ML264

KLF5 (IC50 = 29 nM)
ML264 potently halts DLD-1 viability (IC50 = 29 nM) with high maximal effect (>90%). Human colorectal adenocarcinoma cells are DLD-1 cells. Other cell types, such as HCT116 (human colorectal carcinoma), HT29 (human colorectal adenocarcinoma), and SW620 (human colorectal adenocarcinoma), are also significantly affected by ML264 at submicromolar doses. With inhibition below 50% at the highest dose, the IEC-6 anti-target (a nontransformed rat intestinal epithelial cell line) is largely unaffected[1]. Through changes to the cell cycle profile, this substance effectively prevents the proliferation of CRC cells in vitro[2].

ML264 可有效终止 DLD-1 活性 (IC50 = 29 nM)，且最大效果较高 (>90%)。人结直肠腺癌细胞是DLD-1细胞。其他细胞类型，如 HCT116（人结直肠癌）、HT29（人结直肠腺癌）和 SW620（人结直肠腺癌），也受到亚微摩尔剂量的 ML264 的显着影响。在最高剂量下抑制率低于 50%，IEC-6 抗靶标（一种未转化的大鼠肠上皮细胞系）基本上不受影响[1]。通过改变细胞周期特征，该物质可有效阻止体外 CRC 细胞的增殖[2]。

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ML264 (10 µM) 在 24 小时内显著抑制 DLD-1 和 HCT116 结直肠癌细胞系的增殖，与溶剂对照组相比，72 小时后活细胞数量减少 15 至 30 倍。[2]
MTS 实验证实，用 10 µM ML264 处理 72 小时，DLD-1 和 HCT116 细胞的代谢活性/存活率降低。[2]
用 10 µM ML264 处理可在 24、48 和 72 小时显著减少 DLD-1 细胞中的有丝分裂象数量。[2]
细胞周期分析显示，10 µM ML264 处理导致 DLD-1 和 HCT116 细胞的 G0/G1 期群体显著减少，S 期群体增加，表明发生了 S 期阻滞。G2/M 期群体的变化具有细胞系依赖性。[2]
Annexin V/PI 染色表明，用 10 µM ML264 处理的 DLD-1 和 HCT116 细胞中，凋亡细胞（早期和晚期凋亡）有适度但显著的增加，在 48-72 小时效果更明显。[2]
蛋白质印迹分析显示，10 µM ML264 处理在 72 小时内降低了 DLD-1 和 HCT116 细胞中 KLF5 和 EGR1 的蛋白水平。[2]
ML264 处理 (10 µM) 调节了 MAPK、PI3K 和 WNT 通路组分：它降低了 HCT116 细胞中的 p-EGFR 和 EGFR 水平，但增加了 DLD-1 细胞中的 p-EGFR；降低了两种细胞系中的总 ERK 但增加了 p-ERK；降低了两种细胞系中的 AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β 和 Ser552 位点磷酸化的 β-连环蛋白水平。在 HCT116 细胞中，总 β-连环蛋白和 Thr41/Ser45 位点磷酸化的 β-连环蛋白也减少了。[2]
ML264 处理 (10 µM) 在 72 小时内下调了 DLD-1 和 HCT116 细胞中细胞周期蛋白 E1、A2 和 B1 的蛋白和 mRNA 水平。细胞周期蛋白 D1 的蛋白在 HCT116 细胞中下调，但在 DLD-1 细胞中不显著，其 mRNA 水平基本无变化。[2]

在成熟的小鼠结肠癌异种移植模型中，ML264 在给药五天后有效抑制肿瘤生长。由于 ML264 有效抑制 KLF5 和 EGR1（KLF5 的转录激活剂）的表达，因此这种效应是通过增殖显着减少而产生的[2]。

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在裸鼠 DLD-1 异种移植瘤模型中，腹腔注射 ML264，每日两次、每次 10 mg/kg 或每日两次、每次 25 mg/kg，连续 10 天，与溶剂对照组相比，能显著抑制肿瘤生长，效果最早在治疗后 2 天即可检测到。每日单次 10 mg/kg 剂量无效。[2]
对经 ML264 (25 mg/kg，每日两次) 处理的小鼠异种移植瘤进行组织学分析，显示有丝分裂象显著减少。[2]
异种移植瘤的免疫组织化学和蛋白质印迹分析显示，ML264 处理 (10 和 25 mg/kg，每日两次) 后，KLF5 和 EGR1 蛋白水平显著降低。[2]
ML264 处理 (25 mg/kg，每日两次) 的小鼠，其异种移植瘤中 Ki-67（增殖标记物）染色显著减少。[2]
与溶剂对照组相比，ML264 处理的小鼠的异种移植瘤显示出纤维化（波形蛋白染色增加）和炎症（Mac-3 阳性的单核吞噬细胞增加）。[2]

ML264 具有高活性（在基于细胞的 DLD-1 细胞增殖测定中，IC50=29 nM；在基于细胞的荧光素酶测定中，IC50=81 nM）。 ML264 在 IEC-6 对照细胞系中缺乏细胞毒性（IC50>50 μM，在 100 μM 时观察到<50% 抑制）。在其他几种表达 KLF5 的细胞类型中也观察到了强大的活性（例如，HCT116，IC50=560 nM；HT29，IC50=130 nM；SW620，IC50=430 nM）。 Western blot 分析显示 ML264 显着降低 KLF5 表达。

在测试细胞增殖的实验中，使用 10 μM ML264 或 DMSO 处理 DLD-1 和 HCT116 细胞。处理后24小时、48小时和72小时收集活细胞，并使用库尔特计数器对每个细胞的数量进行计数。在 MTS 测定中，用 10 μM ML264 或对照 (DMSO) 处理 DLD-1 和 HCT116 细胞。孵育 24、48 和 72 小时后，每个孔接受 20 μL MTS 溶液。然后根据制造商的说明进行分析。

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细胞增殖和活力实验: 将 DLD-1 和 HCT116 细胞接种于含 DMSO（溶剂）或 10 µM ML264 培养基的板中。在处理后 24、48 和 72 小时使用细胞计数器进行活细胞计数。对于 MTS 实验，类似地处理细胞，孵育相应时间后，向每孔加入 MTS 溶液，按照标准方案测量吸光度。[2]
细胞周期分析: 将 DLD-1 和 HCT116 细胞接种于板中，用 DMSO 或 10 µM ML264 处理。在 24、48 和 72 小时后，收集细胞，固定，用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术分析以确定细胞周期分布。[2]
细胞凋亡实验: 用 DMSO 或 10 µM ML264 处理 DLD-1 和 HCT116 细胞。在 24、48 和 72 小时后，按照试剂盒说明使用 Alexa Fluor 488 Annexin V 和 PI 对细胞进行染色，并通过流式细胞术分析以量化凋亡细胞。[2]
有丝分裂象计数 (体外): 将 DLD-1 细胞接种于含 DMSO 或 10 µM ML264 培养基的载玻片上，在 24、48 和 72 小时后固定，并用 Hoechst 染料对 DNA 进行染色。在五个视野（每个视野约 100 个细胞）中计数处于有丝分裂的细胞数量。[2]
蛋白质印迹分析: 使用 Laemmli 裂解液从在不同时间点经 DMSO 或 10 µM ML264 处理的 DLD-1 和 HCT116 细胞中提取总蛋白。通过 SDS-PAGE 分离蛋白，转移至膜上，用特异性一抗孵育，再用相应的二抗进行检测。[2]
定量 PCR (qPCR): 使用 TRIzol 试剂从处理的 DLD-1 和 HCT116 细胞中提取总 RNA。合成 cDNA，使用 SYBR Green 化学法和针对 KLF5、EGR1、CTNNB1、CCND1、CCNE1、CCNA2、CCNB1 和 GAPDH 基因的特异性引物进行 qPCR。使用 2-ΔΔCt 方法计算相对基因表达量，以 GAPDH 作为内参基因。[2]

Mice: In ventilated, filtered cages with positive pressure, naked mice are kept in a pathogen-free environment. The right flank of 6-7 week old male nude mice is injected subcutaneously with 5×106 DLD-1 human colorectal cells to produce xenograft tumors. By measuring with a caliper and using established formulas, tumor volume is calculated. Mice are treated intraperitoneally (i.p.) with ML264 at doses of 10 mg/kg daily, 10 mg/kg twice daily, and 25 mg/kg twice daily for a total of 10 days when tumor volumes reach approximately 100 mm6. The control treatment is the vehicle solution. Each and every two days, mice are observed and weighed. When the tumor's largest measurement reaches 2 cm, the experiment is over. Tumors are removed and saved for additional research[2].

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Xenograft Efficacy Study: Nude mice were subcutaneously injected with 5×10^6 DLD-1 human colorectal cancer cells into the right flank. When tumors reached approximately 100 mm³, mice were randomized and treated intraperitoneally (i.p.) for 10 days with varying regimens: vehicle (control), ML264 at 10 mg/kg once daily, 10 mg/kg twice daily, or 25 mg/kg twice daily. The vehicle solution consisted of 80% dH2O, 10% DMSO, and 10% Tween 80. Tumor dimensions were measured regularly with calipers, and volume was calculated. Mice were weighed every two days. The study was terminated when tumors reached 2 cm in greatest dimension, at which point tumors were excised for analysis. [2]
Tissue Analysis: Excised tumors were fixed, paraffin-embedded, and sectioned. Sections were used for Hematoxylin and Eosin (H&E) staining, immunohistochemistry (IHC) for KLF5, EGR1, vimentin, and Mac-3, and immunofluorescence for Ki-67. Mitotic figures were counted in H&E-stained sections. Protein was also extracted from tumor tissues for Western blot analysis. [2]

In vitro Drug Metabolism and Pharmacokinetics (DMPK) studies indicated that ML264 has high stability upon exposure to hepatic microsomes, suggesting high stability to first-pass metabolism. [2]
ML264 does not inhibit the activity of cytochrome P450 isoenzymes. [2]
In vivo DMPK studies in mice showed that ML264 has a plasma half-life of approximately 2 hours. [2]
ML264 displays 47% oral bioavailability in mice. [2]

ML264 was reported to be inactive against a panel of 47 kinases and 67 protein targets of therapeutic/toxicological interest, suggesting potential selectivity. [2]
ML264 does not inhibit cytochrome P450 isoenzymes, indicating a potential for low drug-drug interaction risk in this aspect. [2]
No significant changes in body weight were observed in nude mice treated with ML264 at doses up to 25 mg/kg twice daily for 10 days compared to vehicle-treated controls. [2]

[1]. ML264: An Antitumor Agent that Potently and Selectively Inhibits Krüppel-like Factor Five (KLF5) Expression: A Probe for Studying Colon Cancer Development and Progression.

[2]. ML264, A Novel Small-Molecule Compound That Potently Inhibits Growth of Colorectal Cancer. Mol Cancer Ther. 2016 Jan;15(1):72-83.

ML264 is a third-generation small-molecule compound identified from an ultrahigh-throughput screening (uHTS) campaign aimed at finding inhibitors of KLF5 expression for colorectal cancer therapy. [2]
KLF5 is a transcription factor overexpressed in intestinal tumors and is a mediator of RAS/MAPK and WNT signaling pathways. ML264 is proposed to exert its anti-tumor effects by downregulating KLF5 and its activator EGR1. [2]
The mechanism by which ML264 inhibits KLF5 expression is not yet fully defined; it may directly or indirectly affect transcription. [2]
Studies are ongoing to identify the direct molecular target of ML264 and to test its efficacy in genetic mouse models of intestinal adenoma development. [2]

C17H21CLN2O4S

384.88

384.091

C, 53.05; H, 5.50; Cl, 9.21; N, 7.28; O, 16.63; S, 8.33

1550008-55-3

51003603

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

701.0±60.0 °C at 760 mmHg

377.7±32.9 °C

0.0±2.2 mmHg at 25°C

1.599

0.46

91.9

1

4

5

25

601

0

ClC1=CC=CC(=C1)/C=C/C(NCC(N(C)C1CCS(CC1)(=O)=O)=O)=O

AJCDZIDKYKCOMZ-AATRIKPKSA-N

InChI=1S/C17H21ClN2O4S/c1-20(15-7-9-25(23,24)10-8-15)17(22)12-19-16(21)6-5-13-3-2-4-14(18)11-13/h2-6,11,15H,7-10,12H2,1H3,(H,19,21)/b6-5+

(E)-3-(3-chlorophenyl)-N-[2-[(1,1-dioxothian-4-yl)-methylamino]-2-oxoethyl]prop-2-enamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 3.25 mg/mL (8.44 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 32.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。