MTT   中文名称: 噻唑兰

Fluorescent Dye; NAD (P) H-oxidoreductases
1. Preparation of MTT working solution:
MTT was dissolved with PBS to obtain 5 mg/mL of MTT.
2. Cell proliferation test (96-well plate).
2.1 Inoculated cells: The prepared single cells were prepared with a suspension containing 10%FBS and cultured a 96-well plate with 1000-10000 cells per well and a volume of 100μL per well.
2.2 Cultured cells: 37℃. 5% CO2, incubated for 24-72 h.
2.3 Add 10 μL MTT to each well, incubate for 4 h, discard the supernatant (centrifuge first if using suspended cells).
2.4 Add 100 μL DMSO and shake for 10 minutes to completely dissolve the crystal.
2.5 Monitor the increase in absorbance at OD=562 nm with an absorbance board reader.
MTT (2-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-3,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) is a monotetrazolium salt that acts as an electron acceptor. It is reduced by various cellular oxidoreductase enzymes, primarily utilizing the reduced pyridine nucleotide cofactor NADH. [1]
It is also reduced by succinate dehydrogenase (mitochondrial Complex II) and can be reduced by superoxide. [1]

1. MTT工作液的制备：
用PBS溶解MTT，得到5mg /mL的MTT。
2. 细胞增殖试验（96孔板）。
2.1 接种细胞：将制备好的单细胞用含10%胎牛血清制备悬浮液，培养于96孔板上，每孔1000-10000个细胞，每孔体积100μL。
2.2 培养细胞：37℃。5% CO2，孵育24-72小时。
2.3 每孔加入10 μL MTT，孵育4 h，丢弃上清（如使用悬浮细胞，需先离心）。
2.4 加入100 μL DMSO，摇匀10分钟使晶体完全溶解。
2.5 吸光度板读数器监测OD=562 nm处吸光度的增加。

---

MTT 还原被广泛用作比色法测定培养物中活细胞的代谢活性和增殖。还原信号与细胞的综合吡啶核苷酸氧化还原状态相关。[1]
亚细胞分馏研究表明，NADH 是 MTT 还原最有利的底物，而琥珀酸在细胞匀浆总还原潜力中占比不到 10%。[1]
在体外，MTT 可在粗制细胞组分存在下被 NADH、NADPH 或琥珀酸还原，其中 NADH 是最有效的电子供体。[1]

---

MTT 还原被广泛用作比色法测定培养物中活细胞的代谢活性和增殖。还原信号与细胞的综合吡啶核苷酸氧化还原状态相关。[1]
亚细胞分馏研究表明，NADH 是 MTT 还原最有利的底物，而琥珀酸在细胞匀浆总还原潜力中占比不到 10%。[1]
在体外，MTT 可在粗制细胞组分存在下被 NADH、NADPH 或琥珀酸还原，其中 NADH 是最有效的电子供体。[1]

四氮唑盐已成为细胞生物学中最广泛使用的工具，用于测量从哺乳动物到微生物起源的细胞的代谢活性。在哺乳动物细胞中，分离研究表明，还原的吡啶核苷酸辅助因子NADH负责大多数MTT还原，这得到了全细胞研究的支持。MTT的减少不仅与线粒体有关，还与细胞质和非线粒体膜有关，包括核内体/溶酶体室和质膜。像MTT和NBT这样的四氮唑盐的净正电荷似乎是通过质膜电位参与细胞摄取的主要因素。然而，第二代四氮唑染料形成水溶性甲酸酯，需要中间电子受体进行还原（XTT， WST-1和某种程度上的MTS），其特征是净负电荷，因此在很大程度上是不渗透的。大量证据表明，它们的还原发生在细胞表面，或通过跨质膜电子传递发生在质膜水平。本文就四氮唑染料作为细胞代谢指标及其在细胞生物学中的应用等方面讨论了这些新发现的意义。[1]

---

当使用 NADH 作为底物时，MTT 还原能力广泛分布于各种亚细胞组分（核、线粒体、微粒体、胞质溶胶）中。[1]
在最适底物浓度下的体外试验表明，NADH 是 MTT 还原最有利的底物，而琥珀酸是最不利的。[1]
琥珀酸依赖的 MTT 还原活性对复合物 II 抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮 (TTFA) 敏感，证实线粒体复合物 II 是其还原位点之一。[1]

---

当使用 NADH 作为底物时，MTT 还原能力广泛分布于各种亚细胞组分（核、线粒体、微粒体、胞质溶胶）中。[1]
在最适底物浓度下的体外试验表明，NADH 是 MTT 还原最有利的底物，而琥珀酸是最不利的。[1]
琥珀酸依赖的 MTT 还原活性对复合物 II 抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮 (TTFA) 敏感，证实线粒体复合物 II 是其还原位点之一。[1]

MTT法简便、准确，结果可重复性好。这种方法最初是由莫斯曼在1983年提出的。关键成分是（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]- 2,5-二苯基溴化四唑）或MTT。活细胞的线粒体脱氢酶分裂四氮唑环，导致形成不溶于水溶液的紫色晶体。晶体在酸化异丙醇中再溶解，所得紫色溶液用分光光度法测定。细胞数量的增加或减少会导致形成的甲醛量的变化，这表明由测试材料引起的细胞毒性程度（IC50）。

---

四氮唑盐/MTT已被用于开发哺乳动物细胞存活和增殖的定量比色法。该试验检测活细胞，但不检测死细胞，产生的信号取决于细胞的活化程度。因此，该方法可用于测量细胞毒性、增殖或活化。结果可以在多孔扫描分光光度计（ELISA阅读器）上读取，并显示出很高的精度。
PMID: 6606682

---

作者将MTT测定法与标准克隆测定法进行了比较，在2 Gy和4 Gy辐射剂量后，小鼠实体瘤细胞的存活比例有很好的一致性。因此，有可能使MTT测定适用于直接从新鲜小鼠肿瘤制备的细胞悬浮液。这可能为包括新鲜临床肿瘤标本在内的肿瘤的临床放射敏感性的测定提供一种方法学。
PMID: 3417490

---

采用四氮唑盐的微细胞毒性试验已被用于测试人类白血病母细胞对各种化疗药物的反应。暴露于不同浓度的药物后，使用四氮唑盐（MTT）测量新鲜白血病母细胞的活力，四氮唑盐被活细胞转化为蓝色甲酸晶体。用微滴板分光光度计定量测定甲醛的生成量。
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/64965

---

细胞增殖/毒性实验： 标准的微孔板实验包括将细胞与 MTT（通常浓度为 500 µg/ml）孵育一段时间（例如 1-4 小时）。代谢活跃的细胞将黄色的 MTT 还原为紫色的、不溶性的甲臜结晶。然后溶解甲臜产物（例如使用 DMSO 或酸化异丙醇），并在分光光度计下测量吸光度，通常在 570 nm 处。吸光度与存活且代谢活跃的细胞数量成正比。[1]
亚细胞定位研究： 使用 HepG2 细胞的共聚焦成像研究表明，大多数 MTT-甲臜沉积物不与线粒体重合，而是出现在细胞质中以及质膜附近。[1]
机制研究： 用葡萄糖转运抑制剂（2-脱氧葡萄糖）和糖酵解抑制剂（碘乙酰胺）处理细胞会强烈抑制 MTT 还原。相反，琥珀酸脱氢酶抑制剂 TTFA 没有影响，而线粒体电子传递抑制剂（氰化物、叠氮化物、鱼藤酮）在短期内可以刺激或对 MTT 还原影响很小。[1]
超氧化物参与： 使用 SOD 和抑制剂证明，HeLa 细胞内 20-30% 的 MTT 还原可归因于超氧化物，而 80% 的细胞外还原对 SOD 敏感。[1]

---

细胞增殖/毒性实验： 标准的微孔板实验包括将细胞与 MTT（通常浓度为 500 µg/ml）孵育一段时间（例如 1-4 小时）。代谢活跃的细胞将黄色的 MTT 还原为紫色的、不溶性的甲臜结晶。然后溶解甲臜产物（例如使用 DMSO 或酸化异丙醇），并在分光光度计下测量吸光度，通常在 570 nm 处。吸光度与存活且代谢活跃的细胞数量成正比。[1]
亚细胞定位研究： 使用 HepG2 细胞的共聚焦成像研究表明，大多数 MTT-甲臜沉积物不与线粒体重合，而是出现在细胞质中以及质膜附近。[1]
机制研究： 用葡萄糖转运抑制剂（2-脱氧葡萄糖）和糖酵解抑制剂（碘乙酰胺）处理细胞会强烈抑制 MTT 还原。相反，琥珀酸脱氢酶抑制剂 TTFA 没有影响，而线粒体电子传递抑制剂（氰化物、叠氮化物、鱼藤酮）在短期内可以刺激或对 MTT 还原影响很小。[1]
超氧化物参与： 使用 SOD 和抑制剂证明，HeLa 细胞内 20-30% 的 MTT 还原可归因于超氧化物，而 80% 的细胞外还原对 SOD 敏感。[1]

毒理学信息
相互作用
KB细胞用MTT处理，最终浓度最高达0.2 mg/ml，单独处理或与甲氨蝶呤（10和32 μM）联合处理。单独使用时，低至0.025 mg/ml的MTT即可将群体倍增时间从26小时（对照组）延长至96小时。浓度达到0.2 mg/ml或更高时，细胞总数下降。0.1 mg/ml的MTT处理8小时后，S期和G2/M期细胞数量减少。然而，在2小时和4小时时未观察到显著影响。0.2 mg/ml MTT的作用更迅速、更显著，导致G0/G1期和S期细胞积累。 MTT 与甲氨蝶呤联用可更显著地扰乱 KB 细胞周期。
……吩嗪甲酯 (PMS) 和 MTT 常联合使用：然而，PMS 并未增强 MTT 的致突变性。Venitt S, Crofton-Sleigh; Mutation Research/Genetic Toxicology 68 (2): 107-116 (1979)

---

解毒剂和急救处理
基本处理：保持呼吸道通畅。必要时进行吸痰。观察呼吸功能不全的迹象，必要时辅助通气。使用无创呼吸面罩以 10 至 15 升/分钟的流量吸氧。监测肺水肿，必要时进行治疗……。监测休克，必要时进行治疗……。预判癫痫发作，必要时进行治疗……。如眼睛受到污染，立即用水冲洗眼睛。转运过程中持续用生理盐水冲洗双眼……。切勿使用催吐剂。若患者误服，应漱口并给予5 ml/kg至200 ml的水稀释，前提是患者能够吞咽、有强烈的咽反射且不流涎……。皮肤烧伤经消毒后，用干燥的无菌敷料覆盖……。/A类和B类中毒/
高级治疗：对于意识不清、严重肺水肿或呼吸骤停的患者，考虑进行口咽或鼻咽气管插管以控制气道。使用球囊面罩进行正压通气可能有效。监测心律，并根据需要治疗心律失常……。建立静脉通路，使用5%葡萄糖溶液（SRP：“保持通畅”，最小流速）。若出现低血容量的迹象，则使用乳酸林格氏液。注意液体负荷过重的迹象。考虑药物治疗肺水肿……。对于伴有低血容量体征的低血压，应谨慎输液。注意液体过量的迹象……。用地西泮（安定）治疗癫痫发作……。使用盐酸丙美卡因辅助眼部冲洗……。/毒物A和B/

---

非人类毒性摘录
/遗传毒性/四唑盐与吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）的组合是广泛使用的实验室试剂。 PMS 和 3 种四唑盐（MTT，[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四唑溴化物]；TTC，[2,3,5-三苯基四唑氯化物]；以及 NBT，[2,2'-二对硝基苯基-5,5'-二苯基-3,3'-(3,3'-二甲氧基-4,4')]）在多种大肠杆菌 WP2 (trp-) 和鼠伤寒沙门氏菌中进行了诱变性测试。在没有 S-9 的情况下，PMS 对大肠杆菌 uvrApKM101 和鼠伤寒沙门氏菌 TA 100 和 TA 98 具有诱变性，在 0.5-10 μg/平板的剂量范围内，剂量反应曲线呈线性，斜率分别为 2.3、1.3 和 0.5 个回复突变体/nmol。添加S-9显著降低了PMS在这些细菌中的致突变性。在没有S-9的情况下，MTT对大肠杆菌uvrApKM101、鼠伤寒沙门氏菌TA 100和TA 98具有致突变性，在0.5至10或50 μg/平板的剂量范围内，其剂量-反应曲线呈线性，斜率分别为3.8、12.1和1.0。添加S-9显著降低了MTT的致突变性。MTT对大肠杆菌WP2的致突变性很弱（0.22个回复突变体/nmol），对WP2 uvrA的致突变性显著增强（1.29个回复突变体/nmol），而对WP2 lexA无致突变性（由于毒性导致的负斜率），这表明MTT会导致可切除的错误修复DNA损伤。PMS和MTT通常联合使用时：然而，PMS并未增强MTT的致突变性。
/替代体外试验/ ... /作者/...使用DNA流式细胞术研究了MTT对细胞生长和细胞周期分布的影响。KB细胞用MTT处理，最终浓度最高达0.2 mg/ml，单独处理或与甲氨蝶呤（10和32 μM）联合处理。单独使用时，低至0.025 mg/ml的MTT即可将群体倍增时间从26小时（对照组）延长至96小时。浓度为0.2 mg/ml或更高时，细胞总数下降。0.1 mg/ml的MTT处理8小时后，S期和G2/M期细胞数量减少。然而，在2小时和4小时时未观察到显著影响。0.2 mg/ml MTT的作用更迅速、更显著，导致G0/G1期和S期细胞积累。MTT与甲氨蝶呤联用时，KB细胞周期受到更显著的扰动。尽管MTT检测通过线粒体脱氢酶来测量细胞活力和增殖，但它也显示出对细胞DNA含量和细胞增殖的明显影响。这些观察结果质疑了此类检测的可靠性，表明它可能测量的是MTT和药物的联合作用，而非药物本身的作用。
/其他毒性信息/ 尽管各种四唑类化合物检测方法被广泛应用，但这些化合物的生物还原机制尚未完全阐明。/作者/研究了四唑盐穿透完整细胞质膜的能力。5-氰基-2,3-二甲苯基四唑氯化物（CTC）和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）四唑盐似乎是通过不同机制还原的物质的例子。/作者/提供的证据表明MTT很容易穿过细胞质膜。完整的质膜能够穿透四唑盐，并在细胞内被还原。MTT 似乎既能被质膜还原酶还原，也能被细胞内还原酶还原；被还原的细胞不会受到损伤，并且至少在 45 分钟内保持代谢活性。相比之下，CTC 相对于活细胞而言仍位于细胞外，因此需要质膜可渗透的电子载体才能有效还原。然而，在电子载体存在的情况下还原 CTC 会损伤质膜。四唑盐的还原位点（细胞内和细胞外）是基于甲臜的沉积而确定的。甲臜晶体使用荧光或背散射光共聚焦激光显微镜进行检测。作者推测，四唑盐穿过完整质膜的能力是一个重要的实验变量，需要加以控制，才能正确解释旨在测量细胞氧自由基生成、线粒体、胞质或外膜还原酶活性等的四唑盐测定结果。PMID:10900139

---

大的不溶性分子细胞内形成的MTT-甲臜晶体可通过胞吐作用排出。这一过程可能导致细胞死亡，可能是由于晶体穿透细胞膜所致。[1]

---

细胞内形成的大而难溶的MTT-甲臜晶体可通过胞吐作用排出。这一过程可能导致细胞死亡，可能是由于晶体穿透细胞膜所致。[1]

[1]. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnol Annu Rev. 2005;11:127-52.

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物是3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑的溴化物盐。它可用作染料和比色试剂。它含有3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑。

---

来源/用途
用于生物测定；
四唑盐用于检测脱氢酶活性或任何其他产生氧化还原当量的酶系统。由于这一特性，它们在学术和临床研究以及许多诊断应用中都非常有用，例如：(1) 艾滋病和癌症研究、细胞和分子生物学：用于检测细胞增殖和细胞活力以及细胞毒性测试；(2) 酶诊断和临床化学：用于测定脱氢酶活性和其他形成氧化还原当量的酶系统；用于测定脱氢酶底物浓度；用于检测葡萄糖、乙醇、甘油和其他在偶联反应中产生氧化还原当量的底物；(3) 免疫组织化学：用于检测碱性磷酸酶；(4) 组织学和病理学：用于组织化学检测脱氢酶；(5) 在种子培育中：用于测试种子活力。
SERVA 四唑盐 - 数据表。截至2005年3月28日，可从以下网址获取：https://www.serva.de/products/latest/tetrazolium.shtml
四唑盐广泛用于检测细胞的氧化还原电位，以进行细胞活力、细胞毒性和增殖试验。……MTT还原法仍然是基于四唑盐的细胞活力检测中最常用的方法。
用于检测活细胞和组织中氧化还原电位的四唑盐：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物。应用：富马酸还原酶和一氧化氮合酶产生的超氧化物；线粒体脱氢酶活性；细胞活力和增殖；神经元细胞死亡；血小板活化；肿瘤细胞黏附和侵袭；多药耐药性；体外毒性试验 /摘自表格/
MTT 法常用于抗 HIV 和抗肿瘤药物筛选，以评估细胞存活率和增殖能力。

---

MTT是细胞生物学中最常用的四唑盐之一，用于测量细胞代谢活性、增殖和细胞毒性。[1]
它是一种带正电荷的亲脂性单四唑盐，可通过质膜电位轻松进入活细胞。[1]
其还原主要发生在细胞内，并与多种利用 NADH 的氧化还原酶相关，而不仅仅是线粒体琥珀酸脱氢酶。还原位点包括细胞质、非线粒体膜（内体/溶酶体、质膜）和线粒体。[1]
生成的甲臜产物不溶于水，因此在进行分光光度计读数之前需要进行溶解步骤，使其成为一种终点检测方法。 [1]
它已被用于药物筛选试验（例如，美国国家癌症研究所）以及预测癌症药物的化疗敏感性和耐药性。[1]
它还用于测量活化中性粒细胞产生的超氧化物，其中很大一部分还原发生在细胞外，并且对超氧化物歧化酶（SOD）敏感。[1]
其局限性包括假设染料还原与细胞数量成正比，而细胞数量会受到生长条件、细胞周期阶段和细胞代谢状态的影响。[1]

---

MTT是细胞生物学中最广泛使用的四唑盐之一，用于测量细胞代谢活性、增殖和细胞毒性。[1]
它是一种带正电荷的亲脂性单四唑盐，可通过质膜电位轻松进入活细胞。 [1]
其还原主要发生在细胞内，并与多种利用NADH的氧化还原酶相关，并非仅限于线粒体琥珀酸脱氢酶。还原位点包括细胞质、非线粒体膜（内体/溶酶体、质膜）和线粒体。[1]
生成的甲臜产物不溶于水，因此在进行分光光度计读数前需要进行溶解步骤，使其成为一种终点检测方法。[1]
它已被用于药物筛选试验（例如，美国国家癌症研究所）以及预测癌症药物的化疗敏感性和耐药性。[1]
它还用于测量活化中性粒细胞产生的超氧化物，其中相当一部分还原发生在细胞外，并且对超氧化物歧化酶（SOD）敏感。[1]
其局限性包括假设染料还原与细胞数量成正比，而细胞数量会受到生长条件、细胞周期阶段和细胞代谢状态的影响。 [1]

C18H16BRN5S

414.32

413.03

C, 52.18; H, 3.89; Br, 19.29; N, 16.90; S, 7.74

298-93-1

13146-93-5 (parent)

64965

Light yellow to yellow solid powder

195 °C (dec.)(lit.)

0.288

75.72

0

5

3

25

410

0

AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M

InChI=1S/C18H16N5S.BrH/c1-13-14(2)24-18(19-13)23-21-17(15-9-5-3-6-10-15)20-22(23)16-11-7-4-8-12-16;/h3-12H,1-2H3;1H/q+1;/p-1

2-(3,5-diphenyltetrazol-2-ium-2-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole;bromide

Thiazolyl Blue; Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide; 298-93-1; MTT; MMT Tetrazolium; Methylthiazoletetrazolium; Thiazolyl Blue Monotetrazolium; 2348-71-2; Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~25 mg/mL (~60.34 mM)
H2O : ~0.88 mg/mL (~2.12 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.02 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.02 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: 6.67 mg/mL (16.10 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。