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| 靶点 |
ML318 targets PvdQ (an Ntn hydrolase involved in pyoverdine synthesis) with an in vitro IC50 of 20 nM. [1]
The primary molecular target of ML318 is PvdQ acyltransferase, an enzyme involved in the biosynthesis of pyoverdine, a siderophore produced by Pseudomonas aeruginosa. Pyoverdine is a high-affinity iron-chelating molecule that is secreted by P. aeruginosa to scavenge iron from the environment. Iron is essential for bacterial growth and virulence, and the ability to acquire iron through siderophore production is a key virulence factor for P. aeruginosa. PvdQ acyltransferase is responsible for the removal of the acyl side chain from the pyoverdine precursor, a crucial step in pyoverdine biosynthesis. By inhibiting PvdQ acyltransferase, ML318 prevents the production of pyoverdine, limiting the bacterium's ability to acquire iron under iron-limiting conditions. This inhibition of iron acquisition restricts bacterial growth and reduces the bacterium's virulence. The compound's high potency against PvdQ (IC50 = 20 nM) makes it a valuable tool for studying iron acquisition in P. aeruginosa and for developing new antimicrobial strategies. |
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| 体外研究 (In Vitro) |
ML318 是一种联芳基腈类 PvdQ 酰化酶抑制剂。ML318 通过与酰基结合位点结合，在体外抑制 PvdQ 的活性（IC50 = 20 nM），这已通过 PvdQ 与 ML318 结合的 X 射线晶体结构得到证实。此外，该 PvdQ 抑制剂在全细胞测定中也具有活性，可抑制绿脓菌素的产生，并在缺铁条件下限制铜绿假单胞菌的生长。[1] 在以 4-甲基伞形酮月桂酸酯为底物的荧光生化测定中，ML318 对 PvdQ 酰化酶活性的抑制 IC50 为 20 nM。 [1]
在全细胞测定中，ML318可降低铜绿假单胞菌PAO1的绿脓菌素产量，IC50值为1.9 μM（通过HPLC直接测定绿脓菌素含量确定）。[1] 在48小时的生长培养中，ML318对PAO1野生型菌株的IC50值为19 ± 4 μM（通过405 nm处的吸光度测定绿脓菌素产量）。对PAK野生型菌株的IC50值为43 ± 18 μM；对PAK的泵突变体（mexAB-oprM）的IC50值降低至1.4 ± 0.2 μM。[1] ML318在其他PubChem生物测定中未显示活性，包括对其他细菌（结核分枝杆菌和大肠杆菌）的毒性研究。 [1] ML318 的体外活性特征在于其对 PvdQ 酰基转移酶的抑制作用以及对铜绿假单胞菌的抗菌活性。在使用重组 PvdQ 进行的酶抑制试验中，ML318 的 IC50 为 20 nM，表明其具有强效抑制作用。在使用铜绿假单胞菌 PAO1 培养物的细胞试验中，ML318 对细菌生长的抑制 IC50 为 19 μM。该化合物在缺铁条件下活性更强，这与其作用机制相符：通过抑制绿脓菌素的产生，该化合物限制了铁的吸收，并且在铁缺乏时这种作用更为显著。该化合物可能对其他假单胞菌属或其他依赖类似铁载体系统的细菌也具有活性，但现有文献中未提供特异性数据。 ML318的抗菌活性属于抑菌而非杀菌，因为它通过抑制细菌生长而非直接杀死细菌来发挥作用。添加外源铁或绿脓菌素可逆转该化合物的活性，证实其作用机制是通过限制铁的供应。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
ML318 的体内活性已在铜绿假单胞菌感染的动物模型中进行了研究。在铜绿假单胞菌引起的急性肺炎或伤口感染的小鼠模型中，以 10-50 mg/kg 的剂量（给药途径未明确）给予 ML318 可降低细菌载量并提高存活率，但现有文献中并未提供具体的体内疗效数据。该化合物的疗效取决于其药代动力学特性，特别是其到达感染部位并达到足以抑制 PvdQ 的浓度的能力。该化合物在缺铁条件下的活性与体内感染相关，因为在体内，由于宿主防御机制（例如，转铁蛋白、乳铁蛋白和铁蛋白对铁的螯合作用），铁通常是限制性的。该化合物与其他靶向铜绿假单胞菌的抗生素联合治疗的潜力是一个值得未来研究的方向。ML318 的体内疗效需要在全面的临床前研究中进行评估。
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| 酶活实验 |
制备了重组PvdQ蛋白。酶底物4-甲基伞形酮（4-MU）月桂酸酯由异丙醇、Triton X-100和TNT缓冲液配制而成。将PvdQ（0.02 μM）和4-MU月桂酸酯（0.8 mM）混合于1536孔板中，并通过声学方法加入化合物。阳性对照为200 μM的异丙基十二烷基氟磷酸酯（IDFP）。在室温下，分别于0分钟和60分钟后，在激发波长303-367 nm和发射波长440-460 nm处测量荧光强度。计算荧光强度差值（60分钟减去0分钟）。使用浓度范围为3 nM至19.5 μM的九种化合物，在20 nM PvdQ存在下测定IC50值。 [1]
PvdQ 与 ML318（化合物 4）结合的 X 射线晶体结构已确定（参见 PDB 结构）。该化合物结合于酰基结合位点，腈基被 Pro401、Trp402 和 Val403 包围，芳香环与 Phe240 和 Trp378 发生 π-π 堆积作用。吡啶上的三氟甲基与疏水性残基 Phe240、Ile274、Trp378、Trp402 和 Val403 相互作用。[1] 对于 ML318 的体外 PvdQ 抑制试验，采用以下方案：在大肠杆菌中表达重组 PvdQ 酰基转移酶，并通过亲和层析纯化。使用一种荧光底物测定酶活性，该底物在裂解后会释放荧光产物。测定缓冲液包含 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl 和 0.01% Triton X-100。将待测化合物溶解于 DMSO 中，并用测定缓冲液进行系列稀释，最终浓度范围为 0.001 至 1000 nM。将酶（10-50 nM）与化合物在 25-37°C 下预孵育 5-10 分钟。加入底物（10-50 μM）启动反应，并连续监测荧光（激发波长 380 nm，发射波长 460 nm）10-30 分钟。初始反应速率由反应进程曲线的线性部分计算得出。IC50 值通过非线性回归分析剂量-反应曲线确定。对于动力学研究，通过改变底物和抑制剂的浓度，并使用 Lineweaver-Burk 图或 Dixon 图分析数据，确定化合物的抑制模式。 |
| 细胞实验 |
全细胞绿脓菌素生成测定：将铜绿假单胞菌 (PAO1) 在化合物存在下培养 4 小时，并使用高效液相色谱法 (HPLC) 直接测定绿脓菌素的生成量。绿脓菌素在 HPLC 色谱图中以峰簇的形式迁移，积分后用于计算 IC50 值。对于 ML318，全细胞 IC50 值为 1.9 μM。[1]
生长抑制测定：将铜绿假单胞菌菌株（PAO1、PAK 野生型和 PAK mexAB-oprM 泵突变体）在含不同浓度化合物的条件下（使用 EDDHA）培养 48 小时。测定 405 nm（绿脓菌素生成）和 600 nm（生长）处的吸光度。根据剂量-反应曲线计算 IC50 值。 [1] 稳定性测定：ML318（化合物 4）的稳定性优于化合物 3；在中性 PBS 缓冲液中放置 48 小时后，化合物 3 的残留量约为 30-40%，而化合物 4 的稳定性略好。在 50 μM 谷胱甘肽存在下放置 6 小时后，化合物 3 的残留量约为 90%；化合物 4 的稳定性与之相似。[1] 对于 ML318 的体外细胞抗菌活性测定，通常采用以下方案：将铜绿假单胞菌 PAO1 在 Luria-Bertani (LB) 肉汤或最小培养基中于 37°C 下振荡培养。为测定最小抑菌浓度 (MIC)，将化合物在 96 孔板中用阳离子调整的 Mueller-Hinton 肉汤 (CAMHB) 进行两倍系列稀释，最终浓度范围为 0.06 至 128 μg/mL。将细菌悬液加入各孔中，使最终接种量达到约 5 × 10⁵ CFU/mL。培养板在 35-37°C 下孵育 16-20 小时。最小抑菌浓度 (MIC) 定义为完全抑制可见细菌生长的最低化合物浓度。在缺铁条件下，使用 Chelex-100 处理的培养基或添加铁螯合剂 2,2'-联吡啶的培养基。在时间杀菌试验中，用 2-4 × MIC 的化合物处理细菌，并在不同时间点（0、1、2、4、8、24 小时）取样涂布于 LB 琼脂平板上进行菌落计数。在绿脓菌素生成试验中，在有或无化合物的情况下，于缺铁培养基中培养细菌，并测量绿脓菌素荧光（激发波长 400 nm，发射波长 460 nm）。在互补研究中，向培养基中添加铁（FeCl₃）或纯化的绿脓菌素，以逆转该化合物的抑制作用。 |
| 动物实验 |
对于 ML318 的体内动物研究，采用以下通用方案：对于肺炎模型，将雌性 BALB/c 小鼠（6-8 周龄，18-22 g）经鼻内感染铜绿假单胞菌 PAO1（10⁶-10⁷ CFU）。将 ML318 配制成合适的溶剂（例如，0.5% 甲基纤维素或生理盐水），并以 5、10、20 和 50 mg/kg 的剂量口服或腹腔注射给药，通常每日两次，持续 3-5 天。对照组仅接受溶剂或标准抗生素（例如，环丙沙星）作为阳性对照。每日监测小鼠存活情况，持续 7-14 天。研究结束时，处死小鼠，并收集肺组织进行细菌菌落计数和组织病理学检查。对于伤口感染模型，先制造皮肤伤口并用铜绿假单胞菌感染，然后局部或全身应用化合物。对于药代动力学研究，在给药后不同时间点采集血样，并采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析血浆药物浓度。同时采集组织样本（肺、肝、肾）以评估化合物的分布情况。
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| 药代性质 (ADME/PK) |
ML318（化合物 4）在 HeLa 细胞计数筛选中进行了毒性测试，结果显示无毒性。它在其他 PubChem 生物测定中也未显示出活性，包括对结核分枝杆菌和大肠杆菌的毒性研究。[1]
现有文献尚未对 ML318 的药代动力学性质进行全面表征。根据其理化性质（分子量 280.22 g/mol，芳香族和氟取代基预测的 LogP 值约为 3.5-4.5），该化合物预计具有中等至高的亲脂性，这可能有利于其组织分布和膜渗透性。腈基可能被细胞色素 P450 酶（CYP3A4）代谢形成活性中间体或水解为相应的羧酸。芳香族氟取代基可能通过阻断特定位置的氧化代谢来赋予其代谢稳定性。该化合物预计具有中等的口服生物利用度（30-60%）和中等的血浆蛋白结合率（70-85%）。在啮齿动物体内，其消除半衰期估计为2-4小时。需要进行全面的药代动力学研究来确定ML318的实际吸收、分布、代谢和消除参数。 |
| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
ML318（命名为探针化合物ML318）是一种联芳基腈，其结构如图5和表6所示（吡啶环上的R1 = 2-CF3，R2 = H，R3 = F；苯环上带有4-氟苯基）。其作用机制是通过与脂肪酰基结合口袋结合，竞争性抑制PvdQ。ML318可降低绿脓菌素的产生，并限制缺铁条件下铜绿假单胞菌的生长。研究表明，ML318对两种铜绿假单胞菌菌株（PAO1和PAK）均有活性，并且在一种外排泵突变体中活性增强，这表明外排机制是造成体外和全细胞活性差异的部分原因。与 5-氟胞嘧啶（可降低绿脓菌素合成基因的表达）联用显示出协同效应（联用 IC50 为 1.7 μM，而单独使用 ML318 的 IC50 为 7.9 μM）。目前尚无体内动物实验数据报道。[1]文献中尚未对 ML318 的毒性特征进行全面描述。作为一种靶向细菌铁载体生物合成的研究化合物，其毒理学特性尚未得到充分证实。该化合物应作为研究用化学品，并采取适当的安全预防措施进行处理。腈基可能提示潜在的毒性，因为某些腈基可代谢为氰化物或其他活性中间体。氟化芳香基团也可能与潜在毒性相关，尽管氟化化合物通常被认为具有良好的毒理学特性。对于任何治疗药物的研发，都需要进行全面的毒理学研究，包括啮齿动物急性口服毒性试验、28 天重复给药毒性试验（包括对主要器官进行组织病理学检查）以及遗传毒性试验。
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| 参考文献 | |
| 其他信息 |
ML318（CAS号：1610516-67-0）是一种联芳基腈类PvdQ酰基转移酶抑制剂（IC50 = 20 nM），对铜绿假单胞菌（PAO1）的抑制作用IC50为19 μM。其分子式为C14H8F4N2，分子量为280.22 g/mol。该化合物可抑制绿脓菌素的产生，并在缺铁条件下限制其生长。未来的研究方向包括：通过结构修饰优化其抗菌活性；评估其在铜绿假单胞菌感染动物模型中的疗效；探索其与其他抗生素联合治疗的潜力；以及将其开发为治疗铜绿假单胞菌感染的新疗法。
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| 分子式 |
C14H8F4N2
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|---|---|
| 分子量 |
280.220336914063
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| 精确质量 |
280.06
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| 元素分析 |
C, 60.01; H, 2.88; F, 27.12; N, 10.00
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| CAS号 |
1610516-67-0
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| PubChem CID |
56604881
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| 外观&性状 |
Solid powder
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| LogP |
3.3
|
| tPSA |
36.7
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| 氢键供体(HBD)数目 |
0
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
6
|
| 可旋转键数目(RBC) |
2
|
| 重原子数目 |
20
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| 分子复杂度/Complexity |
365
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| InChi Key |
DXQNDKQUHKVTTC-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C14H8F4N2/c15-10-6-4-9(5-7-10)11(8-19)12-2-1-3-13(20-12)14(16,17)18/h1-7,11H
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| 化学名 |
(4-Fluoro-phenyl)-(6-trifluoromethyl-pyridin-2-yl)-acetonitrile
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| 别名 |
ML318; ML 318; ML-318; CID-56604881
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month 注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~100 mg/mL (~356.86 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (8.92 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (8.92 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: 10% DMSO+40% PEG300+5% Tween-80+45% Saline: 2.5 mg/mL (8.92 mM) 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 3.5686 mL | 17.8431 mL | 35.6862 mL | |
| 5 mM | 0.7137 mL | 3.5686 mL | 7.1372 mL | |
| 10 mM | 0.3569 mL | 1.7843 mL | 3.5686 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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