MBX2329 HCl

流感病毒糖蛋白血凝素 (HA) 在病毒感染的早期阶段起着至关重要的作用，包括受体结合和膜融合，使其成为开发抗流感药物的潜在靶点。使用基于假型病毒的高通量筛选，我们已经鉴定出几种能够抑制流感病毒进入的新型小分子。我们优先考虑了两种新型抑制剂 MBX2329 和 MBX2546，分别具有氨基烷基苯酚醚和磺酰胺支架，可特异性抑制 HA 介导的病毒进入。这两种化合物 (i) 有效（50% 抑制浓度 [IC50] 为 0.3 至 5.9 μM）；(ii) 具有选择性（50% 细胞毒性浓度 [CC(50)] 为 >100 μM），对不同流感病毒株的选择性指数 (SI) 值为 >20 至 200； (iii) 抑制多种甲型流感病毒，包括 2009 年大流行性流感病毒 A/H1N1/2009、高致病性禽流感 (HPAI) 病毒 A/H5N1 和奥司他韦耐药性 A/H1N1 毒株；(iv) 与奥司他韦表现出很大的协同作用（36 和 331 μM(2) %，置信度为 95%）；(v) 具有化学易处理的结构。作用机制研究表明 MBX2329 和 MBX2546 均以不重叠的方式与 HA 结合。HA 介导的鸡红细胞 (cRBC) 溶血、与单克隆抗体 (MAb) C179 的竞争测定和突变分析的其他结果表明，这些化合物与 HA 三聚体的茎区结合并抑制 HA 介导的融合。因此，MBX2329 和 MBX2546 代表了化学优化的新起点，并有可能为研究 HA 介导的进入过程提供有价值的未来治疗选择和研究工具。

为了评估 MBX2329 和 MBX2546 的抗病毒活性范围，研究了这两种化合物对拉沙病毒 (LASV) 和埃博拉病毒 (EBOV) 入侵的抑制作用，这两种病毒也都带有与 HA 类似的 1 型包膜蛋白。使用假型平台是因为它可以直接比较 MBX2329 和 MBX2546 对抗 HIV/LASV-GP、HIV/EBOV-GP 和 HIV/HA(H5) 的活性。化合物 MBX2329 和 MBX2546 对 HIV/LASV-GP（IC90 为 ∼100 μM）、HIV/EBOV-GP（IC90 为 >100 μM）或 HIV/VSV-G（IC90 为 85 至 >100 μM）几乎没有抑制活性（表 2），表明它们特异性抑制流感病毒的进入。
MBX2329 和 MBX2546 是有效的亚型特异性抑制剂。
MBX2329 抑制了甲型 H1N1 流感病毒株 A/PR/8/34 (H1N1)、A/Florida/21/2008 (H1N1-H275Y)（奥司他韦耐药株）、A/Washington/10/2008 (H1N1) 和A/California/10/2009 (H1N1)（2009 年大流行毒株），IC50 介于 0.29 μM 和 0.53 μM 之间。同样，MBX2546 抑制甲型流感 H1N1 病毒株 A/PR/8/34 (H1N1) 和 A/Florida/21/2008 (H1N1-H275Y)（奥司他韦耐药株），IC50 分别为 0.3 μM 和 5.8 μM。MBX2546 还抑制其他 H1N1 毒株，包括 A/California/10/2009/H1N1（2009 年大流行毒株），IC50 介于 0.55 μM 和 1.5 μM 之间。 MBX2329 和 MBX2546 均能抑制高致病性禽流感 H5N1 病毒株 A/Hong Kong/H5N1，IC50 分别为 5.9 μM 和 3.6 μM。

---

MBX2329 和 MBX2546 与 HA 茎区中的 1 组 HA 特异性构象表位结合。
MBX2329 和 MBX2546 对具有 1 组 HA 的流感病毒的特异性抑制表明它们与 1 组 HA 相互作用。为了验证 HA 是否是这些化合物的靶标，我们使用 WaterLOGSY NMR 光谱研究了 MBX2329 和 MBX2546 与重组 H5 HA（1 组 HA）的结合情况，该光谱旨在检测小分子与高分子量靶标的结合情况。重组 NA 用作特异性对照。在图 3A 中，顶部光谱对应于 MBX2329 低场区域的 1D NMR 光谱，化合物的芳香共振用红色箭头表示。第二个光谱对应于在没有 HA 的情况下观察到的 MBX2329 的 WaterLOGSY 光谱（即对照实验），第三个光谱对应于在存在 H5 HA 的情况下观察到的 MBX2329 的 WaterLOGSY 光谱。在存在 H5 HA 的情况下，MBX2329 的相对较强的正相共振表明它与 HA 结合。相反，第四个光谱中没有信号，这对应于存在 NA 的情况下的 WaterLOGSY 实验，这表明 MBX2329 不与 NA 结合。

---

MAb C179 识别的构象抗原表位（HA1 亚基中的氨基酸位置 318 至 322 和 HA2 中的氨基酸位置 47 至 58）位于茎区，并且对具有 1 组 HA 的流感病毒具有特异性。为了进一步探索 1 组 HA 特异性区域中的氨基酸在与 MBX2329 和 MBX2546 结合中的潜在作用，我们通过丙氨酸扫描诱变生成了携带单个氨基酸替换的 HIV/HA(H5)，并检查了这些突变体对 MBX2329 和 MBX2546 的敏感性。如图 4E 所示，在 6.25 μM 浓度下，携带 HA1 中 K51A 突变或 HA2 中 G16A 突变的 HIV/HA(H5) 突变体不易受 MBX2329 抑制，表明 MBX2329 与 HA1 中的氨基酸残基 K51 和 HA2 中的氨基酸残基 G16 相互作用。有趣的是，在相同浓度下，没有一种突变体对 MBX2546 有抗性，进一步表明它们在 C179 识别的构象表位附近的不同位点结合。因此，综合起来，我们得出结论：(i) MBX2329 和 MBX2546 均与 HA 茎区中第 1 组 HA 特异性构象表位附近的 HA 结合，(ii) 结合位点在三聚体 HA 的茎区不重叠。结果与这些抑制剂阻断 HA 介导的膜融合的观点一致（见下文）。
MBX2329 和 MBX2546 抑制 HA 介导的融合。
根据上述结果，MBX2329 和 MBX2546 均与 HA 茎区结合，这是第 1 组 HA 特异性抗体的靶标，可破坏 HA 介导的膜融合过程 (50–55)。为了研究这些抑制剂在 HA 介导的融合中的作用，我们进行了血凝和溶血试验。
进行血凝试验以确定 MBX2329 和 MBX2546 是否阻止病毒与含有唾液酸 (SA) 的细胞表面受体结合。简而言之，将浓缩的甲型流感/PR/8/34 (H1N1) 病毒颗粒的 10 倍连续稀释液与鸡红细胞 (cRBC) 混合，使用不含抑制剂的纯病毒孔作为阳性对照，使用既不含病毒也不含抑制剂的孔作为阴性对照。此外，我们使用两种不同稀释度（1:10 和 1:25）的流感病毒 H1 HA (ATCC V-301-501-552) 抗血清作为对照。在 MBX2329 或 MBX2546 存在下进行的血凝实验结果与阳性对照（不含任何化合物）的结果相似，如图 5A 所示。因此，结果表明 MBX2329 和 MBX2546 均不抑制流感病毒与 cRBC 的结合。

---

使用甲型流感病毒 A/PR/8/34 (H1N1) 进行溶血试验，以确定 MBX2329 和 MBX2546 对融合的影响。为了引发溶血，病毒细胞悬浮液短暂酸化（pH 5.2）以引发 HA 构象变化，从而裂解 cRBC 释放血红蛋白。使用缺乏病毒的孔作为对照，以确定化合物对 cRBC 的影响。 MBX2329 和 MBX2546 均以剂量依赖性方式抑制酸诱导溶血（图 5B），MBX2329 和 MBX2546 的 IC50 分别为 2.1 μM 和 1.56 μM。因此，综合起来，结果表明 MBX2329 和 MBX2546 抑制病毒与内体膜的融合。这里我们还使用了抗流感病毒 H1 HA 的抗血清作为对照（数据未显示）。
MBX2329 和 MBX2546 与奥司他韦表现出很强的协同作用。
最后，根据先前描述的方法 (45, 46)，使用流感 A(H1N1) 病毒株 A/California/10/2009 评估了 MBX2329 和 MBX2546 与奥司他韦或金刚烷胺联合使用的协同作用。 MBX2329 和 MBX2546 与奥司他韦联合使用均表现出明显的协同抑制流感病毒感染作用 (MBX2329 为 331 ± 112 μM2%，MBX2546 为 36 ± 2.8 μM2%)，如浓度与协同作用的关系图所示。组合产生的大量协同作用具有统计学意义，如 95% 置信水平的数值所示 (表 4)。还使用与联合疗效研究相同的实验设计来评估细胞毒性，以评估协同细胞毒性。这些研究使用与抗病毒研究相同的 MDCK 细胞单层和相同的药物暴露。在这些研究中使用的浓度下，奥司他韦、MBX2329 或 MBX2546 均未观察到显著的细胞毒性 (未显示数据)。令人惊讶的是，观察到的协同作用仅限于 HA 抑制剂和奥司他韦的组合；而 HA 抑制剂和金刚烷胺的组合没有观察到显著的协同作用。

[1]. New small molecule entry inhibitors targeting hemagglutinin-mediated influenza a virus fusion. J Virol. 2014;88(3):1447-1460.

C16H26CLNO

283.836743831635

283.17

1438272-42-4

71526742

White to off-white solid powder

0

12.5

1

2

5

19

211

0

0

JMIAUPZSIMYFEG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H25NO.ClH/c1-2-15-9-5-6-10-16(15)18-14-13-17-11-7-3-4-8-12-17;/h5-6,9-10H,2-4,7-8,11-14H2,1H3;1H

1-[2-(2-ethylphenoxy)ethyl]azepane;hydrochloride

MBX2329; CHEMBL4077590; SCHEMBL14969476; EX-A4615; AKOS032954055; HY-131069A; BS-52166

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~880.78 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.33 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.33 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (7.33 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

配方 4 中的溶解度: 10% DMSO+40% PEG300+5% Tween-80+45% Saline: ≥ 2.08 mg/mL (7.33 mM)

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。