ML-792

SAE/SUMO1(IC50= 3 nM);SAE/SUMO2(IC50= 11 nM)
SUMO-activating enzyme (SAE) – Heterodimer of SAE1 and UBA2 (IC₅₀ = 0.003 µM with SUMO1, 0.011 µM with SUMO2 in ATP-PPi exchange assay) [1]

在 HCT116 细胞中，ML-792（0.0007-5 μM；4 小时）抑制 SAE 和 SUMO 途径的活性[1]。
MDA-MB-中的 ML-792（0.001-10 μM；72 小时） 468、MDA-MB-231、HCT116、Colo-205 和 A375 降低癌细胞活力并抑制细胞增殖[1]。

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ML-792 是一种基于作用机制的、强效且选择性的SUMO激活酶 (SAE) 抑制剂。在ATP-无机焦磷酸 (PPi) 交换生化实验中，当使用SUMO1或SUMO2作为泛素样蛋白时，它抑制SAE活性的IC₅₀值分别为0.003 µM和0.011 µM。它对密切相关的E1酶NEDD8激活酶 (NAE, IC₅₀ = 32 µM) 和泛素激活酶 (UAE, IC₅₀ > 100 µM) 具有高选择性。在1 µM浓度下对一组366种ATP利用酶的筛选未显示显著抑制。该化合物通过由SAE自身催化的ATP依赖性方式与SUMO形成共价加合物来抑制SAE，这一点已通过质谱分析和特异性抗ML-792抗体的免疫印迹证实。[1]
在HCT116结肠癌细胞系的细胞实验中，ML-792 处理导致SAE (UBA2-SUMO) 和E2 (UBC9-SUMO) 硫酯水平呈剂量依赖性下降 (EC₅₀分别为0.004 µM和0.006 µM)，以及全局SUMO化水平下降 (EC₅₀ = 0.019 µM)。它还降低了特定底物TRIM28 (EC₅₀ = 0.016 µM) 和RanGAP1 (EC₅₀ = 0.051 µM) 的SUMO化。细胞中SUMO-ML-792加合物的形成得到确认 (EC₅₀ = 0.003 µM)。抑制作用迅速 (2小时内) 且持续至少48小时。ML-792 不影响细胞中的NEDD8或泛素途径。[1]
ML-792 处理破坏了早幼粒细胞白血病 (PML) 核体 (NB) 的组织结构，并以剂量依赖性方式导致HCT116细胞中相关蛋白DAXX的重新分布 (PML NB大小减少的EC₅₀ = 0.095 µM，DAXX foci减少的EC₅₀ = 0.007 µM)。[1]
在基于ATP的细胞活力测定中，ML-792 处理72小时后，以剂量依赖性方式降低了多种肿瘤细胞系的细胞活力，EC₅₀值从0.06 µM (MDA-MB-468) 到0.45 µM (A375) 不等。在许多细胞系中，活力损失在达到100%之前趋于平缓。[1]
在2D克隆形成实验 (贴壁依赖) 中，用ML-792 连续处理7-9天，在HCT116 (EC₅₀ = 0.04 µM) 和MDA-MB-231 (EC₅₀ = 0.11 µM) 细胞中显示出强大的抗增殖作用。它也在HCT116细胞的3D软琼脂实验 (非贴壁依赖) 中显著抑制了克隆形成 (EC₅₀ = 0.03 µM)。[1]
在构建了四环素诱导型MYC癌基因的SK-MEL-28黑色素瘤细胞中，MYC诱导后对ML-792 的敏感性增加。MYC过表达时，活力曲线平台期从60%降至14%，并观察到凋亡标记物 (cleaved caspase-3, cleaved PARP) 增加。具有高内源性MYC水平的小细胞肺癌 (SCLC) 细胞系 (NCI-H82, NCI-H524) 也显示出比低MYC水平细胞系 (59-62%) 更低的活力平台期 (33-42%)。[1]
通过RNA-seq评估，ML-792 处理 (0.5 µM, 16小时) 在Colo-205、HCT116和MDA-MB-231细胞中仅诱导了轻微且细胞系特异性的转录变化 (仅17-102个基因变化>2倍)。类似地，在HCT116细胞中进行的定量蛋白质组学分析 (SILAC) 显示，处理24小时后变化极小 (>8000个蛋白质中仅约30个积累>2倍)。[1]
在正常条件下，通过彗星实验或γH2AX和53BP1 foci的形成测量，ML-792 对SUMO通路的持续抑制并未导致HCT116细胞中DNA损伤的积累。此外，它不影响顺铂或羟基脲诱导的DNA损伤的修复。[1]
ML-792 处理诱导了严重的有丝分裂缺陷。对HCT116细胞超过96小时的延时显微镜观察揭示了多核化、胞质分裂受损、有丝分裂滑脱以及有丝分裂期间或之后的细胞死亡。流式细胞术显示在24小时和48小时时具有8n DNA含量 (核内复制) 的细胞积累。在四个细胞系 (HCT116, MDA-MB-468, Colo-205, MDA-MB-231) 中处理24小时后对有丝分裂阶段的分析显示，其中三个细胞系处于后期/末期的细胞比例显著下降，并出现连接细胞核的细DNA桥。这些有丝分裂缺陷被证实是靶点作用，因为它们可以被表达ML-792 抗性的UBA2 (S95N M97T) 突变体所挽救。[1]
在非转化的MCF-10A乳腺上皮细胞中，尽管SUMO通路抑制程度相同，ML-792 仅在增殖 (亚汇合) 条件下触发活力丧失和细胞周期变化，而在接触抑制 (汇合) 条件下则没有。[1]
在HCT116细胞中的联合研究表明，当与有丝分裂抑制剂长春新碱、紫杉醇或多西他赛联合使用时，ML-792 具有相加效应，但没有协同增效作用。[1]

使用ATP-PPi交换实验评估ML-792 在体外对SAE及相关E1酶的抑制活性。将化合物在含有实验缓冲液 (50 mM HEPES pH 7.5, 25 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 0.05% BSA, 0.01% Tween-20, 1 mM TCEP) 的96孔板中进行系列稀释。加入含有SAE酶 (2 nM)、ATP (1 mM) 和PPi (0.1 mM，含痕量[³²P]PPi) 的反应混合物。通过添加SUMO1或SUMO2 (1 µM) 启动反应，并在37°C孵育60分钟。用三氯乙酸终止反应。终止的反应转移至装有活性炭滤纸的点样装置中，洗涤、干燥并使用磷屏成像仪定量。IC₅₀值根据背景校正后的计数计算。NAE和UAE的实验在类似条件下进行，使用适当的酶和底物浓度。[1]
通过完整蛋白质质谱法确认了共价SUMO-ML-792加合物的形成。将ML-792 (10 µM) 与SAE (4 µM)、ATP (100 µM)、MgCl₂ (10 mM) 和SUMO1 (4 µM) 在HEPES缓冲液中于37°C孵育60分钟。反应用EDTA终止，酸化后通过LC-MS分析。同时进行了不含ATP的对照反应。[1]

细胞系：人黑色素瘤细胞系A37；人结肠癌细胞HCT116和Colo-205；人乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231。
浓度：0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 μM
孵育时间：72小时
结果：活力效应显示呈剂量依赖性，EC50 值范围为 MDA-MB-468 细胞中的 0.06 μM 至 A375 细胞中的 0.45 μM。

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通过蛋白质印迹法检测硫酯水平和全局SUMO化来评估细胞中SUMO通路的抑制。用ML-792 处理HCT116细胞4小时，裂解后通过非还原性SDS-PAGE和针对UBA2、UBC9、SUMO2/3以及特异性SUMO化蛋白 (TRIM28, RanGAP1) 的抗体进行免疫印迹分析。还使用了针对ML-792-SUMO加合物的抗体。对条带强度进行定量，用α-微管蛋白标准化，并用于计算EC₅₀值。[1]
通过免疫荧光分析PML核体和DAXX定位。将生长在盖玻片上的HCT116细胞用ML-792 处理，固定、透化，并用抗PML或抗DAXX抗体染色，然后是荧光二抗和Hoechst 33342。通过荧光显微镜捕获图像，并使用图像分析软件定量每个细胞核的PML核体大小或DAXX foci数量。[1]
使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法测定细胞活力。将细胞接种于96孔板，用ML-792 的系列稀释液处理72小时，然后测量发光值。对于组合研究，将HCT116细胞接种于384孔板，用ML-792 和其他化合物 (如有丝分裂抑制剂) 单独或联合处理72小时后评估活力。[1]
进行2D克隆形成实验，将少量细胞 (500个HCT116或1000个MDA-MB-231) 接种于12孔板，并用ML-792 连续处理7天。克隆固定后用结晶紫染色、成像，并量化总克隆面积。[1]
进行3D软琼脂克隆形成实验，将HCT116细胞悬浮于含0.4%琼脂的生长培养基中，并铺于24孔板中已固化的1%琼脂层上。用ML-792 或DMSO处理平板，孵育10-14天。对克隆数量和面积进行计数。[1]
对于细胞周期分析，用ML-792 处理细胞，用乙醇固定，用碘化丙啶和RNase A染色，并通过流式细胞术分析DNA含量分布。[1]
使用延时显微镜追踪细胞命运。将用DMSO或ML-792 处理的HCT116细胞置于自动化显微镜的腔室中，每5分钟成像一次，持续超过96小时。处理图像，并手动记录和分析单个细胞进入和退出有丝分裂的情况。[1]
有丝分裂阶段定量通过固定处理后的细胞，用Hoechst 33342染色DNA，并在荧光显微镜下根据核形态将有丝分裂细胞视觉分类为前期/前中期、中期或后期/末期阶段。每个样本至少计数140个有丝分裂细胞。[1]
对在指定时间 (例如8小时、16小时、48小时) 用DMSO或ML-792 处理的细胞进行RNA测序以进行转录组分析。分离总RNA，构建文库并测序。分析差异基因表达和选择性剪接。[1]
使用SILAC (细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记) 进行蛋白质组学分析。用"轻"或"重"同位素标记的赖氨酸和精氨酸对HCT116细胞进行代谢标记9天。然后将标记的细胞用DMSO或ML-792 处理24小时，根据细胞计数1:1混合，裂解，用胰蛋白酶消化，分馏，并通过LC-MS/MS分析。量化蛋白质比率。[1]
使用碱性彗星实验评估DNA损伤。用ML-792 单独或与DNA损伤剂 (顺铂、羟基脲) 联合处理HCT116细胞。收集细胞，包埋在载玻片的琼脂糖中，裂解，进行碱性电泳，中和，固定，用SYBR Green染色并成像。分析彗星尾矩。也对处理后的细胞进行了DNA损伤标记物 (γH2AX, 53BP1, BRCA1) 的免疫荧光分析。[1]

[1]. Probing the roles of SUMOylation in cancer cell biology by using a selective SAE inhibitor. Nat Chem Biol. 2017 Nov;13(11):1164-1171.

ML-792 ((1R,2S,4R)-4-((5-(1-(3-bromobenzyl)-1H-pyrazole-3-carbonyl)pyrimidin-4-yl)amino)-2-hydroxycyclopentyl)methyl sulfamate) is a small-molecule, mechanism-based inhibitor of the SUMO-activating enzyme (SAE). It is the first reported potent and selective SAE inhibitor with nanomolar activity. Its mechanism involves forming a covalent adduct with SUMO in an ATP-dependent reaction catalyzed by SAE itself, analogous to the NAE inhibitor pevonedistat (MLN4924). [1]
ML-792 is presented as a powerful chemical tool to study SUMOylation biology at the endogenous level, overcoming limitations of genetic knockdown/knockout and previous less potent/non-specific inhibitors. [1]
The study demonstrates that SUMOylation is critical for cancer cell proliferation, mitotic progression, and accurate chromosome segregation. Inhibition by ML-792 leads to mitotic failure, endoreduplication, and DNA bridge formation. [1]
Cells with high MYC oncogene activity (induced or endogenous) show increased sensitivity to ML-792, confirming a synthetic lethal interaction and suggesting a potential therapeutic application for SAE inhibitors in MYC-amplified tumors. [1]
The on-target activity of ML-792 was confirmed by the rescue of SUMOylation loss and mitotic defects through expression of an ML-792-resistant UBA2 mutant (S95N M97T). [1]

C21H23BRN6O5S

551.413522005081

550.063

C, 45.74; H, 4.20; Br, 14.49; N, 15.24; O, 14.51; S, 5.81

1644342-14-2

86566743

White to off-white solid powder

1.7±0.1 g/cm3

815.1±75.0 °C at 760 mmHg

446.7±37.1 °C

0.0±3.1 mmHg at 25°C

1.740

1.71

171

3

10

9

34

801

3

BrC1=CC=CC(=C1)CN1C=CC(C(C2=CN=CN=C2N[C@H]2C[C@@H]([C@@H](COS(N)(=O)=O)C2)O)=O)=N1

PZCKLTWSXFDLLP-OGWOLHLISA-N

InChI=1S/C21H23BrN6O5S/c22-15-3-1-2-13(6-15)10-28-5-4-18(27-28)20(30)17-9-24-12-25-21(17)26-16-7-14(19(29)8-16)11-33-34(23,31)32/h1-6,9,12,14,16,19,29H,7-8,10-11H2,(H2,23,31,32)(H,24,25,26)/t14-,16-,19+/m1/s1

((1R,2S,4R)-4-((5-(1-(3-bromobenzyl)-1H-pyrazole-3-carbonyl)pyrimidin-4-yl)amino)-2-hydroxycyclopentyl)methyl sulfamate

ML-792; ML 792; ML792

2934.99.03.00

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL ( ~181.35 mM )

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.77 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.77 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.77 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。