ML130 (Nodinitib-1)

NOD1 (IC50 = 0.56 μM)
The target of ML130 (Nodinitib-1) is nucleotide-binding oligomerization domain 1 (NOD1), a cytosolic pattern-recognition receptor involved in mediating inflammatory responses.
- In HEK293T cells transfected with NOD1 and NF-κB luciferase reporter plasmid, the half-maximal inhibitory concentration (IC50) of ML130 against NOD1-mediated NF-κB transcriptional activity (stimulated by NOD1 agonist iE-DAP) was approximately 2.5 μM [1]
- In HT-29 human colorectal adenocarcinoma cells (endogenously expressing NOD1), the IC50 of ML130 for inhibiting NOD1-mediated interleukin-8 (IL-8) secretion (stimulated by iE-DAP) was approximately 1.8 μM. No significant inhibitory activity was observed against NOD2 (a homologous protein of NOD1) -mediated IL-8 secretion even at concentrations up to 20 μM, indicating selectivity for NOD1 [2]
No inhibitory activity of ML130 against receptor-interacting protein 2 (RIP2) kinase (a downstream signaling molecule of NOD1) was detected, suggesting it does not target RIP2 directly [2]

ML130 在 HEK293 细胞中显示出选择性抑制 NOD1 诱导的 NF-κB 激活，且无细胞毒性，被选为探针候选分子。通过选择性抑制 NOD1 依赖性 IL-8 分泌以及选择性抑制 NOD1 依赖性 NF-κB 激活途径，二级检测也证实了 ML130。另一项研究证明，ML130 可在体外引起 NOD1 构象变化，并改变细胞中 NOD1 的亚细胞靶向，为探究 NOD1 活性调节机制提供化学探针，并为探索 NOD1 在各种感染性和炎症性疾病中的作用提供工具。 1 程序 1) 在 100% 汇合时收获 HEK-293-T NFKB-Luc。 2) 使用 Multidrop 添加 NOD 测定介质。 3) 在离心机中以 1000 rpm 的速度旋转板 1 分钟。 4)连续化合物稀释。 5) 将 0.75 ug/mL 的 gamma-tri-DAP 添加到细胞悬液中。 6) 将 13000 个细胞/孔以 4 uL/孔的量接种到全板 HEK-293-T NFKB-Luc 到 TC 处理的板中。 7) 在离心机上以 500 RPM 将板旋转 5 分钟。 8) 盖板。将 4 个板夹在 2 个装有 H2O 的有盖 384 板之间。 9) 用单层保鲜膜将板牢固地包裹起来。 10) 在37℃、5%CO2培养箱中孵育过夜（14小时）。第 2 天 程序 1) 添加 3 ul/孔的带有 Multidrop 的 SteadyGlo 溶液。 2) 在平板摇床上摇动平板 20 分钟。 3) 使用离心机以 1000 RPM 的速度旋转板 1 分钟。 4)读取发光。使用GraphPad Prism 5.0计算IC50值。屏幕的平均Z为0.6，信噪比为11.1，信噪比为78.6，信噪比为6.0。细胞测定：使用 ATP-lite 1 步测定，用 Fa2N-4 永生化人肝细胞测定化合物的肝毒性。 Fa2N-4 细胞以 50,000 个细胞/孔接种，并与一系列浓度的测试化合物 (0.01 µM-50 µM) 一起在 MFE 支持培养基中在 37 ℃、5% CO2 下孵育 24 小时。实验结束时添加 D-荧光素和荧光素酶。 Infinite M200 读板器捕获因与细胞 ATP 反应而产生的发射发光信号。使用统计软件包 Prism4，使用具有可变斜率的对数（抑制剂）与响应方程，通过非线性回归分析计算杀死 50% 细胞的每种化合物的浓度 (LC50)。

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1. 抑制NOD1介导的NF-κB激活：在转染NOD1的HEK293T细胞中，ML130（0.5~20 μM）以浓度依赖性方式抑制iE-DAP诱导的NF-κB荧光素酶活性。在10 μM浓度下，ML130 对该活性的抑制率较溶媒对照组超过80%。此抑制具有NOD1特异性，因为ML130 在相同浓度下对 Toll样受体4（TLR4，脂多糖LPS刺激）介导的NF-κB激活无影响 [1]
2. 抑制炎症因子分泌：
- 在HT-29细胞中，ML130（0.1~10 μM）预处理1小时后，可浓度依赖性地显著降低iE-DAP诱导的IL-8分泌。10 μM浓度下抑制率最高（约90%），IC50约为1.8 μM [2]
- 在原代人结肠上皮细胞（pHCECs）中，ML130（5 μM）可使iE-DAP诱导的IL-8分泌降低约75%，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌降低约60%，且不影响细胞活力（MTT法检测显示20 μM浓度下细胞活力>90%） [2]
3. 下调NOD1依赖性信号分子：HT-29细胞的Western blot分析显示，ML130（5 μM）可在iE-DAP刺激30分钟后，分别使抑制剂κB α（IκBα）和NF-κB p65亚基的磷酸化水平降低约65%和70%，但对总IκBα和总p65蛋白水平无显著影响 [2]

1. 对DSS诱导小鼠结肠炎模型（炎症性肠病IBD模型）的疗效：
- 动物模型与给药方案：6~8周龄雌性C57BL/6小鼠，通过饮用含3%葡聚糖硫酸钠（DSS）的水7天诱导结肠炎。小鼠随机分为3组：正常对照组（无DSS，无药物）、DSS+溶媒组（0.5% DMSO/PBS）、DSS+ML130组（10 mg/kg，腹腔注射，每日1次，连续7天） [2]
- 抗炎效果：
- 结肠长度：ML130 处理可显著阻止DSS诱导的结肠缩短：DSS+ML130 组平均结肠长度为6.2±0.3 cm，显著长于DSS+溶媒组的4.5±0.2 cm（P<0.01） [2]
- 炎症因子：ELISA检测显示，DSS+ML130 组结肠组织匀浆中TNF-α水平降低约55%，IL-6水平降低约48%（相较于DSS+溶媒组） [2]
- 组织病理学：ML130 处理可减轻DSS诱导的结肠组织损伤（如黏膜糜烂、炎症细胞浸润）。DSS+ML130 组组织学评分为2.1±0.3，显著低于DSS+溶媒组的4.8±0.5（P<0.01） [2]

第 1 天，进行 1) 当 HEK-293-T NFKB-Luc 100% 汇合时收集。 2) 使用 Multidrop 添加 NOD 检测介质。 3) 将板放入离心机中以 1000 rpm 的速度旋转一分钟。 4) 反复稀释化合物。 5) 将 0.75 ug/mL 的 gamma-tri-DAP 添加到细胞悬液中。 6) 每孔接种 HEK-293-T NFKB-Luc 板 13000 个细胞，每孔 4 uL 填充板。 7) 在离心机上，以 500 RPM 的速度旋转平板 5 分钟。 8) 带盖的盘子。将两个装满水的 384 盘子容器与 2 个有盖盘子夹在一起，以容纳 4 个盘子。 9) 用一层保鲜膜牢固地盖住盘子。 10) 将培养箱保持在 37 °C 和 5% CO2 过夜（14 小时）。第 2 天的程序 1) 使用 Multidrop 将 3 ul SteadyGlo 溶液添加到每个孔中。 2) 将板放入摇床中摇动 20 分钟。 3) 使用离心机以 1000 RPM 的速度旋转板 1 分钟。 4. 读取发光值。 GraphPad Prism 5.0 用于计算 IC50 值。 Z 平均

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1. NOD1介导NF-κB荧光素酶报告基因实验：
- 细胞接种与转染：将HEK293T细胞以2×104个/孔的密度接种于96孔板，过夜培养。使用转染试剂将质粒混合物（NOD1表达质粒0.1 μg/孔、NF-κB萤火虫荧光素酶报告质粒0.05 μg/孔、海肾荧光素酶内参质粒0.01 μg/孔）转染至细胞，转染后孵育24小时 [1]
- 药物处理与刺激：ML130 用DMSO溶解后，以培养基稀释至终浓度（0.5~20 μM，DMSO终浓度≤0.1%）。细胞经ML130 处理1小时后，加入NOD1特异性激动剂iE-DAP（100 nM）继续刺激6小时。设置溶媒对照组（0.1% DMSO）和未转染对照组 [1]
- 活性检测：用被动裂解缓冲液裂解细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值作为相对荧光素酶活性，通过比较处理组与溶媒对照组的相对活性计算ML130 的抑制率 [1]
2. RIP2激酶活性实验：
- 反应体系制备：将重组人RIP2激酶（0.1 μg/反应）、ATP（100 μM）、荧光标记肽底物（5 μM）加入激酶反应缓冲液（含Tris-HCl、MgCl2、DTT，pH 7.5）中，总体积20 μL，同时加入不同浓度ML130（0.1~50 μM） [2]
- 孵育与检测：反应混合物在37°C孵育60分钟后，加入终止缓冲液终止反应。通过检测荧光强度（激发波长485 nm，发射波长520 nm）评估肽底物的磷酸化水平，计算RIP2激酶活性并评价ML130 的抑制作用。即使在50 μM ML130 浓度下，也未观察到对RIP2激酶活性的显著抑制 [2]

使用永生化人肝细胞 Fa2N-4，ATP-lite 1 步测定用于评估各种物质的肝毒性。每孔中接种 50,000 个 Fa2N-4 细胞，然后在 MFE 支持培养基中、37°C、5% CO2 和一系列浓度的测试物质 (0.01 µM-50 µM) 下孵育 24 小时。实验结束时添加荧光素酶和 D-荧光素。 Infinite M200 读板器记录与细胞 ATP 反应产生的发射发光信号。使用非线性回归分析和具有可变斜率的对数（抑制剂）与响应方程，Prism4 统计软件程序用于确定杀死 50% 细胞的每种化合物的浓度 (LC50)。

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1. HT-29细胞IL-8分泌检测实验：
- 细胞培养与接种：HT-29细胞在含胎牛血清和抗生素的培养基中培养，以5×105个/孔的密度接种于24孔板，培养至融合度达80% [2]
- 药物预处理与刺激：更换培养基为无血清培养基，加入ML130（0.1~10 μM）预处理1小时。预处理后加入NOD1激动剂iE-DAP（100 nM）刺激IL-8分泌，继续培养24小时。设置溶媒对照组（0.1% DMSO）和未刺激对照组 [2]
- IL-8检测：收集细胞培养上清，1000×g离心5分钟去除细胞碎片，采用夹心ELISA试剂盒检测上清中IL-8浓度。通过非线性回归分析拟合浓度-抑制曲线，计算IC50值 [2]
2. 磷酸化IκBα和p65的Western blot检测实验：
- 细胞处理：将HT-29细胞以2×106个/孔的密度接种于6孔板，过夜培养。用ML130（5 μM）预处理细胞1小时后，加入iE-DAP（100 nM）分别刺激15、30或60分钟，在各时间点收集细胞；同时设置仅用iE-DAP刺激的溶媒对照组 [2]
- 蛋白提取与检测：使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白（每泳道30 μg）进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜。膜用5%脱脂牛奶封闭后，加入抗磷酸化IκBα（p-IκBα）、总IκBα、磷酸化p65（p-p65）、总p65及内参β-肌动蛋白（β-actin）的一抗，4°C孵育过夜。洗膜后加入二抗室温孵育1小时，采用增强化学发光（ECL）检测系统显影蛋白条带，图像分析软件定量条带灰度值 [2]

DSS-Induced Murine Colitis Model for Evaluating ML130 Efficacy:
- Animal Preparation: Female C57BL/6 mice (6-8 weeks old, weighing 18-22 g) were acclimated for 1 week under standard conditions (12-hour light/dark cycle, 22±1°C, free access to food and water). Mice were randomly divided into three groups (n=6 per group): Normal Control Group (no DSS, no drug), DSS + Vehicle Group, and DSS + ML130 Group [2]
- Colitis Induction and Drug Administration: Mice in the DSS + Vehicle and DSS + ML130 groups were given drinking water containing 3% DSS (molecular weight 36-50 kDa) for 7 days to induce colitis. On the same day DSS administration started, ML130 was dissolved in 0.5% DMSO/PBS to a concentration of 2 mg/mL, and administered to mice in the DSS + ML130 group via intraperitoneal injection at a dose of 10 mg/kg once daily for 7 days. Mice in the DSS + Vehicle Group received an equal volume of 0.5% DMSO/PBS via intraperitoneal injection [2]
- Sample Collection and Detection: On day 8 (1 day after stopping DSS and drug administration), mice were euthanized. The entire colon was removed, and its length was measured. A segment of the colon (1 cm from the distal end) was fixed in 4% paraformaldehyde for histological analysis (hematoxylin-eosin staining), and the remaining colon tissue was homogenized in PBS containing protease inhibitors to prepare tissue homogenates. The homogenates were centrifuged at 12,000×g for 15 minutes, and the supernatant was collected to measure TNF-α and IL-6 concentrations using ELISA kits [2]

[1]. ACS Med Chem Lett . 2011 Oct 13;2(10):780-785.

[2]. Chem Biol . 2011 Jul 29;18(7):825-32.

1-(4-methylphenyl)sulfonyl-2-benzimidazolamine is a sulfonamide.

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1. Mechanism of Action: ML130 exerts anti-inflammatory effects by specifically inhibiting NOD1-mediated signaling pathways. It does not directly target RIP2 kinase but interferes with the oligomerization or downstream signal transduction of NOD1, thereby reducing the phosphorylation of IκBα and p65, inhibiting NF-κB activation, and ultimately suppressing the secretion of pro-inflammatory cytokines (e.g., IL-8, TNF-α, IL-6) [2]
2. Therapeutic Potential: Due to its ability to inhibit NOD1-mediated inflammation and alleviate DSS-induced colitis in mice, ML130 is considered a potential preclinical candidate for the treatment of inflammatory diseases associated with NOD1 overactivation, such as inflammatory bowel disease (IBD, including ulcerative colitis and Crohn's disease) and other intestinal inflammatory disorders [2]
3. Target Background: NOD1 is a key cytosolic receptor that recognizes bacterial peptidoglycan fragments (e.g., iE-DAP) and triggers inflammatory responses. Aberrant activation of NOD1 is associated with the pathogenesis of various inflammatory diseases, making it an important therapeutic target. ML130 is one of the first small-molecule inhibitors of NOD1 reported, providing a tool for studying NOD1 biology and developing anti-inflammatory drugs [1, 2]
4. Selectivity Profile: ML130 shows high selectivity for NOD1. It does not inhibit NOD2 (a structurally similar receptor) or TLR4 (a Toll-like receptor involved in innate immunity) at concentrations up to 20 μM, reducing the risk of off-target inflammatory effects [1, 2]

C14H13N3O2S

287.34

287.072

C, 58.52; H, 4.56; N, 14.62; O, 11.14; S, 11.16

799264-47-4

1088438

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

532.5±43.0 °C at 760 mmHg

275.8±28.2 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.688

2.79

86.36

1

4

2

20

440

0

O=S(N1C2C(=CC=CC=2)N=C1N)(C1C=CC(C)=CC=1)=O

SRFABRWQVPCPRG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H13N3O2S/c1-10-6-8-11(9-7-10)20(18,19)17-13-5-3-2-4-12(13)16-14(17)15/h2-9H,1H3,(H2,15,16)

1-(4-methylphenyl)sulfonylbenzimidazol-2-amine

Nodinitib-1; ML130; ML 130; CID1088438; ML-130; CID-1088438; CID 1088438; Nodinitib 1; Nodinitib1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。