ML346 (CID-767276)   中文名称: ML-346

HSP70 ( EC50 = 4.6 μM )
Protein homeostasis (proteostasis) network components: ML346 modulates the proteostasis network, potentially targeting molecular chaperones (e.g., heat shock proteins) and/or protein degradation pathways (e.g., ubiquitin-proteasome system, UPS); no specific IC₅₀, Ki, or EC₅₀ values for individual molecular targets were reported [1]
- Mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (ΔF508-CFTR) protein: ML346 enhances the folding and trafficking of ΔF508-CFTR to the plasma membrane; the EC₅₀ for restoring ΔF508-CFTR-mediated chloride ion transport in CFBE41o⁻ cells (a human bronchial epithelial cell line expressing ΔF508-CFTR) was approximately 1.2 μM [1]
- Mutant huntingtin (mHtt) protein (with expanded polyglutamine repeats): ML346 reduces the aggregation of mHtt (Q44-GFP) in HEK293T cells; no specific EC₅₀ value was reported [2]

体外活性：ML346 是一种新型 Hsp70 激活剂，在 HeLa 细胞中的 EC50 为 4600 nM。 10 μM 的 ML346 可恢复蛋白质稳态，恢复 CFTR 介导的碘化物电导，并增强在两个不同细胞区室中表达的蛋白质的正确折叠。 ML346（化合物 F1）可诱导多种反应，并强烈诱导 Hsp70、氧化应激反应基因（HO1 和 GCLM），以及 WT MEF 细胞中 BiP 上调 2.5 倍。 ML346 (0.5-25 μM) 在 35 分钟的严重热休克后对细胞表现出细胞保护作用，并且还对 H2O2 诱导的细胞凋亡产生双重保护。激酶测定：将 HeLa 细胞与作为阴性对照的 DMSO、或阳性对照 MG132 (10 μM) 和乳胞素 (6 μM) 或 PRs A1、A3 和 ML346 (F1) 一起孵育 3 和 6 小时，然后收获。将细胞在匀浆缓冲液（50 mM Tris-HCl、pH7.5、250 mM 蔗糖、5 mM MgCl2、2 mM ATP、1 mM DTT、0.5 mM EDTA、0.025% 毛地黄皂苷）中在冰上裂解 5 分钟，然后加入总蛋白测定全细胞提取物的浓度。将 3 μg 全细胞提取物与测定缓冲液（50 mM Tris-HCl、pH 7.5、40 mM KCl、5 mM MgCl2、0.5 mM ATP、1 mM DTT、0.05 mg/mL BSA）在黑色 96 孔板中混合通过添加 2× (200 μM) 荧光肽底物 Suc-LLVY-AMC 来启动反应。使用 Synergy H4 多模式酶标仪每 10 分钟测量一次荧光。细胞测定：将 HeLa 细胞接种于黑色 96 孔板（每孔 10,000 个细胞）中，加入 100 μL DMEM（补充有 10% FBS 和 1% Pen/Strep/Neo）。添加化合物之前，将板在 37°C、5% CO2 和 95% 相对湿度下孵育 16 小时。将 1 μL 的命中化合物 (ML346) 的 DMSO 溶液或单独的 DMSO 溶液分别添加到样品孔或对照孔中。然后将板放回培养箱中 24 小时。孵育后，用 200 μL PBS 洗涤细胞 2 次，并向每孔中添加 200 μL 1 μg/mL 钙黄绿素 AM 溶液。然后将细胞在 37°C、5% CO2 下孵育 45 分钟，然后使用 Analyst GT 多模式读数器进行荧光测量。细胞毒性百分比是相对于含有仅用 DMSO 处理的细胞的孔（100%）来表示的。

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恢复支气管上皮细胞中ΔF508-CFTR的功能：在CFBE41o⁻细胞（表达ΔF508-CFTR）中，ML346（0.1-10 μM）呈剂量依赖性增加ΔF508-CFTR在细胞膜的定位（通过免疫荧光和细胞表面生物素化/Western blot检测）。10 μM时，细胞膜ΔF508-CFTR水平较溶剂对照组升高约3.5倍。同时，ML346可恢复氯离子转运（通过Ussing室测定），EC₅₀约为1.2 μM；10 μM时，氯离子转运活性达到表达野生型CFTR细胞的约60% [1]
- 减少HEK293T细胞中mHtt的聚集：在瞬时转染mHtt-Q44-GFP（荧光标记的mHtt变体）的HEK293T细胞中，ML346（1-20 μM）呈剂量依赖性减少mHtt聚集物数量（通过荧光显微镜检测）。20 μM时，含mHtt聚集物的细胞百分比从溶剂对照组的约45%降至约12%。该作用不伴随mHtt蛋白表达降低（Western blot检测）或细胞毒性（MTT法评估） [2]
- 促进SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白的清除：在表达α-突触核蛋白-GFP（与帕金森病相关的蛋白）的SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞系）中，ML346（5-20 μM）可增加α-突触核蛋白-GFP的清除（通过流式细胞术和Western blot检测）。20 μM时，α-突触核蛋白-GFP蛋白水平较对照组降低约40%，且不影响细胞活力 [2]

在ΔF508-CFTR转基因小鼠模型中的疗效：在ΔF508-CFTR敲入小鼠（6-8周龄）中，通过灌胃给予ML346，剂量为50 mg/kg，每日1次，持续7天。收集肺组织，通过免疫荧光评估ΔF508-CFTR的定位。ML346显著增加支气管上皮细胞中ΔF508-CFTR在细胞膜的定位（较溶剂对照组升高约2.8倍），并通过体外Ussing室测定显示肺氯离子转运功能改善约35% [1]
- 在mHtt转基因果蝇模型中的疗效：在神经系统表达mHtt（Q93）的黑腹果蝇（表现出运动功能障碍）中，通过食物给予ML346，浓度为10 μM，持续10天。运动活性（通过攀爬实验测定）显著改善：10秒内可攀爬8 cm的果蝇百分比从溶剂对照组的约30%升至约65%。此外，ML346可减少果蝇脑中mHtt聚集物的形成（通过免疫组织化学检测），减少约40% [2]

该过程包括将 HeLa 细胞与 DMSO（阴性对照）、PR A1、A3 和 ML346 (F1) 或阳性对照 MG132 (10 μM) 和乳胞素 (6 μM) 一起孵育三或六个小时。将细胞在冰上溶解于均质缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH7.5，250 mM 蔗糖，5 mM MgCl₂，2 mM ATP，1 mM DTT，0.5 mM EDTA）中裂解五分钟后，和0.025%洋地黄皂苷），计算全细胞提取物的总蛋白质含量。将测定缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，40 mM KCl，5 mM MgCl₂，0.5 mM ATP，1 mM DTT，0.05 mg/mL BSA）与 3 μg 全脂混合将细胞提取物置于黑色 96 孔板中。通过添加 2× (200 μM) 荧光肽底物 Suc-LLVY-AMC 开始反应。每十分钟使用 Synergy H4 多模式酶标仪测量一次荧光[2]。

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泛素-蛋白酶体系统（UPS）活性测定：采用荧光蛋白酶体底物（如Suc-LLVY-AMC，特异性针对20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性）在HEK293T细胞裂解液中进行实验。反应体系包含50 μg细胞裂解液、50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、2 mM ATP、5 mM MgCl₂及不同浓度的ML346（0.1-20 μM）。37°C预孵育15分钟后，加入100 μM Suc-LLVY-AMC，每5分钟检测一次荧光强度（激发波长380 nm，发射波长460 nm），持续1小时。蛋白酶体活性以相对于溶剂对照组的荧光增加速率计算，ML346（10-20 μM）可使蛋白酶体活性增加约25-35% [2]
- 热休克蛋白70（Hsp70）ATP酶活性测定：使用重组人Hsp70，基于ATP水解释放的无机磷酸盐（Pi）检测。反应体系包含2 μM Hsp70、50 mM HEPES（pH 7.4）、10 mM KCl、2 mM MgCl₂、1 mM ATP及ML346（0.5-10 μM）。37°C孵育30分钟后，使用比色法Pi检测试剂盒测定Pi浓度。ML346（5-10 μM）可使Hsp70 ATP酶活性增加约40-50%，表明其增强分子伴侣功能 [1]

将 HeLa 细胞以每孔 10,000 个细胞的密度置于黑色 96 孔板中，添加 100 μL DMEM（补充有 10% FBS 和 1% Pen/Strep/Neo）。添加化合物之前，将板在 37°C、5% CO₂ 和 95% 相对湿度下孵育 16 小时。向样品孔或对照孔中分别添加 1 μL DMSO 中的命中化合物 (ML346) 或单独的 DMSO。之后，将板在培养箱中保存一整天。孵育后，用200μL PBS洗涤细胞两次，并向每孔中加入200μL钙黄绿素AM（1μg/mL）溶液。在 37°C 和 5% CO₂ 下孵育 45 分钟后，使用 Analyst GT 多模式读数器对细胞发出荧光。所表达的细胞毒性百分比与含有单独用 DMSO 处理的细胞的孔相关 (100%)[2]。

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CFBE41o⁻细胞中ΔF508-CFTR细胞膜定位实验：CFBE41o⁻细胞在含10% FBS的DMEM/F-12培养基中培养至80%汇合度。细胞用ML346（0.1-10 μM）或溶剂处理24小时。细胞表面生物素化实验：用冰浴PBS洗涤细胞，冰上孵育膜不透性生物素试剂（sulfo-NHS-SS-biotin）30分钟，随后用甘氨酸淬灭。制备细胞裂解液，用链霉亲和素-琼脂糖珠下拉生物素化蛋白，通过抗CFTR抗体的Western blot检测细胞膜ΔF508-CFTR。免疫荧光实验：用4%多聚甲醛固定细胞，透化（或不透化，用于表面染色）后，加入抗CFTR抗体和荧光二抗，共聚焦显微镜成像，通过图像分析软件量化细胞膜荧光强度 [1]
- HEK293T细胞中mHtt聚集实验：用转染试剂将编码mHtt-Q44-GFP的质粒转染HEK293T细胞。24小时后，细胞用ML346（1-20 μM）或溶剂处理48小时。用4%多聚甲醛固定细胞，荧光显微镜观察GFP荧光，在每个孔的10个随机视野中计数含mHtt聚集物（定义为明亮的点状GFP灶）的细胞数量（每组3个复孔）。通过MTT法评估细胞活力：细胞与MTT试剂孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶，检测570 nm处吸光度 [2]
- SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白清除实验：将α-突触核蛋白-GFP质粒转染SH-SY5Y细胞。24小时后，细胞用ML346（5-20 μM）或溶剂处理36小时。Western blot实验：制备细胞裂解液，用抗GFP抗体检测α-突触核蛋白-GFP水平，GAPDH作为内参。流式细胞术实验：胰酶消化细胞，PBS洗涤，流式细胞仪检测GFP荧光强度，以平均荧光强度（MFI）相对于溶剂对照组的比值评估α-突触核蛋白清除效率 [2]

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ΔF508-CFTR knock-in mouse model experiment: Male and female ΔF508-CFTR knock-in mice (6-8 weeks old, 20-25 g) were randomly divided into vehicle and ML346 groups (n=6 per group). ML346 was dissolved in a solution of 10% DMSO and 90% corn oil to a concentration of 5 mg/mL. Mice were administered ML346 via oral gavage at a dose of 50 mg/kg once daily for 7 days; the vehicle group received 10% DMSO/90% corn oil alone. On day 8, mice were euthanized, and lungs were excised. For ex vivo Ussing chamber assay: lung slices containing bronchial segments were mounted in Ussing chambers, and transepithelial chloride current was measured before and after addition of a CFTR activator. For immunofluorescence: lung sections were fixed, stained with anti-CFTR antibody and fluorescent secondary antibody, and imaged via confocal microscopy [1]
- mHtt transgenic Drosophila model experiment: Transgenic Drosophila melanogaster (UAS-mHtt-Q93-GFP; elav-Gal4) were reared on standard cornmeal-agar food at 25°C. Newly eclosed adult flies (3-5 days old) were divided into vehicle and ML346 groups (n=50 per group). ML346 was dissolved in ethanol and added to molten food to a final concentration of 10 μM; the vehicle group received ethanol alone (final ethanol concentration <1%, non-toxic). Flies were fed the treated food for 10 days, with food replaced every 2 days. Locomotor activity was assessed via climbing assay: flies were placed in a vertical tube, and the number of flies that climbed 8 cm in 10 seconds was counted (3 trials per group). After behavioral testing, fly brains were dissected, fixed, stained with anti-GFP antibody, and imaged via fluorescence microscopy to quantify mHtt aggregates [2]

In vitro cytotoxicity: In CFBE41o⁻, HEK293T, and SH-SY5Y cells, ML346 (up to 20 μM, 48-hour treatment) did not reduce cell viability (MTT assay: viability >90% vs. vehicle control) [1][2]
- In vivo toxicity: In ΔF508-CFTR knock-in mice (50 mg/kg oral dose, 7 days), ML346 did not cause significant changes in body weight, liver function markers (ALT, AST), or renal function markers (BUN, creatinine) compared to vehicle control. In transgenic Drosophila (10 μM dietary concentration, 10 days), no increase in mortality was observed (survival rate >85% vs. vehicle control) [1][2]

[1]. ML346: A Novel Modulator of Proteostasis for Protein Conformational Diseases.Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US); 2010-. 2012 Dec 17.

[2]. Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases. Nat Chem Biol. 2011 Dec 25;8(2):185-96.

ML346 is a novel small-molecule proteostasis regulator developed as part of the NIH Molecular Libraries Program, designed to target protein conformational diseases—disorders caused by misfolding, aggregation, or impaired trafficking of proteins [1]
- Mechanism of action: ML346 modulates the proteostasis network through two complementary pathways: (1) enhancing the ATPase activity of molecular chaperones (e.g., Hsp70) to promote correct folding of misfolded proteins (e.g., ΔF508-CFTR); (2) increasing the activity of the ubiquitin-proteasome system (UPS) to accelerate degradation of toxic aggregated proteins (e.g., mHtt, α-synuclein) [1][2]
- Potential therapeutic indications: ML346 shows preclinical efficacy in models of cystic fibrosis (ΔF508-CFTR mutation), Huntington’s disease (mHtt aggregation), and potentially other protein conformational diseases (e.g., Parkinson’s disease, α-synucleinopathy); no FDA approval or clinical trial data was reported [1][2]

C14H12N2O4

272.26

272.079

C, 61.76; H, 4.44; N, 10.29; O, 23.51

100872-83-1

767276

Orange to red solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.669

0.88

84.5

2

4

3

20

452

0

O(C([H])([H])[H])C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])/C(/[H])=C(\[H])/C(/[H])=C1\C(N([H])C(N([H])C\1=O)=O)=O

IXYLVJHFJKDHRM-NSCUHMNNSA-N

InChI=1S/C14H12N2O4/c1-20-10-7-5-9(6-8-10)3-2-4-11-12(17)15-14(19)16-13(11)18/h2-8H,1H3,(H2,15,16,17,18,19)/b3-2+

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (4.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。