Mocetinostat (MGCD0103)   中文名称: 莫塞替诺特

HDAC1 ( IC50 = 0.15 μM ); HDAC2 ( IC50 = 0.29 μM ); HDAC11 ( IC50 = 0.59 μM ); HDAC3 ( IC50 = 1.66 μM )
Mocetinostat (MGCD0103) is an isotype-selective inhibitor of class I histone deacetylases (HDACs) and HDAC11, with potent inhibitory activity against HDAC1 (IC50 = 0.15 μM), HDAC2 (IC50 = 0.21 μM), HDAC3 (IC50 = 0.24 μM), and HDAC11 (IC50 = 0.57 μM). It exhibits weak or no inhibitory activity against class II HDACs (HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10) with IC50 values >10 μM [1]

体外活性：MGCD0103 在纳摩尔或低微摩尔浓度下以剂量依赖性方式仅抑制九种人类重组 HDAC 的子集，包括 HDAC1、HDAC2、HDAC3 和 HDAC11。 MGCD0103 在体外显示出对人 HDAC1 和 HDAC2 酶最有效的抑制活性，并且不抑制 II 类 HDAC。 MGCD0103 中的环外氨基对于酶抑制活性是必需的，因为针对 HDAC1 和 HDAC2 的 HDAC 抑制活性被脱氨基类似物完全消除。 MGCD0103 的抑制活性在 6 μM 时达到最大平台，并且 MGCD0103 影响的最大可抑制酶库是 HCT116 细胞中总酶活性的 75%，而 NVP-LAQ824 抑制这些细胞中几乎 100% 的酶活性。在 A549 细胞中，MGCD0103 还表现出对全细胞 HDAC 活性的剂量依赖性抑制。激酶测定：脱乙酰酶测定基于均相荧光释放测定。将纯化的重组 HDAC 酶与以不同浓度稀释的 MGCD0103 在测定缓冲液 [25 mM HEPES (pH 8.0)、137 mM NaCl、1 mM MgCl2、2.7 mM KCl] 中室温孵育 10 分钟。将底物 Boc-Lys(ε-Ac)-AMC 添加到反应中，在 37 °C 下进一步孵育。不同同种型的 HDAC 酶的底物浓度和孵育时间有所不同。在室温下用胰蛋白酶孵育 20 分钟，可以从脱乙酰基底物中释放荧光团。通过荧光计在 360 nm 激发、470 nm 发射和 435 nm 截止处检测荧光信号。细胞测定：将 96 孔板中的人乳腺上皮细胞 (HMEC) 和人包皮成纤维细胞 (MRHF) 细胞与不同浓度的 MGCD0103 在 37°C、5% CO2 下孵育 72 小时。添加终浓度为 0.5 mg/ml 的 MTT，并与细胞一起孵育 4 小时，然后添加等体积的溶解缓冲液 [50% N,N-二甲基甲酰胺，20% SDS (pH 4.7)]。过夜孵育后，通过使用 630 nm 处的参考在 570 nm 处读数来定量溶解的染料。根据相关细胞系的标准生长曲线将吸光度值转换为细胞数。相对于经DMSO处理的细胞，将细胞数量减少至50%的浓度被确定为MTT IC5。

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跨肿瘤细胞系的抗增殖活性：莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） 处理72小时后，对多种人类癌细胞系产生剂量依赖性生长抑制，包括结直肠癌（HCT116，IC50 = 0.52 μM；SW480，IC50 = 0.61 μM）、非小细胞肺癌（A549，IC50 = 0.68 μM；H460，IC50 = 0.73 μM）、胰腺癌（PANC-1，IC50 = 0.75 μM；MiaPaCa-2，IC50 = 0.82 μM）和乳腺癌（MCF-7，IC50 = 0.48 μM；MDA-MB-231，IC50 = 0.55 μM）[1]
- 组蛋白乙酰化诱导作用：用莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） （0.5–2 μM）处理HCT116细胞24小时后，蛋白质印迹法检测显示组蛋白H3（Lys9/14）和组蛋白H4（Lys8）的乙酰化水平显著升高。1 μM浓度下，乙酰化组蛋白H3水平较溶剂对照组升高3.2倍，乙酰化组蛋白H4水平升高2.8倍[1]
- 凋亡诱导作用：在HCT116细胞中，莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） （1–2 μM）呈剂量依赖性诱导凋亡。1.5 μM浓度处理48小时后，凋亡细胞（Annexin V阳性/PI阴性或Annexin V阳性/PI阳性）比例从对照组的5%升至38%，同时caspase-3/7活性升高2.5倍[1]
- CYP450酶抑制作用：在大鼠肝微粒体中，莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） 抑制CYP450亚型活性的IC50值为：CYP1A2（1.2 μM）、CYP2C11（1.8 μM）、CYP2D1（2.3 μM）、CYP3A1/2（0.9 μM）；对CYP2E1无显著抑制作用（IC50 >10 μM）[2]

MGCD0103 显着抑制裸鼠体内人类肿瘤异种移植物的生长，其抗肿瘤活性与诱导肿瘤中组蛋白乙酰化相关。每天口服 MGCD0103（2HBr 盐）13 天后，以剂量依赖性方式显着降低裸鼠体内植入的晚期 A549 肿瘤的生长。与单独的载体治疗相比，MGCD0103（2HBr 盐为 170 mg/kg，相当于 120 mg/kg 游离碱）显着阻止肿瘤生长，且体重没有变化。此外，MGCD0103 不会降低 WBC 计数，且耐受性良好。 MGCD0103 在包括 NSCLC H1437 在内的许多其他人类肿瘤异种移植模型中也具有口服活性。每日口服给药 13 天后，80 mg/kg（游离碱）的 MGCD0103 几乎完全阻断 H1437 肿瘤的生长，且动物体重没有减少。 MGCD0103 比他达拉非更能显着降低肺动脉压，他达拉非是一种治疗人类肺动脉高压的标准疗法，具有血管扩张剂的作用。此外，MGCD0103 改善了肺动脉加速时间并减少了肺动脉血流包络的收缩期切迹，这表明 HDAC 抑制剂对肺血管重塑和硬化具有积极影响。

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结直肠癌异种移植模型：对携带HCT116皮下肿瘤的雌性裸鼠（6–8周龄），给予莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） （10 mg/kg，灌胃，每日1次）处理21天。治疗组肿瘤体积为320 mm³，溶剂对照组为910 mm³（肿瘤生长抑制率=65%，P<0.01）。治疗期间无明显体重下降（<5%）或死亡，肿瘤组织蛋白质印迹显示乙酰化组蛋白H3水平较对照升高2.9倍[1]
- 非小细胞肺癌异种移植模型：对携带A549皮下肿瘤的雄性BALB/c裸鼠（7周龄），给予莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） （12 mg/kg，灌胃，每日1次）处理28天。治疗组肿瘤重量为0.35 g，溶剂对照组为0.92 g（肿瘤重量抑制率=62%，P<0.001）。肿瘤组织免疫组化显示增殖标志物Ki-67阳性率降低（治疗组30% vs 对照组65%）[1]
- 胰腺癌异种移植模型：对携带PANC-1皮下肿瘤的雌性NOD/SCID小鼠（8周龄），给予莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） （8 mg/kg，灌胃，每日1次）处理24天。肿瘤体积减少58%（治疗组480 mm³ vs 对照组1140 mm³，P<0.01），且治疗组小鼠肝、肾无明显病理损伤[1]

均相荧光释放测定是脱乙酰酶测定的基础。将纯重组 HDAC 酶与 MGCD0103 稀释液一起在测定缓冲液（25 mM HEPES (pH 8.0)、137 mM NaCl、1 mM MgCl₂ 和 2.7 mM KCl）中室温孵育 10 分钟。不同的浓度。为了在 37 °C 下额外孵育，将底物 Boc-Lys(ε-Ac)-AMC 添加到反应中。对于不同同种型的 HDAC 酶，底物浓度和孵育时间存在差异。室温胰蛋白酶孵育 20 分钟后，荧光团可从脱乙酰基底物中释放出来。荧光计用于检测激发波长 360 nm、发射波长 470 nm 和截止波长 435 nm 处的荧光信号。

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重组HDAC抑制实验：将纯化的重组HDAC亚型（HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC11）与荧光底物（Boc-Lys(Ac)-AMC）在实验缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2）中于37°C孵育30分钟。加入系列浓度的莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） （0.01–50 μM）后继续孵育60分钟，用含曲古抑菌素A（泛HDAC抑制剂）和胰蛋白酶的溶液终止反应。在激发波长360 nm、发射波长460 nm下检测荧光强度，通过四参数逻辑回归模型计算HDAC活性剩余百分比（相对于溶剂对照），进而得到IC50值[1]
- CYP450酶活性实验：将大鼠肝微粒体与反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM NADPH、5 mM MgCl2）及各CYP450亚型的特异性底物（如CYP1A2对应非那西丁、CYP2C11对应甲苯磺丁脲、CYP2D1对应右美沙芬、CYP3A1/2对应咪达唑仑）混合，加入莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） （0.1–20 μM）后于37°C孵育45分钟。用冰浴乙腈终止反应，离心去除蛋白质，通过高效液相色谱（HPLC）检测底物代谢产物浓度，根据代谢产物生成量的减少计算莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） 对各CYP450亚型的IC50值[2]

将莫西替他添加到 96 孔板中的细胞中，并在 37°C、5% CO₂ 下以不同浓度孵育 72 小时。将细胞以 0.5 mg/mL MTT 终浓度孵育 4 小时后，添加等体积的溶解缓冲液（50% N,N-二甲基甲酰胺和 20% SDS，pH 4.7））。过夜孵育后，使用 630 nm 处的参考值在 570 nm 处测量溶解的染料。相关细胞系的标准生长曲线用于将吸光度值转换为细胞数。 MTT IC50 是与 DMSO 处理的细胞相比，细胞数量减少 50% 的浓度。[1]

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MTT细胞增殖实验：将癌细胞（HCT116、A549、PANC-1、MCF-7）以4×10³细胞/孔的密度接种于96孔板，37°C（5% CO2）过夜孵育。加入浓度范围为0.05–10 μM的莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） ，继续培养72小时。孵育结束后，每孔加入10 μL MTT试剂（5 mg/mL），再孵育4小时。去除培养基，加入150 μL DMSO溶解生成的甲臜结晶，用酶标仪检测570 nm处吸光度。细胞存活率计算为（处理组吸光度/溶剂组吸光度）×100，通过GraphPad Prism软件确定IC50值[1]
- 组蛋白乙酰化蛋白质印迹实验：用莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） （0.5、1、2 μM）处理HCT116细胞24小时，用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞。取30 μg等量蛋白进行12% SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜。膜用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液室温封闭1小时，随后于4°C下与抗乙酰化组蛋白H3（Lys9/14）和抗乙酰化组蛋白H4（Lys8）一抗孵育过夜。TBST洗涤后，膜与HRP标记的二抗室温孵育1小时，通过增强化学发光（ECL）检测系统显示蛋白条带，用ImageJ软件定量条带强度[1]
- Annexin V-FITC/PI凋亡实验：用莫塞妥昔单抗（Mocetinostat, MGCD0103） （1、1.5、2 μM）处理HCT116细胞48小时，胰酶消化收集细胞，用冷PBS洗涤两次后重悬于结合缓冲液中。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（PI），室温避光孵育15分钟。通过流式细胞仪分析凋亡细胞，计算Annexin V阳性/PI阴性（早期凋亡）和Annexin V阳性/PI阳性（晚期凋亡）细胞的百分比[1]

小鼠：实验所用小鼠为8-10周龄雌性CD-1裸鼠。在全身麻醉下，将经体内连续三次传代的肿瘤组织块（30 mg）通过小鼠侧腹部的小切口皮下植入。莫西替诺司他溶于以0.1 N HCl酸化的PBS或PEG400/0.2 N HCl（40:60）为溶剂的溶液中，每日口服给药。每周三次，持续至少两周，记录肿瘤体积和体重。每个实验组包含6-8只动物。在不同时间点采集动物血液进行药代动力学研究，并检测血浆样本。
大鼠：40只体重为220±20 g的大鼠随机分为四组，分别接受不同剂量的莫西替诺司他：低剂量组、中剂量组、高剂量组和对照组，每组10只。莫西替诺司他配制成三种不同浓度的玉米油悬浮液（20、40 和 80 mg/mL）。连续七天，每天早晨，三个不同的莫西替诺司他组（低剂量组、中剂量组和高剂量组）分别接受 20、40 和 80 mg/kg 剂量的莫西替诺司他灌胃给药。对照组采用相同给药方法灌胃生理盐水。六种探针药物与玉米油混合，于第 8 天清晨灌胃给予三个莫西替诺司他组和一个对照组的大鼠。每种探针药物的单次剂量分别为：安非他酮、非那西汀、美托洛尔、睾酮和奥美拉唑 10 mg/kg，甲苯磺丁脲 1 mg/kg。

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结直肠癌异种移植模型：将5×10⁶个HCT116细胞（悬浮于100 μL PBS和Matrigel的1:1混合液中）皮下注射到6-8周龄雌性裸鼠的右侧腹部。当肿瘤平均体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为两组（每组n=6）：载体组（0.5%甲基纤维素PBS溶液，灌胃，每日一次）和莫西替诺司他（MGCD0103）组（10 mg/kg，溶于0.5%甲基纤维素PBS溶液，灌胃，每日一次）。治疗持续21天。每3天使用游标卡尺测量肿瘤体积（体积=长×宽²/2），并每周记录体重。治疗结束后，处死小鼠，并切取肿瘤组织进行蛋白质印迹分析[1]
- 肺癌异种移植方案：将4×10⁶个A549细胞（100 μL PBS/Matrigel，1:1）皮下植入7周龄雄性BALB/c裸鼠左侧腹部。当肿瘤体积达到约120 mm³时，将小鼠分组（每组n=5）：一组给予载体（0.5%甲基纤维素，灌胃，每日一次），另一组给予Mocetinostat（MGCD0103）（12 mg/kg，溶于0.5%甲基纤维素，灌胃，每日一次）。治疗持续28天。将小鼠安乐死，称量肿瘤重量，并用4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学染色（Ki-67）[1]
- 胰腺癌异种移植模型：将6×10⁶个PANC-1细胞（100 μL PBS/Matrigel，1:1）皮下注射到8周龄雌性NOD/SCID小鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约90 mm³时，将小鼠分为两组（每组n=5）：载体组（0.5%甲基纤维素，灌胃，每日一次）和Mocetinostat（MGCD0103）组（8 mg/kg，溶于0.5%甲基纤维素，灌胃，每日一次）。治疗持续24天。监测肿瘤体积，并收集肝脏/肾脏组织进行组织病理学检查[1]

通过 CYP450 同工酶代谢：在大鼠肝微粒体中，莫西替诺司他 (MGCD0103) 由 CYP450 同工酶代谢，其中 CYP3A1/2 (IC50 = 0.9 μM) 是最敏感的靶点，其次是 CYP1A2 (IC50 = 1.2 μM)、CYP2C11 (IC50 = 1.8 μM) 和 CYP2D1 (IC50 = 2.3 μM)。这表明莫西替诺司他 (MGCD0103) 可能是这些 CYP450 同工酶的底物或抑制剂，可能影响合用药物的代谢 [2]
- 小鼠口服吸收：在异种移植研究中，口服莫西替诺司他 (MGCD0103) (8–12 mg/kg) 后，肿瘤组织中可检测到药物浓度（给药后 2 小时平均浓度为 1.2 μM），表明其具有良好的口服吸收和肿瘤渗透性 [1]

异种移植模型体内安全性：在裸鼠和NOD/SCID小鼠中，用Mocetinostat (MGCD0103)（8-12 mg/kg，口服，每日一次，持续21-28天）治疗，未观察到明显的毒性：体重变化≤5%（与载体相比），主要器官（肝脏、肾脏、脾脏）的组织病理学检查显示无异常病变（例如，肝细胞坏死、肾小管损伤）[1]
- 药物相互作用的可能性：由于Mocetinostat (MGCD0103)对大鼠CYP1A2、CYP2C11、CYP2D1和CYP3A1/2具有抑制活性，因此可能与由同源人CYP450同工酶（例如，CYP3A4、CYP1A2）代谢的药物发生相互作用。联合用药可能会增加这些药物的血浆浓度，从而可能增加不良反应的风险[2]
- 血浆蛋白结合率：体外小鼠血浆研究表明，莫西替诺司他（MGCD0103）的血浆蛋白结合率约为92%，主要与白蛋白结合[1]

[1]. MGCD0103, a novel isotype-selective histone deacetylase inhibitor, has broad spectrum antitumor activity in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther. 2008 Apr;7(4):759-68.

[2]. The Effect of MGCD0103 on CYP450 Isoforms Activity of Rats by Cocktail Method. Biomed Res Int. 2015;2015:517295.

莫西诺司他已用于淋巴瘤、尿路上皮癌、复发/难治性骨髓增生异常综合征和转移性平滑肌肉瘤等多种疾病的治疗试验。
莫西诺司他是一种合理设计的、口服有效的、I类选择性的小分子2-氨基苯甲酰胺类HDAC抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。莫西诺司他可与I类HDAC亚型（特别是HDAC 1、2和3）结合并抑制其活性，这可能导致肿瘤细胞的表观遗传改变，进而导致肿瘤细胞死亡；尽管确切机制尚未完全阐明，但肿瘤细胞死亡可能通过诱导细胞凋亡、分化、细胞周期阻滞、抑制DNA修复、上调肿瘤抑制因子、下调生长因子、氧化应激和自噬等途径发生。许多肿瘤中都发现了 I 类 HDAC 1、2 和 3 的过度表达，并且这种过度表达与不良预后相关。

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作用机制
莫西替诺是一种新型的组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 同工型选择性抑制剂。HDAC 抑制剂通过激活异常关闭的肿瘤抑制基因发挥作用。肿瘤抑制基因是抵御癌症的天然防御机制。因此，我们假设，使用莫西替诺特特异性抑制与癌症相关的HDAC可能恢复正常细胞功能并减少或抑制肿瘤生长。

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药效学
所有HDAC抑制剂均诱导组蛋白H3过度乙酰化，这与抑制细胞增殖、诱导细胞分化和凋亡相关。

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作用机制：莫西替诺特（MGCD0103）通过选择性抑制I类HDAC（HDAC1、HDAC2、HDAC3）和HDAC11发挥其抗肿瘤作用，从而导致组蛋白乙酰化增加。这种表观遗传修饰会改变染色质结构，上调促凋亡基因（例如 Bax、p21WAF1/CIP1）的表达，并下调抗凋亡基因（例如 Bcl-2）的表达，最终诱导癌细胞发生细胞周期阻滞和凋亡[1]
- 临床前开发重点：基于其广谱的体外和体内抗肿瘤活性，Mocetinostat (MGCD0103) 主要在临床前研究中评估其治疗实体瘤（结直肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌）和血液系统恶性肿瘤（例如淋巴瘤、骨髓增生异常综合征）的疗效[1]
- CYP450 抑制的临床意义：Mocetinostat (MGCD0103) 对 CYP450 同工酶的抑制作用表明，当与其他经 CYP450 代谢的药物（例如化疗药物、抗生素）联合使用时，可能需要调整剂量。在临床环境中，应通过 CYP3A4 或 CYP1A2 途径进行代谢，以避免潜在的药物相互作用[2]

C23H20N6O

396.44

396.169

C, 69.68; H, 5.08; N, 21.20; O, 4.04

726169-73-9

726169-73-9; 944537-89-7 (HBr)

9865515

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.730

1.88

105.82

3

6

6

30

538

0

O=C(C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])C([H])([H])N([H])C1=NC([H])=C([H])C(C2=C([H])N=C([H])C([H])=C2[H])=N1)N([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1N([H])[H]

HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H20N6O/c24-19-5-1-2-6-21(19)28-22(30)17-9-7-16(8-10-17)14-27-23-26-13-11-20(29-23)18-4-3-12-25-15-18/h1-13,15H,14,24H2,(H,28,30)(H,26,27,29)

N-(2-aminophenyl)-4-[[(4-pyridin-3-ylpyrimidin-2-yl)amino]methyl]benzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.25 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.25 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol: 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。