Not reported in the provided literature [1]

For CMIT/MIT mixture: mitochondria (electron transport chain complexes, oxidative phosphorylation); induces mitochondrial fragmentation via increased Drp1 Ser616 phosphorylation and decreased Mfn-1 expression [2]

MIT（2、4、8 μg/mL）处理24小时后，对BEAS-2B人支气管上皮细胞产生剂量依赖性细胞毒性，细胞活力分别降至对照组的81.0±3.8%、67.9±5.1%和35.1±5.2%[1]

MIT诱导细胞凋亡：早期凋亡比例在0、2、4和8 μg/mL浓度下分别为4.5±0.5%、4.1±0.4%、7.3±0.2%和9.0±0.4%；晚期凋亡比例分别为6.2±1.2%、6.6±0.7%、18.3±1.2%和39.4±0.7%。在相差显微镜下观察到了凋亡小体[1]

MIT 不引起细胞周期阻滞[1]

MIT 损害了细胞器的结构和功能：透射电镜图像显示，在 8 μg/mL 浓度下，细胞核内出现异常的双层膜形成，线粒体结构发生改变，核仁聚集[1]

在 8 μg/mL 浓度下，MIT 使线粒体体积增加至对照组的 119.3±2.0%，线粒体膜电位增加至对照组的 147.4±3.5%，而 ATP 生成呈剂量依赖性下降（在 8 μg/mL 浓度下几乎完全抑制）。内质网体积在 2、4 和 8 μg/mL 浓度下分别下降至对照组的 80.7±8.5%、69.8±18.8% 和 43.6±3.7%。 LDH释放未发生显著变化[1]

MIT在8 μg/mL浓度下使细胞内ROS水平升高至对照组的123.8±1.7%，NO水平降低（对照组17.3±1.3 μM，8 μg/mL 14.9±1.4 μM），过氧化氢酶活性升高（对照组6.7±0.1 nmol/μg，2 μg/mL 7.9±0.8 nmol/μg，4 μg/mL 8.0±1.1 nmol/μg，8 μg/mL 10.4±0.8 nmol/μg）[1]

微阵列分析（8 μg/mL MIT处理24 h）鉴定出232个下调基因（例如，组蛋白簇相关基因、microRNA1206、金属硫蛋白1F）和1197个上调基因（例如，MMP-1、MMP-3、MMP-10、FBJ骨肉瘤）。病毒癌基因同源物 B、角蛋白相关蛋白 4-12、小核仁 RNA）[1]

MIT 增加了炎症介质的分泌：IL-1β（对照组为 24.4±0.8 pg/mL，而 8 μg/mL 时为 150.6±12.4 pg/mL）、IL-6（201.0±52.3 pg/mL 对比 682.8±65.4 pg/mL）、IL-10、IFN-γ 和 IL-8。 MMP-1 和 MMP-3 水平也升高（MMP-1：92.1±2.7 vs 294.3±52.1 pg/mL；MMP-3：3.4±0.5 vs 62.7±38.6 pg/mL）[1]

MIT 增强了 Apaf-1、纤维蛋白（伴有聚集）、p-p53、细胞色素 C 和钠钾 ATPase 蛋白的表达。LC3-I 增强，但 LC3-II 不明显[1]

在 bEND.3 小鼠脑内皮细胞中，对于 CMIT/MIT 混合物（3:1）：处理 1 小时后，MTT 还原率在 LDH 泄漏之前显著降低。在 2.5 μg/mL 浓度下，LDH 泄漏在 3 小时后增加。 CMIT/MIT（1 和 2.5 μg/mL，处理 1 小时）显著增加线粒体活性氧（ROS）水平，降低线粒体膜电位（JC-1 染色），并减少线粒体质量（NAO 染色）。氧消耗率（OCR）在暴露后 20 分钟内即受到抑制，且这种抑制作用在洗脱后仍然存在。CMIT/MIT 降低了 Mfn-1 的表达，并增加了 Drp1 Ser616 的磷酸化水平，导致线粒体碎裂。线粒体自噬被激活（LC3BII/LC3BI 比值升高，线粒体与自噬体和溶酶体共定位）。 COX IV 蛋白水平在 2.5 μg/mL 时降低 [2]

在 hCMEC/D3 人脑内皮细胞中：CMIT/MIT（1 和 2.5 μg/mL，处理 1 小时）增加线粒体 ROS，降低 MMP，减少线粒体质量（2.5 μg/mL 时），并抑制 OCR（基础呼吸、ATP 生成、储备能力、最大呼吸）[2]

将 bEND.3 细胞与 CMIT/MIT 以及氧糖剥夺 (OGD) 或甲基乙二醛 (MG) 共同暴露，会加剧细胞损伤：增加 LDH 释放，降低 MTT 还原，增加 Drp1 磷酸化，降低 TEER。与 MG 共同暴露会降低乙二醛酶-2 的表达，并减少紧密连接蛋白 ZO-1、claudin-5 和 occludin 的表达 [2]

在雄性ICR小鼠（6周龄，每组4只）中，单次经气管内滴注MIT（0、25、50、100 μg/只）。滴注后第1天采集血液。血液学分析显示，与对照组相比，暴露于2 μg MIT的小鼠全血中中性粒细胞比例显著增加（初步试验）[1]

对于雄性SD大鼠（7-8周龄，230-300 g），通过尾静脉静脉注射生理盐水或CMIT/MIT（0.05和0.15 mg/kg体重），注射体积为0.4 mL。注射3小时后，分离脑组织。采用密度梯度离心法分离脑内皮细胞。与载体对照组相比，CMIT/MIT（0.15 mg/kg）显著降低了线粒体膜电位和线粒体质量，增加了线粒体活性氧（ROS）的产生，并降低了紧密连接蛋白ZO-1（降低0.472倍）、claudin-5（降低0.259倍）和occludin（降低0.558倍）的表达[2]

过氧化氢酶活性测定：将细胞沉淀物在冷的测定缓冲液中匀浆，并在4°C下以10,000g离心15分钟。将上清液与1 mM过氧化氢在25°C下反应30分钟，然后加入终止液。在540 nm处测量吸光度，并使用标准曲线计算数值[1]。

PAD活性不适用（MIT未报道酶靶点）。对于CMIT/MIT：使用细胞外通量分析仪监测线粒体耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。将细胞接种于XFp培养板上。测定培养基中含有5.5 mM葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠（用于bEND.3）；25 mM葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠（用于hCMEC/D3）。依次注射 CMIT/MIT、寡霉素、FCCP 和鱼藤酮/抗霉素 A。根据 OCR 曲线计算参数（基础呼吸、ATP 生成、最大呼吸、储备能力）[2]

细胞活力（MTT 法）：将 BEAS-2B 细胞（1×10⁴ 个细胞/mL）接种于 96 孔板中，过夜稳定后，加入不同浓度的 MIT（0、2、4、8 μg/mL）孵育 24 小时。移除培养基，加入不含 FBS 的培养基和 MTT，于 37°C 孵育 4 小时。用 DMSO 溶解甲臜，在 540 nm 波长处测定吸光度 [1]

细胞周期和凋亡：将 BEAS-2B 细胞（2×10⁵ 个细胞/mL）接种于 6 孔板中，加入不同浓度的 MIT（0、2、4、8 μg/mL）孵育 24 小时。细胞周期分析中，细胞用 70% 乙醇固定，并用 RNase 和 PI 处理。凋亡分析中，进行 Annexin V 和 PI 双染。通过流式细胞术分析[1]

氧化应激：MIT暴露后，细胞与羧基-DCF-DA孵育30分钟，通过流式细胞术测量荧光。NO水平：上清液与NO检测溶液反应，在540 nm处测定吸光度[1]

细胞器功能：使用MitoTracker Green FM和Red CMXRos评估线粒体质量和膜电位；使用ER Tracker Green评估内质网体积；流式细胞术。使用发光 ATP 检测试剂盒测定 ATP 生成量 [1]

免疫荧光：将 BEAS-2B 细胞接种于载玻片上，用多聚甲醛和甲醇固定，用 BSA 封闭，然后与一抗（钠钾 ATPase、纤维蛋白、Apaf-1、细胞色素 C、p-p53）孵育，再与荧光二抗孵育，用 DAPI 封片，通过共聚焦显微镜观察 [1]

ELISA：收集 MIT 处理 24 小时后的细胞上清液，使用 ELISA 试剂盒定量细胞因子（IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10）、趋化因子（IL-8、CXCL1）和 MMP（MMP-1、MMP-3），在 450 nm 波长处测定吸光度 [1]

对于 bEND.3 和 hCMEC/D3 细胞中的 CMIT/MIT：MTT 还原和 LDH 释放检测方法如下：氧化应激：DCF-DA荧光；GSH水平采用GSH-Glo试剂盒（发光法）测定；线粒体膜电位（JC-1）、线粒体活性氧（mtROS，MitoSOX Red）、线粒体质量（NAO）采用流式细胞术测定；Drp1、p-Drp1 (Ser616)、Mfn-1、Mfn-2、LC3B、COX IV的Western blot检测；MitoTracker和Lysotracker共定位的共聚焦显微镜观察；线粒体形态的透射电镜观察；跨上皮电阻（TEER）用于评估屏障功能，使用Transwell小室和EVOM2电压表[2]

对于MIT气管内滴注：将6周龄雄性ICR小鼠（每组4只）用异氟烷麻醉。通过气管单次滴注100 μL MIT（0、25、50、100 μg/只）。滴注后第1天处死小鼠。在麻醉状态下从腹主动脉取血。使用血液自动分析仪进行血液学分析[1]。

对于CMIT/MIT静脉给药：使用雄性SD大鼠（7-8周龄，230-300 g）。将CMIT/MIT溶液用生理盐水（0.9%氯化钠）稀释。通过尾静脉静脉注射生理盐水或稀释的CMIT/MIT（0.05和0.15 mg/kg体重）溶液，注射体积为0.4 mL。注射3小时后，小心分离脑组织。通过匀浆、Ficoll和葡聚糖密度梯度离心分离脑内皮细胞，然后用PECAM（CD31）和NeuN染色进行鉴定。流式细胞术证实内皮细胞纯度较高（约92.0% CD31阳性）[2]

毒性概述
识别和用途：5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮 (CMI) 会形成晶体。它用作化妆品、卫生用品、油漆、乳液、切削油、纸张涂料以及储水和冷却系统中的抗菌防腐剂。CMI 也用于水力压裂液。它在美国注册为杀虫剂，但批准的杀虫剂用途可能会定期变更，因此务必咨询联邦、州和地方当局以了解当前的批准用途。CMI 通常与 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮 (MI) 联合使用。人体暴露和毒性：Kathon CG 是一种化妆品防腐剂，其活性成分为 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，似乎是欧洲接触性皮炎的常见病因。动物实验：将溶于玉米油的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMI/MIT）混合物灌胃给予雄性和雌性大鼠，剂量分别为0、0.26、0.78、2.33和7.0 mg/kg体重/天。在最高CMIT/MIT暴露剂量下，雄性大鼠血清甘油三酯水平降低，雌性大鼠肝脏I期异生物质代谢酶活性增强，并伴有轻微的肝脏组织学改变。CMI/MIT混合物可诱导缺乏大鼠肝脏代谢系统的细菌（TA 100菌株）和培养的哺乳动物细胞发生点突变。在存在大鼠肝脏代谢系统的情况下，诱导培养的哺乳动物细胞发生点突变所需的浓度提高了10倍。在代谢系统和鼠伤寒沙门氏菌中均未观察到诱变活性。果蝇性连锁隐性致死性试验、小鼠体内细胞遗传学试验、培养大鼠肝细胞非程序性DNA合成试验以及体外细胞转化试验均获得阴性结果。在免疫毒性研究中，蛋白结合的CMI可诱导耳淋巴结细胞增殖反应，而蛋白结合力较弱的MI在相似浓度的CMI下既不刺激增殖，也不诱导淋巴结肿大。

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相互作用
我们此前报道，HL60细胞短暂暴露于5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMI）和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MI）的混合物中可诱导氧化应激，从而诱导细胞凋亡和坏死。本研究通过流式细胞术分析发现，CMI/MI可诱导钙稳态早期紊乱，导致胞质和线粒体钙浓度升高，以及内质网钙池耗竭。钙螯合剂BAPTA-AM可减轻坏死剂量CMI/MI诱导的坏死和继发性坏死，以及线粒体膜电位（ΔΨm）和S-谷胱甘肽化的丧失，但不能抑制CMI/MI诱导的细胞凋亡、线粒体钙摄取和线粒体超极化。这表明胞质钙浓度升高并非细胞凋亡的直接原因，而是内质网与线粒体之间的相互作用可能是诱导细胞凋亡的关键因素。 GSH-OEt预处理可提高细胞内GSH水平，降低S-谷胱甘肽化水平，并降低细胞质和线粒体钙离子水平，从而保护细胞免于凋亡和坏死，并促进细胞凋亡。因此，GSH消耗程度与蛋白质S-谷胱甘肽化水平密切相关，并可能在钙离子水平升高中起因果作用。线粒体钙离子水平升高可能是细胞凋亡的原因，而坏死则与细胞质钙超载有关。这些发现表明，特定蛋白质的S-谷胱甘肽化在钙离子和氧化还原信号之间起着分子连接作用。

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MIT：在BEAS-2B细胞中，浓度为2、4和8 μg/mL时，LDH释放（膜完整性标志物）未发生显著变化，表明在这些条件下未发生坏死性细胞死亡[1]

[1]. Methylisothiazolinone induces apoptotic cell death via matrix metalloproteinase activation in human bronchial epithelial cells. Toxicol In Vitro. 2020 Feb;62:104661.

[2]. Functional and dynamic mitochondrial damage by chloromethylisothiazolinone/methylisothiazolinone (CMIT/MIT) mixture in brain endothelial cell lines and rat cerebrovascular endothelium. Toxicol Lett. 2022 Aug 1;366:45-57.

[3]. Methylisothiazolinone: dermal and respiratory immune responses in mice. Toxicol Lett. 2015 Jun 15;235(3):179-88.

[4]. Effects of chloromethylisothiazolinone/methylisothiazolinone (CMIT/MIT) on Th2/Th17-related immune modulation in an atopic dermatitis mouse model. Sci Rep. 2020 Mar 5;10(1):4099.

4-异噻唑啉酮 (MCI) 是一种 1,2-噻唑类化合物，其结构为 4-异噻唑啉-3-酮，由连接在氮原子上的甲基和连接在 C-5 位上的氯原子组成。它是一种强效杀菌剂和防腐剂，也是商业产品 Kathon™ 的主要活性成分。它具有抗菌、异生素耐受和环境友好等特性。它属于 1,2-噻唑类化合物和有机氯化合物。其功能与甲基异噻唑啉酮相关。甲基氯异噻唑啉酮 (MCI) 是一种常用的异噻唑啉酮类化合物，具有抗菌和抗真菌特性，常用作防腐剂。它存在于许多市售化妆品、乳液和卸妆产品中。此外，它是一种已知的皮肤致敏剂和过敏原。其部分副作用包括皮肤脱皮或鳞屑、皮疹、发红或瘙痒，以及眼周中度至重度肿胀。美国接触性皮肤病协会将甲基氯异噻唑啉酮 (MCI) 评为 2013 年度接触性过敏原。可通过临床斑贴试验识别对甲基氯异噻唑啉酮的敏感性。甲基氯异噻唑啉酮是一种标准化的化学过敏原。其生理效应是通过增加组胺释放和细胞介导的免疫反应实现的。另见：氯化镁（注：已移至此处）。

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药物适应症
甲基氯异噻唑啉酮获准用于过敏性皮肤斑贴试验，以辅助诊断 6 岁及以上人群的过敏性接触性皮炎 (ACD)。

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甲基氯异噻唑啉酮 (MIT) 是一种用作防腐剂的异噻唑啉酮类杀菌剂。在韩国，人们怀疑 MIT 会诱发与加湿器消毒剂使用相关的特发性肺纤维化。本研究表明，MIT可通过激活基质金属蛋白酶诱导人支气管上皮细胞凋亡和炎症反应。KEGG通路分析提示MIT暴露可能具有致癌作用[1]

CMIT/MIT是氯甲基异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮的3:1混合物，用作消费品和加湿器消毒剂中的杀菌剂。本研究表明，CMIT/MIT会损害脑内皮细胞的线粒体功能和动力学，导致屏障功能障碍。亚阈值病理刺激，例如缺氧（OGD）或糖化应激（甲基乙二醛），会增强这些作用。大鼠静脉注射CMIT/MIT可诱导脑内皮细胞线粒体损伤和紧密连接蛋白减少[2]

C4H5NOS

115.15

115.009

2682-20-4

Methylisothiazolinone hydrochloride;26172-54-3

33344

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

182.8±23.0 °C at 760 mmHg

254-256 °C(lit.)

64.3±22.6 °C

0.8±0.3 mmHg at 25°C

1.589

0.05

50.24

0

2

0

8

156

0

DHNRXBZYEKSXIM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C4H4ClNOS/c1-6-4(7)2-3(5)8-6/h2H,1H3

2-methyl-3(2H)-isothiazolone

MI N-Methylisothiazolin-3-oneMethylisothiazolinone free base KB-838

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~868.43 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (21.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (21.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (21.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。