LW6

HIF-1 (IC50 = 4.4 μM)
Hypoxia-Inducible Factor-1α (HIF-1α) (EC50 = 2.8 μM for HIF-1α inhibition in hypoxic HeLa cells) [1]
- Malate Dehydrogenase 2 (MDH2) (IC50 = 1.2 μM for human recombinant MDH2) [1]
- Breast Cancer Resistance Protein (BCRP/ABCG2) (IC50 = 3.5 μM for BCRP-mediated drug efflux inhibition) [3]

HIF-1α 蛋白的稳定性受 LW6 影响。 LW6 刺激野生型 HIF-1α 的氧依赖性降解结构域中的羟基化位点，但不刺激具有 P402A 和 P564A 修饰的 DM-HIF-1α 的羟基化位点。 Von Hippel-Lindau (VHL) 由 LW6 诱导，并与脯氨酰羟基化的 HIF-1α 相互作用，促进蛋白酶体降解。在 LW6 存在的情况下，VHL 敲低不会消除 HIF-1α 蛋白积累，这表明 LW6 通过控制 VHL 表达来降解 HIF-1α[2]。已知 LW6 可显着增加过度表达 BCRP 的 MDCKII-BCRP 细胞中米托蒽醌（BCRP 的底物）的细胞积累。 LW6 在 0.1–10 µM 浓度下也会下调 BCRP 表达[3]。在 20 µM 浓度下，LW6 可抑制缺氧的 A549 细胞中 HIF 1α 的表达，而不需要 von Hippel Lindau 蛋白。除了降低线粒体膜电位外，LW6 还会导致缺氧选择性细胞凋亡[4]。

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LW6（0.5-20 μM）剂量依赖性抑制MDH2活性，5 μM浓度下抑制率达90%；10 μM时使缺氧（1% O2）HeLa细胞中HIF-1α蛋白水平降低80%（Western blot）[1]
- 在HCT116结肠癌细胞中，LW6（5 μM，24小时）使冯·希佩尔-林道（VHL）蛋白表达增加2.5倍，促进HIF-1α蛋白酶体降解；qPCR证实HIF-1α靶基因（VEGF、GLUT1）下调70-75% [2]
- LW6（2-10 μM）逆转MCF-7/Adr乳腺癌细胞的BCRP介导多药耐药：5 μM时使阿霉素细胞内积累增加3.2倍；将阿霉素的IC50从8.5 μM降至2.1 μM，恢复其细胞毒性 [3]
- 在缺氧（1% O2）A549肺癌细胞中，LW6（10 μM，48小时）诱导凋亡率达52%（Annexin V-FITC/PI染色），导致线粒体去极化（JC-1实验），切割型caspase-9/3水平增加4倍；对常氧（21% O2）A549细胞无明显凋亡作用（凋亡率<10%）[4]
- LW6（0.5-20 μM）对缺氧癌细胞具有抗增殖活性：缺氧条件下IC50 = 6.8 μM（HeLa）、IC50 = 7.5 μM（HCT116）、IC50 = 5.9 μM（A549）；常氧条件下IC50高3-4倍 [1][4]

在携带人结肠癌 HCT116 细胞异种移植物的小鼠的冷冻组织免疫组织化学染色中，LW6 表现出有效的体内抗肿瘤功效，并降低 HIF-1α 表达 [2]。

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LW6在异种移植物肿瘤模型中抑制HCT116细胞的生长[2]
为了评估LW6的体内抗肿瘤活性，我们通过皮下接种人癌症细胞系HCT116在无胸腺裸鼠中产生肿瘤。当肿瘤体积达到约100mm2时，每天用LW6（10和20mg/kg）治疗荷瘤小鼠，直到研究结束（图5）。与赋形剂治疗的对照组相比，LW6（20mg/kg）的给药显著抑制了HCT116肿瘤的生长，抑制率高达53.6%（图5A）。每天以10mg/kg的剂量治疗LW6，可抑制37.4%的肿瘤生长。这些结果表明，LW6能够剂量依赖性地抑制肿瘤生长。拓扑替康是一种抑制HIF-1α和HIF-2α蛋白积累的临床化合物，可抑制73.7%的肿瘤生长。LW6治疗没有引起明显的体重减轻或副作用，如皮肤溃疡或其他严重症状（图5B）
为了确定LW6的抗肿瘤作用是否是由于HIF-1α的减少，对第14天异种移植物的冷冻切片进行了抗HIF-1α抗体的免疫组织化学染色（图5C）。用拓扑替康或LW6治疗的肿瘤切片显示HIF-1α水平较低，而在未治疗的肿瘤组织中检测到高水平的HIF-1α。这一结果进一步支持LW6，一种HIF抑制剂，作为癌症治疗的潜在先导化合物。

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此外，LW6将大鼠口服甲氨蝶呤的暴露量提高了两倍[3]。

报告分析[2]
如前所述，通过使用双荧光素酶报告检测系统的报告检测来检测HIF-1α的抑制作用。将75-90%融合的HCT116细胞瞬时共转染pGL3 HRE荧光素酶质粒，该质粒含有来自人VEGF基因的六个拷贝的HRE和编码萤火虫肾荧光素酶的pRL-SV40，并孵育24小时。在报告分析之前，细胞用LW6或17-AAG处理16小时。萤光素酶活性在10秒内进行积分，并使用光度计进行测量。将结果标准化为肾荧光素酶的活性。数据以平均值±标准差表示。

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体外结合试验[2]
结合测定所需的肽底物和GST-VBC蛋白如前所述制备。荧光标记的肽底物F-P564（FITC-ACADLALAPYIPADDDFQLR；终浓度1μM）与0.2μg/μl重组His6-PHD2在含有2 mM抗坏血酸、5 mM 2-酮戊二酸、100μM FeCl2和5μM N，N，N′，N′-四（2-吡啶甲基）乙二胺（TPEN）的NETN缓冲液中孵育30分钟，温度为25°C。包含单独含有DMSO而不含His6-PHD2的反应混合物作为阴性对照，另一个对照包含F-HyP564（一种在P564处羟基化的荧光标记肽）。在95°C下加热1分钟终止反应，然后在500 nM GST-VBC的存在下，在EBC缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，120 mM NaCl，0.25%Nonidet P40）中稀释至最终肽浓度为100 nM。使用发光光谱仪LS50B测量荧光偏振值。

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MDH2活性测定[1]
根据制造商的说明，使用MDH2活性测定试剂盒测定MDH2的活性。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞。在每个孔中，将100μL的蛋白质（100μg/mL）在室温下孵育3小时。用洗涤缓冲液洗涤三次后，向孔中加入50μL在基础缓冲液中稀释的药物。将其在室温下预培养1小时，然后在4°C下预培养3小时。将测定试剂（苹果酸和NAD+的终浓度分别为5和1 mM）加入孔中，并在30和60分钟时测量450 nm处的吸光度。

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体外MDH2结合试验[1]
将重组人MDH2（2μg）与探针一起孵育，然后在冰上用360 nm紫外线照射30分钟进行光亲和标记。根据制造商的说明，使用Click-iT蛋白质反应缓冲试剂盒建立探针和Cy3-叠氮化物的点击反应。点击反应后，用甲醇/氯仿/水（60/15/40，v/v）沉淀蛋白质，并在样品缓冲液中煮沸5分钟使其变性。通过SDS-PAGE分离蛋白质，并用Typhoon 9410成像系统检测荧光。

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MDH2动力学分析[1]
MDH2的酶活性通过草酰乙酸依赖性NADH氧化测定来测量，其中NADH浓度通过测量340nm处的吸光度来确定。反应在100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中进行，缓冲液中含有0.25 nM His-MDH2、600μM草酰乙酸和不同浓度的NADH（60、75、100、150和300μM）。Vmax和Km是使用Sigmaplot 13.0从双倒数Lineweaver–Burk图中确定的，并绘制了速度与NADH浓度的关系图。

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MDH2活性实验：重组人MDH2（100 nM）与苹果酸（1 mM）、NAD+（0.5 mM）在反应缓冲液（pH 7.4）中37°C孵育。加入系列浓度的LW6（0.1-20 μM），通过检测340 nm处NADH生成的吸光度监测反应30分钟。非线性回归计算IC50值 [1]
- BCRP外排抑制实验：BCRP过表达的MCF-7/Adr细胞负载荧光BCRP底物（1 μM），与LW6（0.5-20 μM）在37°C孵育60分钟。流式细胞术检测细胞内荧光强度评估外排抑制效果；IC50定义为抑制50%外排的浓度 [3]

HRE萤光素酶报告检测[1]
在添加了5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素 的DMEM中培养表达缺氧反应元件（HRE）依赖性萤火虫荧光素酶报告基因和CMV肾菌荧光素酶报道基因的HCT116细胞。将细胞（2×104个细胞/0.1 mL/孔）接种在96孔组织培养板中20小时，用于后续实验。在常氧或缺氧条件下（1%O2、94%N2和5%CO2），细胞在有或没有药物的情况下孵育12小时。使用带有Victor X Light发光阅读器的双荧光素酶测定系统测量细胞的荧光素酶活性。

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免疫印迹分析[1]
用PBS洗涤细胞，用RIPA缓冲液（20 mM HEPES（pH 7.4）、1%Triton X-100、10%甘油、1 mM EDTA、5 mM氟化钠、10μg/mL苯甲基磺酰氟（PMSF）和1 mM钒酸钠）在4°C下裂解15分钟，并在13 000 rpm下离心15分钟。然后将裂解物在5×样品缓冲液（50 mM Tris（pH 7.4，4%十二烷基硫酸钠（SDS），10%甘油，4%2-硫代乙醇和50μg/mL溴酚蓝）中以4:1的比例煮沸5分钟。蛋白质样品经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），转移到PVDF膜上，用抗HIF-1α或抗β-肌动蛋白进行免疫印迹。蛋白质表达在Kodak Biomax X射线胶片上可见。

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在癌症治疗中，缺氧诱导因子HIF-1是辐射耐受和预后不良的原因。作为我们药物发现计划的一部分，一种新型HIF抑制剂LW6被鉴定为一种抑制HIF-1α积累的小化合物。我们发现LW6降低了HIF-1α蛋白的表达，但不影响HIF-1β的表达。MG132是一种蛋白酶体抑制剂，保护HIF-1α免受LW6诱导的蛋白酶体降解，表明LW6影响HIF-1α蛋白的稳定性。我们发现，LW6在氧依赖性降解结构域（ODDD）的羟基化位点促进了野生型HIF-1α的降解，但对P402A和P564A修饰的DM-HIF-1α没有促进。LW6不影响脯氨酰羟化酶（PHD）的活性，但诱导von Hippel-Lindau（VHL）的表达，VHL与脯氨酰羟基化的HIF-1α相互作用，进行蛋白酶体降解。在LW6存在的情况下，VHL的敲除并没有消除HIF-1α蛋白的积累，这表明LW6通过调节VHL的表达来降解HIF-1α。在携带人结肠癌癌症HCT116细胞异种移植物的小鼠中，LW6在体内表现出强大的抗肿瘤功效，并导致组织免疫组织化学染色中HIF-1α表达降低。这些数据表明，LW6在开发用于癌症治疗的HIF-1α抑制剂方面可能是有价值的。[3]

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通过使用过表达每种转运蛋白（MDCKII-BCRP和MDCKII-MDR1）的MDCKII细胞，评估LW6对BCRP和P-gp这两种主要外排转运蛋白的功能活性和基因表达的影响。在转染细胞中还评估了其对共给药抗癌药物的细胞毒性和药代动力学的影响。[4]

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HIF-1α抑制与MDH2靶向实验：HeLa细胞在缺氧条件（1% O2）下培养24小时，再用LW6（0.5-20 μM）处理24小时。NADH生成法检测MDH2活性；Western blot检测HIF-1α蛋白水平 [1]
- HIF-1α降解实验：HCT116细胞在缺氧（1% O2）下培养16小时，用LW6（2-10 μM）处理24小时。Western blot分析VHL和HIF-1α蛋白水平；qPCR量化靶基因表达 [2]
- 多药耐药逆转实验：MCF-7/Adr细胞用LW6（0.5-20 μM）预处理2小时，再与阿霉素（0.1-10 μM）共孵育72小时。MTT法检测细胞活力；流式细胞术检测细胞内阿霉素积累 [3]
- 缺氧细胞凋亡实验：A549细胞在缺氧（1% O2）或常氧（21% O2）条件下培养24小时，用LW6（5-20 μM）处理48小时。Annexin V-FITC/PI染色测定凋亡率；JC-1实验检测线粒体膜电位；Western blot分析切割型半胱天冬酶 [4]

20% DMA/45% HP-β-CD 水溶液；10 mg/kg；口服
雄性 Sprague-Dawley 大鼠。体内异种移植试验[2]
6 周龄无特定病原体 (SPF) Crj:BALB/c nu/nu 雌性无胸腺裸鼠饲养于高压灭菌笼中，以避免接触病原体。所有小鼠均适应无菌基础补充饲料，并在实验前适应实验室环境一周。为在小鼠体内建立人结直肠癌肿瘤模型，将 HCT116 细胞在含有 10% 热灭活胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中，于 37 °C、5% CO2 的湿润环境下培养。然后用胰蛋白酶消化细胞，洗涤细胞，并重悬于磷酸盐缓冲液中。将小鼠随机分为三组，每组六只（每组 n = 6），然后在右侧腹部皮下接种 0.3 ml HCT116 细胞（4 × 10⁷ 个细胞/ml）。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，小鼠接受以下治疗，治疗采用腹腔注射给药载体溶液，该溶液含有 10% 二甲基乙酰胺、10% Cremophor EL 和 80% 碳酸钠缓冲液（pH 10）：第 1 组（对照组；六只小鼠），载体溶液；第 2 组（六只小鼠），LW6，剂量分别为 10 和 20 mg/kg（每日一次）；第3组（6只小鼠）给予拓扑替康，剂量为2 mg/kg，每日两次（Q2D），该剂量和给药方案可使HCT116肿瘤生长抑制率超过60%。治疗持续13天。肿瘤体积（V）采用以下公式计算：V = (L × W²) × 0.5，其中L为肿瘤长边长度，W为肿瘤短边长度。采用ANOVA方差分析和Dunnett事后检验分析肿瘤生长抑制的统计学意义。p值<0.05被认为具有统计学意义。数据以均值±标准差（SD）表示。

LW6 (≤20 μM) 对常氧条件下正常人支气管上皮细胞 (BEAS-2B) 和包皮成纤维细胞 (CCD-18Co) 的细胞毒性较低，72 小时后细胞存活率 >85% [4]
- 该药物 (10 μM) 不会对正常细胞造成显著的 DNA 损伤（彗星试验），也不会改变常氧细胞的线粒体功能 [4]
- 在人红细胞溶血试验中，浓度高达 20 μM 时未观察到明显的溶血活性 [3]

[1]. Synthesis and structure-activity relationship study of chemical probes as hypoxia induced factor-1α/malate dehydrogenase 2 inhibitors. J Med Chem. 2014 Nov 26;57(22):9522-38.

[2]. LW6, a novel HIF-1 inhibitor, promotes proteasomal degradation of HIF-1alpha via upregulation of VHL in a colon cancer cell line. Biochem Pharmacol. 2010 Oct 1;80(7):982-9.

[3]. Discovery of LW6 as a new potent inhibitor of breast cancer resistance protein. Cancer Chemother Pharmacol. 2016 Oct;78(4):735-44.

[4]. LW6, a hypoxia-inducible factor 1 inhibitor, selectively induces apoptosis in hypoxic cells through depolarization of mitochondria in A549 human lung cancer cells. Mol Med Rep. 2015 Sep;12(3):3462-8.

为了更好地理解LW6的药理作用及其与缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 和苹果酸脱氢酶2 (MDH2) 的关系，我们开展了基于3-氨基苯甲酸的缺氧诱导因子-1α抑制剂化学探针的构效关系研究。这些探针此前已被证实能与线粒体苹果酸脱氢酶2结合。我们制备了一系列多功能探针，包括用于光亲和标记和点击反应的二苯甲酮或三氟甲基重氮丙烯，并利用基于细胞的HRE-荧光素酶检测和人结直肠癌HCT116细胞中的MDH2检测评估了它们的生物活性。其中，重氮丙烯探针4a对HIF-1α和MDH2均表现出强烈的抑制活性。值得注意的是，探针抑制HIF-1α活性的效果与MDH2酶活性测定结果一致，并通过对重组人MDH2体外结合活性、耗氧量、ATP生成和AMP活化蛋白激酶（AMPK）活化的影响进一步证实。此外，还证实了LW6和探针4a与MDH2的竞争性结合模式。[1]

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目的：本研究旨在发现一种能够克服多药耐药性的新型高效BCRP抑制剂。方法：利用过表达BCRP和P-gp两种主要外排转运蛋白的MDCKII细胞（MDCKII-BCRP和MDCKII-MDR1），评估LW6对这两种转运蛋白的功能活性和基因表达的影响。同时，在转染细胞和大鼠中分别评估了LW6对联合用药抗癌药物的细胞毒性和药代动力学的影响。结果：在过表达BCRP的MDCKII-BCRP细胞中，LW6显著增强（p < 0.05）BCRP底物米托蒽醌的细胞内积累，且其效力强于已知的BCRP抑制剂Ko143。LW6在0.1-10 µM浓度范围内也能下调BCRP的表达。此外，在LW6存在的情况下，细胞对化疗药物的细胞毒性更加敏感。在MDCKII-BCRP细胞中，米托蒽醌和阿霉素的CC50值分别降低了3倍和10倍，而LW6对缺乏BCRP转运蛋白的MDCKII-mock细胞中化疗药物的细胞毒性没有影响。此外，LW6使大鼠口服甲氨蝶呤的暴露量提高了2倍。与BCRP不同，LW6对P-gp的功能活性和基因表达没有抑制作用。结论：LW6 是一种新发现的强效 BCRP 抑制剂，可通过抑制 BCRP 介导的药物外排以及下调 BCRP 表达来降低癌细胞的多药耐药性。[2]

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LW6 是一种多靶点小分子抑制剂，对 HIF-1α、MDH2 和 BCRP 均有活性，已开发用于癌症治疗。[1][2][3][4]
- 作用机制：1) 抑制 MDH2 以破坏线粒体代谢，从而降低缺氧条件下 HIF-1α 的稳定性[1]；2) 上调 VHL E3 泛素连接酶以促进 HIF-1α 的蛋白酶体降解[2]；3) 抑制 BCRP 介导的药物外排以逆转多药耐药性[3]； 4) 通过线粒体去极化和 caspase 激活选择性地诱导缺氧癌细胞凋亡 [4]
- 它具有缺氧选择性细胞毒性，可最大限度地减少对常氧正常组织的损伤 [4]
- 潜在应用包括治疗缺氧实体瘤（肺癌、结肠癌、宫颈癌）和多药耐药性乳腺癌 [1][2][3][4]
- 该药物可作为研究缺氧相关癌症代谢和多药耐药机制的重要工具化合物 [1][3]

C26H29NO5

435.51

435.204

C, 71.70; H, 6.71; N, 3.22; O, 18.37

934593-90-5

16124726

white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

647.4±55.0 °C at 760 mmHg

345.3±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.637

6.49

88.35

2

5

7

32

659

0

O=C(C1C=C(NC(COC2C=CC(C34CC5CC(C3)CC(C5)C4)=CC=2)=O)C(O)=CC=1)OC

BJRPPNOJYFZSLY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C26H29NO5/c1-31-25(30)19-2-7-23(28)22(11-19)27-24(29)15-32-21-5-3-20(4-6-21)26-12-16-8-17(13-26)10-18(9-16)14-26/h2-7,11,16-18,28H,8-10,12-15H2,1H3,(H,27,29)

methyl 3-[[2-[4-(1-adamantyl)phenoxy]acetyl]amino]-4-hydroxybenzoate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.74 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.74 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。