOC-14（0.01-100μM；24小时）显示出抑制重组（r）PDIA3的能力，IC50约为5μM。经PDI抑制剂处理后，LOC14抑制了肺上皮细胞中的PDIA3活性，减少了分子内二硫键，随后在H1N1（a/PR8/34）和H3N2（X31，a/Aichi/68）感染的肺上皮细胞中HA的寡聚化（成熟）[2]。

---

LOC14是通过高通量筛选约10000种铅优化化合物来鉴定的，这些化合物可有效挽救表达突变亨廷顿蛋白的PC12细胞的存活率，然后在体外筛选中评估化合物对PDI还原酶活性的影响。等温滴定量热法和荧光实验表明，与PDI的结合是可逆的，Kd为62 nM，表明LOC14是迄今为止报道的最有效的PDI抑制剂。使用2D异核单量子相关NMR实验，我们能够将LOC14的结合位点定位为与活性位点相邻，并观察到LOC14的连接迫使PDI采用氧化构象。此外，我们发现LOC14诱导的PDI氧化不仅在细胞培养中，而且在皮质纹状体脑切片培养中都具有神经保护作用[1]。

LOC-14（灌胃口服；20mg/kg；每日一次；12-28周）延长了N171-82Q HD小鼠的存活时间，减轻了脑萎缩，并显著改善了运动功能。雄性N171-82Q HD小鼠是动物模型。每公斤20毫克。20mg/kg，每日口服一次，持续12至28周。因此，HD小鼠的运动性能得到了改善。LOC14是新制备的，首先将其与1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）混合，形成80mg/ml的储备溶液，然后用0.5%的甲基纤维素稀释至所需浓度（40倍稀释）[3]。

酶促胰岛素还原试验。[1]
该测定在384孔黑色透明底板中进行。每个孔含有80μL缓冲液A（10 mM Tris⋅HCl，pH 8，150 mM NaCl和2 mM EDTA）中的反应混合物，其中含有5μM PDIa、100μM牛胰岛素、350μM DTT和75μM测试化合物。所有实验均一式两份。将测定板在25°C下孵育1小时，然后在Tecan Infinite 200酶标仪上连续读取每个样品在650 nm处的吸光度，间隔5分钟，持续1小时。吸光度的增加表明胰岛素的β链聚集并从溶液中沉淀出来[1]。

细胞MTEC浓度：0.01μM；0.1μM；0.5μM；1μM；5μM；10μM；100μM 24小时潜伏期；结果：重组PDIA3活性降低。
如前所述，从年龄和性别匹配的野生型（WT）C57BL/6NJ小鼠中分离和培养原代MTEC。在DMEM/F12（Gibco）无生长因子培养基中，细胞以2×106个细胞/皿的密度铺板，当融合率大于90%时，感染小鼠适应的H1N1甲型流感病毒波多黎各8/34（PR8）或H3N2 A X-31，A/Aichi/68（X31），每细胞2.5个卵感染单位（EIU）。使用紫外线（UV）照射的复制缺陷病毒（模拟）作为对照。感染后，将细胞在37°C下孵育1小时，然后用2 mL PBS洗涤平板两次以去除未结合的病毒，并补充无生长因子的培养基。在病毒感染期间，MTEC用10μMLOC14预处理2小时，在病毒感染后1小时，DMSO用作对照。所有治疗均在无生长因子的培养基中进行[2]。

---

LOC图书馆的高通量屏幕。在使用前，将含有4 mg/mL化合物的LOC母板解冻并旋转（215×g，20°C，1分钟）。Biomek FX机器人液体分配器用于处理所有液体转移和混合。复制子板（D1）是通过将2μL化合物从母板转移到384个深井透明圆底聚丙烯板中制备的，该板含有98μL不含选择性试剂遗传霉素的PC12培养基，在2%（体积/体积）DMSO中获得80μL/mL的化合物浓度。通过将50μL化合物（80μL/mL）从D1板转移到子板D2中的50μL PC12培养基中，混合，然后对剩余的三个板重复该过程，在五个子板上进行两倍连续稀释。然后，将化合物浓度为80μL/mL的子板D1、化合物浓度为20μL/mL的子板D3和化合物浓度为5μL/mL时的子板D5用于筛选。通过将虫酰肼诱导的PC12 mHTQ103细胞接种到384孔的黑色透明底板中，在不含遗传霉素的57μL PC12培养基中以每孔7500个细胞的密度建立检测板。将三微升来自子平板（D1、D3和D5）的化合物加入到测定平板中，使最终化合物浓度分别为4、1和0.25μL/mL。每个平板上还包括四个含有未诱导的PC12 mHTQ103细胞的孔和四个仅含有培养基的孔作为对照。将测定板在37°C、9.5%CO2下孵育48小时。向每个孔中加入20微升40%（vol/vol）Alamar blue（目录号DAL1100；Life Technologies）PC12培养基溶液（1:10最终稀释），并在37°℃、9.5%CO2条件下再孵育12-24小时。在具有530nm激发滤光片和590nm发射滤光片的荧光板阅读器上读取Alamar蓝色荧光。每种化合物浓度都进行了三次测试。[1]

长期给予可逆、可穿透血脑屏障的小分子PDI调节剂LOC14（20 mg/kg/天）可显著改善N171-82Q亨廷顿病（HD）小鼠的运动功能，减轻脑萎缩并延长其生存期。此外，LOC14还能维持HD小鼠纹状体中多巴胺和环磷酸腺苷调节的分子量为32000的磷蛋白（DARPP32）的水平。机制研究表明，LOC14抑制了mHtt诱导的内质网应激，表现为抑制了HD模型中异常上调的内质网应激蛋白。这些发现提示LOC14有望进一步优化用于HD的临床试验，而调节内质网应激相关的信号通路可能是一种降低mHtt毒性并寻找HD新治疗靶点的有效策略。[3]

[1]. Small molecule-induced oxidation of protein disulfide isomerase is neuroprotective. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Apr 28;112(17):E2245-52.

[2]. Lung epithelial protein disulfide isomerase A3 (PDIA3) plays an important role in influenza infection, inflammation, and airway mechanics. Redox Biol. 2019 Apr;22:101129.

[3]. Small molecule modulator of protein disulfide isomerase attenuates mutant huntingtin toxicity and inhibits endoplasmic reticulum stress in a mouse model of Huntington's disease. Hum Mol Genet. 2018 May 1;27(9):1545-1555

蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 是一种内质网分子伴侣蛋白，在涉及蛋白质错误折叠的神经退行性疾病的小鼠模型和患者脑组织中表达上调。然而，PDI 在这些疾病中的作用尚未完全阐明。本文报道了一种可逆的、具有神经保护作用的先导化合物 (LOC)14 的发现，该化合物可作为 PDI 的调节剂。LOC14 的筛选方法是：首先对约 10,000 个先导化合物进行高通量筛选，筛选出能够有效挽救表达突变亨廷顿蛋白的 PC12 细胞活力的化合物；然后通过体外筛选评估化合物对 PDI 还原酶活性的影响。等温滴定量热法和荧光实验表明，LOC14 与 PDI 的结合是可逆的，解离常数 (Kd) 为 62 nM，表明 LOC14 是迄今为止报道的最有效的 PDI 抑制剂。利用二维异核单量子相关核磁共振实验，我们确定了LOC14的结合位点位于活性位点附近，并观察到LOC14的结合迫使PDI呈现氧化构象。此外，我们发现LOC14诱导的PDI氧化不仅在细胞培养中具有神经保护作用，而且在皮质纹状体脑片培养中也具有神经保护作用。LOC14在小鼠肝微粒体和血浆中表现出高稳定性、低固有微粒体清除率和低血浆蛋白结合率。这些结果表明，LOC14是一种有前景的先导化合物，可用于评估在动物疾病模型中调节PDI的潜在治疗效果。[1]

---

蛋白质二硫键异构酶（PDI）是一类氧化还原伴侣蛋白，可催化蛋白质中二硫键的形成或异构化。既往研究表明，PDIA3蛋白家族成员之一可与甲型流感病毒（IAV）血凝素（HA）相互作用，且该相互作用是HA在体外高效氧化折叠所必需的。然而，尚不清楚这些宿主-病毒蛋白相互作用是否发生在病毒感染期间，以及此类相互作用是否可作为治疗流感感染的潜在靶点。本研究表明，PDIA3在IAV感染的小鼠或人肺上皮细胞中特异性上调，且PDIA3可直接与IAV-HA相互作用。使用PDI抑制剂LOC14处理可抑制肺上皮细胞中PDIA3的活性，并减少H1N1（A/PR8/34）和H3N2（X31，A/Aichi/68）感染的肺上皮细胞中HA的分子内二硫键形成及其后续的寡聚化（成熟）。二硫键形成的减少显著降低了病毒载量，并抑制了肺上皮细胞的促炎反应。在小鼠肺上皮细胞中特异性敲除PDIA3基因，可显著降低流感病毒（IAV）感染后的病毒载量和肺部炎症免疫标志物水平，并显著改善气道力学。综上所述，这些结果表明PDIA3是体内流感病毒有效致病所必需的，而药理学抑制PDIA3有望成为流感大流行和严重流感季节的一种新型抗流感治疗策略。[2]

---

亨廷顿病（HD）是由亨廷顿蛋白（HTT）基因中胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤（CAG）三核苷酸重复序列的扩增引起的，该基因编码亨廷顿蛋白（Htt）N端一段延长的多聚谷氨酰胺序列，导致Htt错误折叠、异常蛋白聚集，并逐渐出现疾病症状。突变型Htt（mHtt）引起的内质网（ER）应激的慢性激活会导致细胞功能障碍，最终导致细胞死亡。蛋白二硫键异构酶 (PDI) 是一种位于内质网的分子伴侣蛋白。我们之前的研究表明，mHtt 会导致 PDI 在与线粒体相关的内质网膜上积累并诱导细胞死亡，而使用小分子调节 PDI 活性可以保护细胞免受 mHtt 毒性的影响，这在亨廷顿病 (HD) 的细胞和脑片模型中均有报道。在本研究中，我们证实 PDI 在 HD 患者脑组织、细胞和小鼠模型中均呈高表达。长期给予可逆的、可穿透血脑屏障的小分子 PDI 调节剂 LOC14（20 mg/kg/天）可显著改善 N171-82Q HD 小鼠的运动功能，减轻脑萎缩并延长其生存期。此外，LOC14 还能维持 HD 小鼠纹状体中多巴胺和环磷酸腺苷调节的分子量为 32,000 的磷蛋白 (DARPP32) 的水平，DARPP32 是一种中型棘状神经元标志物。机制研究表明，LOC14抑制了mHtt诱导的内质网应激，表现为抑制了HD模型中异常上调的内质网应激蛋白。这些发现提示LOC14有望进一步优化用于HD的临床试验，而调节应对内质网应激的信号通路可能是一种降低mHtt毒性和寻找HD治疗新靶点的有效方法。[3]

C16H19N3O2S

317.405962228775

317.12

C, 60.55; H, 6.03; N, 13.24; O, 10.08; S, 10.10

877963-94-5

877963-94-5

9117962

White to off-white solid powder

1.3

69.2Ų

0

4

3

22

460

0

YVBSNHLFRIVWFQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H19N3O2S/c20-15(12-5-6-12)18-9-7-17(8-10-18)11-19-16(21)13-3-1-2-4-14(13)22-19/h1-4,12H,5-11H2

2-[[4-(cyclopropanecarbonyl)piperazin-1-yl]methyl]-1,2-benzothiazol-3-one

LOC14; LOC 14; LOC-14; 2-[(4-cyclopropanecarbonylpiperazin-1-yl)methyl]-2,3-dihydro-1,2-benzothiazol-3-one; 2-[[4-(Cyclopropylcarbonyl)-1-piperazinyl]methyl]-1,2-benzisothiazol-3(2H)-one; LOC-14; CHEMBL4637290; 2-((4-(Cyclopropanecarbonyl)piperazin-1-yl)methyl)benzo[d]isothiazol-3(2H)-one; 2-[[4-(cyclopropanecarbonyl)piperazin-1-yl]methyl]-1,2-benzothiazol-3-one;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光。  (2). 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~50 mg/mL (~157.5 mM)
Water: ˂1 mg/mL
Ethanol: ~19 mg/mL (~60 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.55 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.55 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.55 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。