PHD1 (IC50 = 480 nM); PHD2 (IC50 = 280 nM); PHD3 (IC50 =450 nM)[1]
Molidustat (BAY 85-3934) targets hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylases (HIF-PHs, including PHD2); [1]
Molidustat targets hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylases (HIF-PHs); [2]

对于 PHD1、PHD2 和 PHD3，BAY 85-3934 的平均 IC50 值分别为 480 nM、280 nM 和 450 nM。 HeLa 细胞只需暴露于 5 μM BAY 85-3934 20 分钟即可产生可检测水平的 HIF-1α。使用缺氧反应元件启动子作为对照，BAY 85-3934 在细胞报告基因测定中诱导萤火虫荧光素酶报告基因的表达，平均 (± SD) EC50 为 8.4±0.7 μM (n=4) [1] 。

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1. Molidustat (BAY 85-3934)以浓度依赖的方式抑制缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶（PHD2）的活性，且该抑制作用受2-氧戊二酸、Fe²⁺和抗坏血酸浓度的调控；研究人员检测了不同辅因子浓度下PHD2的残余活性，并以无药物时的基础活性（100%）和残余活性（0%）为参照进行归一化处理 [1]
2. Western blot分析显示，Molidustat (BAY 85-3934)可诱导HeLa、A549和Hep3B细胞中HIF-1α和HIF-2α的表达；在HeLa细胞中，加入含5 µM Molidustat (BAY 85-3934)的无血清培养基后，HIF-1α的表达呈时间依赖性上调；在A549细胞中，20 µM Molidustat (BAY 85-3934)诱导产生的HIF-1α，在将培养基替换为含环己酰亚胺（100 µM）的培养基后呈时间依赖性下降 [1]
3. 在A549 HIF-RE2报告基因细胞中，Molidustat (BAY 85-3934)以浓度依赖的方式增加荧光素酶活性，且额外添加Fe²⁺会影响该诱导效应；荧光素酶活性以相对荧光素酶单位（RLUs）表示 [1]
4. HeLa、A549和Hep3B细胞暴露于Molidustat (BAY 85-3934)后，一组HIF靶基因的mRNA表达水平上调（以基线水平的倍数增加） [1]

当健康 Wistar 大鼠和食蟹猴口服 HIF-PH 抑制剂 BAY 85-3934 (Molidustat) 时，它可以稳定 HIF 并导致 EPO 的剂量依赖性产生。与 rhEPO 治疗相比，除了使 CKD 大鼠模型的高血压血压正常化外，莫度司他治疗还可有效控制肾功能受损大鼠的肾性贫血 [1]。

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1. 在健康雄性Wistar大鼠中，单次口服Molidustat (BAY 85-3934)可剂量依赖性升高4小时时的血浆促红细胞生成素（EPO）水平和72小时时的网织红细胞比例（占红细胞[RBCs]的百分比）；数据汇总自两项连续实验（每组n = 2×5只动物），与溶媒组相比差异具有统计学意义（p<0.05、p<0.01、p<0.001，非配对t检验） [1]
2. 雄性Wistar大鼠每日一次口服Molidustat (BAY 85-3934)，可剂量依赖性升高压积（PCV）（每组n = 12只动物），与溶媒组相比差异具有统计学意义（p<0.01、p<0.001，双向方差分析结合Dunnett多重比较检验） [1]
3. 雄性Wistar大鼠每日一次口服Molidustat (BAY 85-3934)（2.5 mg/kg）可诱导红细胞生成，效果与每周两次皮下注射重组人EPO（rhEPO）相当（每组n = 10只动物），第30天时相关促红细胞生成参数显著升高（p<0.001，t检验） [1]
4. 雄性Wistar大鼠口服Molidustat (BAY 85-3934)（5 mg/kg）后，检测了血浆药物浓度、肾脏EPO相对mRNA表达量和血浆EPO水平（每组n = 5只动物）；同时，大鼠肾脏中HIF靶基因的mRNA表达水平上调（基线表达设为1，每组n = 5只动物） [1]
5. 在食蟹猴中，重复口服Molidustat (BAY 85-3934)可剂量依赖性升高血浆EPO浓度（每组n = 6只动物）；单次口服Molidustat (BAY 85-3934)（1.5 mg/kg）和单次皮下注射rhEPO（100 IU/kg）均可升高血浆EPO浓度（每组n = 3只动物）；每周两次皮下注射rhEPO（100 IU/kg）持续2周，或每日一次口服Molidustat (BAY 85-3934)（1.5 mg/kg）持续2周，均可改善促红细胞生成参数（血红蛋白[HGB]、红细胞[RBCs]、网织红细胞）（每组n = 3只动物） [1]
6. 在庆大霉素诱导肾性贫血的雄性Wistar大鼠中，口服Molidustat (BAY 85-3934)可升高4小时时的血浆EPO水平，并上调肾脏和肝脏中EPO的mRNA表达（每组n = 5只动物），与溶媒组和对照组相比差异具有统计学意义（p<0.05、p<0.01、p<0.001，t检验）；肾脏和肝脏中HIF靶基因的mRNA表达水平也上调（每组n = 4至5只动物）；每日一次口服Molidustat (BAY 85-3934)（每周五次），第22天时可升高压积和血红蛋白水平，与溶媒组相比差异具有统计学意义（p<0.05、p<0.01、p<0.001，t检验） [1]
7. 在肽聚糖-多糖（PG-PS）诱导炎症性贫血的雌性Lewis大鼠中，口服Molidustat (BAY 85-3934)可升高压积（每组n = 11–12只动物）；研究结束时，可调控肾脏中EPO和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的mRNA表达，以及肝脏中铁调素的mRNA表达（p<0.05、p<0.01、p<0.001，t检验） [1]
8. 在大鼠次全肾切除模型（CKD模型）中，每日一次口服Molidustat (BAY 85-3934)（2.5 mg/kg或5 mg/kg）持续5周，可升高压积、使收缩压（SBP）恢复正常，且不会引起肾素-血管紧张素系统的代偿性激活（肾素原水平无异常升高）；与每周两次皮下注射rhEPO（100 IU/kg）持续5周相比，Molidustat (BAY 85-3934)不会诱导高血压（每组n = 4–6只动物）；在饮用水中给予Molidustat (BAY 85-3934)钠（80 ppm）、依那普利（30 ppm）或两者联用持续5周，也可改善压积、使收缩压恢复正常（第4周），且不会升高肾素原水平（每组n = 9–10只动物），与假手术组或对照组相比差异具有统计学意义（p<0.05、p<0.01、p<0.001，单因素方差分析结合Dunnett/Bonferroni多重比较检验） [1]
9. 在一项针对既往接受促红细胞生成素刺激剂（ESAs）治疗的日本非透析肾性贫血（CKD 3-5期）患者的3期临床研究中，Molidustat（起始剂量25 mg或50 mg每日一次，根据既往ESA剂量调整，滴定剂量以维持血红蛋白11.0-13.0 g/dL）在评估期（第30-36周）的平均血红蛋白水平为11.67（95%置信区间：11.48-11.85）g/dL，非劣效于达依泊汀α（起始剂量根据既往ESA剂量调整，每2或4周皮下注射一次，滴定剂量以维持血红蛋白11.0-13.0 g/dL；平均血红蛋白：11.53 [95%置信区间：11.31-11.74] g/dL）；血红蛋白较基线变化的最小二乘均数差值（Molidustat组-达依泊汀α组）为0.13（95%置信区间：-0.15, 0.40）g/dL（非劣效性界值：1.0 g/dL） [2]

脯氨酰羟化酶测定[1]
脯氨酰羟化酶测定如前所述，稍作修改。生物素化HIF-1α556–574（生物素DLDLDLELMLAPYIPMDDDFQL）与白色96孔NeutrAvidin高结合能力板结合，该板用阻断剂酪蛋白预阻断，随后用1 mM生物素阻断。将固定的肽底物与适量的HIF-PH在含有20 mM Tris（PH 7.5）、5 mM KCl、1.5 mM MgCl2、20µM 2-酮戊二酸、10µM FeSO4、2 mM抗坏血酸、4%蛋白酶抑制剂（不含EDTA，罗氏诊断公司）的缓冲液中孵育，最终体积为100µl，加入或不加入适当浓度的测试化合物。反应时间为60分钟。为了停止反应，用洗涤缓冲液洗涤板三次。[1]
羟基化生物素-HHIF-1α556–574与Eu-VBC在100µl结合缓冲液（50 mM Tris[pH 7.5]，120 mM NaCl）中在室温下孵育60分钟。用DELFIA洗涤缓冲液洗涤六次并加入100µl增强剂溶液后，通过Tecan无限M200平板读数器测量时间分辨荧光来确定结合的VBC的量。测量重复三次或更多次，结果以平均值±SEM表示。使用GraphPad Prism软件对数据集应用四参数逻辑方程进行曲线拟合后，确定IC50值。当需要调节游离Fe2+的浓度时，向反应缓冲液中补充适量的硫酸铁（II）铵（（NH4）2Fe（SO4）2.6H2O，莫尔盐）。

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1. 为评估Molidustat (BAY 85-3934)对PHD2的抑制活性，在加入该药物的体系中，通过添加递增浓度的2-氧戊二酸、Fe²⁺和抗坏血酸，绘制PHD2活性的浓度-反应曲线；活性数据以4次重复实验的均值±标准误表示，并以无药物时的基础活性（100%）和残余活性（0%）为参照进行归一化处理 [1]

细胞系、细胞培养基和萤光素酶报告测定[1]
A549和HeLa癌细胞系（美国典型培养物保藏中心）在DMEM/F-12中培养，Hep3B细胞在RPMI培养基中培养，两者均添加了抗生素、L-谷氨酰胺和10%胎牛血清。用HIF-RE2-luc HIF报告构建体（在pGL3中构建）稳定转染的A549细胞以2500个细胞/孔的密度接种在384孔板上，体积为25µl的完整细胞培养基中，并在测试前重新孵育16-24小时。以10µl的体积加入适当稀释的试验化合物，并在测量前将细胞重新孵育6小时。在加入细胞裂解/萤光素酶缓冲液后，在光度计中测定萤光素酶活性。通过STR DNA分型验证细胞系身份。

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蛋白质印迹分析[1]
对于蛋白质印迹分析，细胞裂解物在4-12%SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶上分离。蛋白质被印迹到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。使用HIF-1α特异性单克隆抗体以1∶250的稀释度检测HIF-1α蛋白。使用稀释度为1∶1000的HIF-2α特异性多克隆抗体检测HIF-2α蛋白。抗β-肌动蛋白抗体作为负载对照。根据制造商的说明，通过结合辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG抗体来观察抗体的结合，随后使用化学发光增强。Novex Sharp预染色蛋白标准品用作分子量标记。

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1. 采用Western blot技术检测经Molidustat (BAY 85-3934)处理的HeLa、A549和Hep3B细胞中HIF-1α和HIF-2α的表达；在HeLa细胞HIF-1α诱导的时间进程实验中，加入含5 µM Molidustat (BAY 85-3934)的无血清培养基，在不同时间点检测HIF-1α水平，以β-肌动蛋白作为内参；在A549细胞HIF-1α降解的时间进程实验中，先以20 µM Molidustat (BAY 85-3934)诱导细胞，再将培养基替换为含环己酰亚胺（100 µM）的培养基，在不同时间点检测HIF-1α水平，以β-肌动蛋白作为内参；所有Western blot实验独立重复3次，展示代表性数据 [1]
2. 在经Molidustat (BAY 85-3934)处理（添加或不添加额外Fe²⁺）的A549 HIF-RE2报告基因细胞中进行荧光素酶活性检测；荧光素酶活性以相对荧光素酶单位（RLUs）表示，数据为4次重复实验的均值±标准误 [1]
3. 采用定量PCR技术检测暴露于Molidustat (BAY 85-3934)的HeLa、A549和Hep3B细胞中一组HIF靶基因的相对mRNA表达水平；mRNA水平以基线水平的倍数增加表示，数据为2次重复实验的均值±标准差 [1]

1. 在雄性Wistar大鼠口服5 mg/kg的药物Molidustat (BAY 85-3934)后，测定了血浆中该药物的浓度（每组n = 5只动物）[1]

总体而言，94.5% 的患者在研究期间至少经历了 1 次治疗期间出现的不良事件 (TEAE)：莫利司他组为 92.7%，达贝泊汀组为 96.3%（表 2）。最常见的 TEAE 为鼻咽炎（莫利司他组为 34.1%，达贝泊汀组为 40.2%）、慢性肾脏病 (CKD) 恶化（分别为 18.3% 和 9.8%）以及腹泻（分别为 8.5% 和 12.2%）（表 2）。莫利司他组有 2 例患者 (2.4%) 因 TEAE 死亡，达贝泊汀组无死亡病例；两组分别有 32.9% 和 26.8% 的患者报告了严重 TEAE。在研究药物开始治疗后，接受莫利司他治疗的患者中有3.7%报告了主要不良心血管事件（MACE），而接受达贝泊汀治疗的患者中这一比例为1.2%（见在线补充表3）。此外，莫利司他组有3.7%的患者和达贝泊汀组有1.2%的患者发生了糖尿病视网膜病变；莫利司他组有3.7%的患者和达贝泊汀组有4.9%的患者发生了肿瘤（良性、恶性或未明确类型）（见在线补充表4）。莫利司他组的平均血清eGFR似乎保持稳定（见在线补充图7）。在线补充表 5 中列出了按年龄组（<65 岁和 ≥65 岁）和性别划分的 TEAE 亚组分析。女性患者中两组严重 TEAE 的比例相似，但男性患者中，莫利司他组的严重 TEAE 比例高于达贝泊汀组。[2]

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1. 在 3 期临床研究中，莫利司他组 92.7% 的患者报告了至少 1 例治疗期间出现的不良事件 (TEAE)，而达贝泊汀组为 96.3%；莫利司他组有 2 例患者 (2.4%) 报告了导致死亡的 TEAE，而达贝泊汀组无死亡病例；莫利司他组有 32.9% 的患者报告了严重 TEAE，而达贝泊汀组为 26.8%。对于Molidustat，未观察到新的安全信号[2]

[1]. Mimicking hypoxia to treat anemia: HIF-stabilizer BAY 85-3934 (Molidustat) stimulates erythropoietin production without hypertensive effects. PLoS One. 2014 Nov 13;9(11):e111838.

[2]. Molidustat for Renal Anemia in Nondialysis Patients Previously Treated with Erythropoiesis-Stimulating Agents: A Randomized, Open-Label, Phase 3 Study. Am J Nephrol. 2021;52(10-11):884-893.

莫利司他正在临床试验 NCT03350321（一项莫利司他用于纠正非透析患者肾性贫血的研究）中进行研究。
另见：莫利司他钠（活性成分）。

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1. HIF-PH 的氧感知是 EPO 表达的主要调节机制；在慢性肾脏病 (CKD) 中，EPO 表达受损会导致贫血，而补充 rhEPO 可能导致 EPO 水平过高和高血压；抑制 HIF-PH 以稳定 HIF 是恢复内源性 EPO 生成的新策略 [1]
2. Molidustat (BAY 85-3934) 是一种口服 HIF-PH 抑制剂，可在正常生理范围内刺激内源性 EPO 生成，提高血红蛋白水平，并在 CKD 大鼠模型中使高血压血压正常化，而不会代偿性激活肾素-血管紧张素系统 [1]
3. Molidustat (BAY 85-3934) 可有效治疗肾功能受损大鼠的肾性贫血和炎症性贫血，并具有治疗 CKD 患者贫血的潜力，且不具有与 rhEPO 相关的心血管风险 [1]
4. Molidustat 是一种口服缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶抑制剂，正在研究作为肾性贫血的替代疗法； MIYABI 项目包括五项 3 期研究，旨在评估 Molidustat 的疗效和安全性 [2]
5. 在既往接受过促红细胞生成素 (ESA) 治疗的日本非透析慢性肾脏病 (CKD) 合并肾性贫血患者中，Molidustat 在维持血红蛋白水平在目标范围 (11.0-13.0 g/dL) 内方面不劣于达贝泊汀α，且耐受性良好 [2]

C13H14N8O2

314.3

314.123

C, 49.68; H, 4.49; N, 35.65; O, 10.18

1154028-82-6

1375799-59-9 (Sodium);1154028-82-6;

59603622

White to off-white solid powder

1.7±0.1 g/cm3

589.2±60.0 °C at 760 mmHg

310.2±32.9 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.820

-1.77

106.75

1

8

3

23

481

0

IJMBOKOTALXLKS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H14N8O2/c22-13-10(20-2-1-16-18-20)8-17-21(13)12-7-11(14-9-15-12)19-3-5-23-6-4-19/h1-2,7-9,17H,3-6H2

2-(6-morpholin-4-ylpyrimidin-4-yl)-4-(triazol-1-yl)-1H-pyrazol-3-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 5.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 5.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 5.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 10 mg/mL (31.82 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。