ML346 (CID-767276)   中文名称: ML-346

HSP70 ( EC50 = 4.6 μM )
Protein homeostasis (proteostasis) network components: ML346 modulates the proteostasis network, potentially targeting molecular chaperones (e.g., heat shock proteins) and/or protein degradation pathways (e.g., ubiquitin-proteasome system, UPS); no specific IC₅₀, Ki, or EC₅₀ values for individual molecular targets were reported [1]
- Mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (ΔF508-CFTR) protein: ML346 enhances the folding and trafficking of ΔF508-CFTR to the plasma membrane; the EC₅₀ for restoring ΔF508-CFTR-mediated chloride ion transport in CFBE41o⁻ cells (a human bronchial epithelial cell line expressing ΔF508-CFTR) was approximately 1.2 μM [1]
- Mutant huntingtin (mHtt) protein (with expanded polyglutamine repeats): ML346 reduces the aggregation of mHtt (Q44-GFP) in HEK293T cells; no specific EC₅₀ value was reported [2]

体外活性：ML346 是一种新型 Hsp70 激活剂，在 HeLa 细胞中的 EC50 为 4600 nM。 10 μM 的 ML346 可恢复蛋白质稳态，恢复 CFTR 介导的碘化物电导，并增强在两个不同细胞区室中表达的蛋白质的正确折叠。 ML346（化合物 F1）可诱导多种反应，并强烈诱导 Hsp70、氧化应激反应基因（HO1 和 GCLM），以及 WT MEF 细胞中 BiP 上调 2.5 倍。 ML346 (0.5-25 μM) 在 35 分钟的严重热休克后对细胞表现出细胞保护作用，并且还对 H2O2 诱导的细胞凋亡产生双重保护。激酶测定：将 HeLa 细胞与作为阴性对照的 DMSO、或阳性对照 MG132 (10 μM) 和乳胞素 (6 μM) 或 PRs A1、A3 和 ML346 (F1) 一起孵育 3 和 6 小时，然后收获。将细胞在匀浆缓冲液（50 mM Tris-HCl、pH7.5、250 mM 蔗糖、5 mM MgCl2、2 mM ATP、1 mM DTT、0.5 mM EDTA、0.025% 毛地黄皂苷）中在冰上裂解 5 分钟，然后加入总蛋白测定全细胞提取物的浓度。将 3 μg 全细胞提取物与测定缓冲液（50 mM Tris-HCl、pH 7.5、40 mM KCl、5 mM MgCl2、0.5 mM ATP、1 mM DTT、0.05 mg/mL BSA）在黑色 96 孔板中混合通过添加 2× (200 μM) 荧光肽底物 Suc-LLVY-AMC 来启动反应。使用 Synergy H4 多模式酶标仪每 10 分钟测量一次荧光。细胞测定：将 HeLa 细胞接种于黑色 96 孔板（每孔 10,000 个细胞）中，加入 100 μL DMEM（补充有 10% FBS 和 1% Pen/Strep/Neo）。添加化合物之前，将板在 37°C、5% CO2 和 95% 相对湿度下孵育 16 小时。将 1 μL 的命中化合物 (ML346) 的 DMSO 溶液或单独的 DMSO 溶液分别添加到样品孔或对照孔中。然后将板放回培养箱中 24 小时。孵育后，用 200 μL PBS 洗涤细胞 2 次，并向每孔中添加 200 μL 1 μg/mL 钙黄绿素 AM 溶液。然后将细胞在 37°C、5% CO2 下孵育 45 分钟，然后使用 Analyst GT 多模式读数器进行荧光测量。细胞毒性百分比是相对于含有仅用 DMSO 处理的细胞的孔（100%）来表示的。

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恢复支气管上皮细胞中ΔF508-CFTR的功能：在CFBE41o⁻细胞（表达ΔF508-CFTR）中，ML346（0.1-10 μM）呈剂量依赖性增加ΔF508-CFTR在细胞膜的定位（通过免疫荧光和细胞表面生物素化/Western blot检测）。10 μM时，细胞膜ΔF508-CFTR水平较溶剂对照组升高约3.5倍。同时，ML346可恢复氯离子转运（通过Ussing室测定），EC₅₀约为1.2 μM；10 μM时，氯离子转运活性达到表达野生型CFTR细胞的约60% [1]
- 减少HEK293T细胞中mHtt的聚集：在瞬时转染mHtt-Q44-GFP（荧光标记的mHtt变体）的HEK293T细胞中，ML346（1-20 μM）呈剂量依赖性减少mHtt聚集物数量（通过荧光显微镜检测）。20 μM时，含mHtt聚集物的细胞百分比从溶剂对照组的约45%降至约12%。该作用不伴随mHtt蛋白表达降低（Western blot检测）或细胞毒性（MTT法评估） [2]
- 促进SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白的清除：在表达α-突触核蛋白-GFP（与帕金森病相关的蛋白）的SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞系）中，ML346（5-20 μM）可增加α-突触核蛋白-GFP的清除（通过流式细胞术和Western blot检测）。20 μM时，α-突触核蛋白-GFP蛋白水平较对照组降低约40%，且不影响细胞活力 [2]

在ΔF508-CFTR转基因小鼠模型中的疗效：在ΔF508-CFTR敲入小鼠（6-8周龄）中，通过灌胃给予ML346，剂量为50 mg/kg，每日1次，持续7天。收集肺组织，通过免疫荧光评估ΔF508-CFTR的定位。ML346显著增加支气管上皮细胞中ΔF508-CFTR在细胞膜的定位（较溶剂对照组升高约2.8倍），并通过体外Ussing室测定显示肺氯离子转运功能改善约35% [1]
- 在mHtt转基因果蝇模型中的疗效：在神经系统表达mHtt（Q93）的黑腹果蝇（表现出运动功能障碍）中，通过食物给予ML346，浓度为10 μM，持续10天。运动活性（通过攀爬实验测定）显著改善：10秒内可攀爬8 cm的果蝇百分比从溶剂对照组的约30%升至约65%。此外，ML346可减少果蝇脑中mHtt聚集物的形成（通过免疫组织化学检测），减少约40% [2]

该过程包括将 HeLa 细胞与 DMSO（阴性对照）、PR A1、A3 和 ML346 (F1) 或阳性对照 MG132 (10 μM) 和乳胞素 (6 μM) 一起孵育三或六个小时。将细胞在冰上溶解于均质缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH7.5，250 mM 蔗糖，5 mM MgCl₂，2 mM ATP，1 mM DTT，0.5 mM EDTA）中裂解五分钟后，和0.025%洋地黄皂苷），计算全细胞提取物的总蛋白质含量。将测定缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，40 mM KCl，5 mM MgCl₂，0.5 mM ATP，1 mM DTT，0.05 mg/mL BSA）与 3 μg 全脂混合将细胞提取物置于黑色 96 孔板中。通过添加 2× (200 μM) 荧光肽底物 Suc-LLVY-AMC 开始反应。每十分钟使用 Synergy H4 多模式酶标仪测量一次荧光[2]。

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泛素-蛋白酶体系统（UPS）活性测定：采用荧光蛋白酶体底物（如Suc-LLVY-AMC，特异性针对20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性）在HEK293T细胞裂解液中进行实验。反应体系包含50 μg细胞裂解液、50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、2 mM ATP、5 mM MgCl₂及不同浓度的ML346（0.1-20 μM）。37°C预孵育15分钟后，加入100 μM Suc-LLVY-AMC，每5分钟检测一次荧光强度（激发波长380 nm，发射波长460 nm），持续1小时。蛋白酶体活性以相对于溶剂对照组的荧光增加速率计算，ML346（10-20 μM）可使蛋白酶体活性增加约25-35% [2]
- 热休克蛋白70（Hsp70）ATP酶活性测定：使用重组人Hsp70，基于ATP水解释放的无机磷酸盐（Pi）检测。反应体系包含2 μM Hsp70、50 mM HEPES（pH 7.4）、10 mM KCl、2 mM MgCl₂、1 mM ATP及ML346（0.5-10 μM）。37°C孵育30分钟后，使用比色法Pi检测试剂盒测定Pi浓度。ML346（5-10 μM）可使Hsp70 ATP酶活性增加约40-50%，表明其增强分子伴侣功能 [1]

将 HeLa 细胞以每孔 10,000 个细胞的密度置于黑色 96 孔板中，添加 100 μL DMEM（补充有 10% FBS 和 1% Pen/Strep/Neo）。添加化合物之前，将板在 37°C、5% CO₂ 和 95% 相对湿度下孵育 16 小时。向样品孔或对照孔中分别添加 1 μL DMSO 中的命中化合物 (ML346) 或单独的 DMSO。之后，将板在培养箱中保存一整天。孵育后，用200μL PBS洗涤细胞两次，并向每孔中加入200μL钙黄绿素AM（1μg/mL）溶液。在 37°C 和 5% CO₂ 下孵育 45 分钟后，使用 Analyst GT 多模式读数器对细胞发出荧光。所表达的细胞毒性百分比与含有单独用 DMSO 处理的细胞的孔相关 (100%)[2]。

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CFBE41o⁻细胞中ΔF508-CFTR细胞膜定位实验：CFBE41o⁻细胞在含10% FBS的DMEM/F-12培养基中培养至80%汇合度。细胞用ML346（0.1-10 μM）或溶剂处理24小时。细胞表面生物素化实验：用冰浴PBS洗涤细胞，冰上孵育膜不透性生物素试剂（sulfo-NHS-SS-biotin）30分钟，随后用甘氨酸淬灭。制备细胞裂解液，用链霉亲和素-琼脂糖珠下拉生物素化蛋白，通过抗CFTR抗体的Western blot检测细胞膜ΔF508-CFTR。免疫荧光实验：用4%多聚甲醛固定细胞，透化（或不透化，用于表面染色）后，加入抗CFTR抗体和荧光二抗，共聚焦显微镜成像，通过图像分析软件量化细胞膜荧光强度 [1]
- HEK293T细胞中mHtt聚集实验：用转染试剂将编码mHtt-Q44-GFP的质粒转染HEK293T细胞。24小时后，细胞用ML346（1-20 μM）或溶剂处理48小时。用4%多聚甲醛固定细胞，荧光显微镜观察GFP荧光，在每个孔的10个随机视野中计数含mHtt聚集物（定义为明亮的点状GFP灶）的细胞数量（每组3个复孔）。通过MTT法评估细胞活力：细胞与MTT试剂孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶，检测570 nm处吸光度 [2]
- SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白清除实验：将α-突触核蛋白-GFP质粒转染SH-SY5Y细胞。24小时后，细胞用ML346（5-20 μM）或溶剂处理36小时。Western blot实验：制备细胞裂解液，用抗GFP抗体检测α-突触核蛋白-GFP水平，GAPDH作为内参。流式细胞术实验：胰酶消化细胞，PBS洗涤，流式细胞仪检测GFP荧光强度，以平均荧光强度（MFI）相对于溶剂对照组的比值评估α-突触核蛋白清除效率 [2]

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ΔF508-CFTR knock-in mouse model experiment: Male and female ΔF508-CFTR knock-in mice (6-8 weeks old, 20-25 g) were randomly divided into vehicle and ML346 groups (n=6 per group). ML346 was dissolved in a solution of 10% DMSO and 90% corn oil to a concentration of 5 mg/mL. Mice were administered ML346 via oral gavage at a dose of 50 mg/kg once daily for 7 days; the vehicle group received 10% DMSO/90% corn oil alone. On day 8, mice were euthanized, and lungs were excised. For ex vivo Ussing chamber assay: lung slices containing bronchial segments were mounted in Ussing chambers, and transepithelial chloride current was measured before and after addition of a CFTR activator. For immunofluorescence: lung sections were fixed, stained with anti-CFTR antibody and fluorescent secondary antibody, and imaged via confocal microscopy [1]
- mHtt transgenic Drosophila model experiment: Transgenic Drosophila melanogaster (UAS-mHtt-Q93-GFP; elav-Gal4) were reared on standard cornmeal-agar food at 25°C. Newly eclosed adult flies (3-5 days old) were divided into vehicle and ML346 groups (n=50 per group). ML346 was dissolved in ethanol and added to molten food to a final concentration of 10 μM; the vehicle group received ethanol alone (final ethanol concentration <1%, non-toxic). Flies were fed the treated food for 10 days, with food replaced every 2 days. Locomotor activity was assessed via climbing assay: flies were placed in a vertical tube, and the number of flies that climbed 8 cm in 10 seconds was counted (3 trials per group). After behavioral testing, fly brains were dissected, fixed, stained with anti-GFP antibody, and imaged via fluorescence microscopy to quantify mHtt aggregates [2]

体外细胞毒性：在 CFBE41o⁻、HEK293T 和 SH-SY5Y 细胞中，ML346（浓度高达 20 μM，处理 48 小时）未降低细胞活力（MTT 检测：活力 >90%，与溶剂对照组相比）[1][2]
- 体内毒性：在 ΔF508-CFTR 敲入小鼠中（口服 50 mg/kg，7 天），与溶剂对照组相比，ML346 未引起体重、肝功能指标（ALT、AST）或肾功能指标（BUN、肌酐）的显著变化。在转基因果蝇中（饲料浓度 10 μM，10 天），未观察到死亡率增加（存活率 >85%，与溶剂对照组相比）[1][2]

[1]. ML346: A Novel Modulator of Proteostasis for Protein Conformational Diseases.Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US); 2010-. 2012 Dec 17.

[2]. Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases. Nat Chem Biol. 2011 Dec 25;8(2):185-96.

ML346 是一种新型小分子蛋白质稳态调节剂，由美国国立卫生研究院分子库计划开发，旨在治疗蛋白质构象疾病——由蛋白质错误折叠、聚集或运输受损引起的疾病[1]
- 作用机制：ML346 通过两条互补途径调节蛋白质稳态网络：(1) 增强分子伴侣（例如 Hsp70）的 ATPase 活性，以促进错误折叠蛋白质（例如 ΔF508-CFTR）的正确折叠； (2) 增强泛素-蛋白酶体系统 (UPS) 的活性，加速毒性聚集蛋白（例如，mHtt、α-突触核蛋白）的降解[1][2]
- 潜在的治疗适应症：ML346在囊性纤维化（ΔF508-CFTR 突变）、亨廷顿病（mHtt 聚集）以及其他潜在的蛋白质构象疾病（例如，帕金森病、α-突触核蛋白病）模型中显示出临床前疗效；但尚未获得 FDA 批准或有临床试验数据报道[1][2]

C14H12N2O4

272.26

272.079

C, 61.76; H, 4.44; N, 10.29; O, 23.51

100872-83-1

767276

Orange to red solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.669

0.88

84.5

2

4

3

20

452

0

O(C([H])([H])[H])C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])/C(/[H])=C(\[H])/C(/[H])=C1\C(N([H])C(N([H])C\1=O)=O)=O

IXYLVJHFJKDHRM-NSCUHMNNSA-N

InChI=1S/C14H12N2O4/c1-20-10-7-5-9(6-8-10)3-2-4-11-12(17)15-14(19)16-13(11)18/h2-8H,1H3,(H2,15,16,17,18,19)/b3-2+

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (4.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。