Myricitrin   中文名称: 杨梅苷

Natural occurring flavonoid; Nitric oxide (NO); PKC

体外活性：杨梅苷，一种从杨梅根皮中分离出来的黄酮类化合物，具有镇痛作用。杨梅苷通过防止佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯 (PMA) 激活蛋白激酶 C (PKC) α 和 PKC epsilon，对啮齿动物疼痛的化学和机械模型产生明显的镇痛作用。另一项研究证明，电压和小电导钙门控 K(+) 通道的开放以及钙内流的减少导致杨梅苷具有镇痛作用。 Myricitrin 还通过抑制 p53 基因表达、激活 caspase-3 和 MAPK 信号通路以及改变促凋亡和抗凋亡基因表达模式，减少 H2O2 诱导的血管内皮细胞凋亡。

---

Myr/Myricitirin处理抑制RA FLSs的lamellipodia形成、迁移和侵袭，但不抑制其凋亡和增殖。Myr还降低了TNF-α诱导的CCL2、IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3和MMP-13的表达。RNA-seq结果表明，AIM2可能是RA FLSs中Myr的靶基因。此外，与健康对照组相比，AIM2在RA患者的滑膜组织和FLS中的表达水平更高。AIM2敲除还抑制了RA FLS的迁移、侵袭、细胞因子和MMP的表达。此外，无论是Myr治疗还是AIM2敲除，都能降低TNF-α刺激诱导的AKT磷酸化 [3]。

在小鼠中，杨梅苷（腹腔注射 10 mg/kg 或 30 mg/kg）可阻断阿扑吗啡引起的定型和攀爬，并增加后肢回缩时间 (HRT)。

---

本研究探讨了Myricitrin在小鼠和大鼠疼痛化学行为模型中的镇痛作用。当对小鼠醋酸诱导的内脏疼痛进行评估时，通过腹腔注射或口服途径给予的Myricitrin产生了与剂量相关的镇痛作用。此外，腹腔注射Myricitirin显著抑制了由辣椒素注射引起的神经源性疼痛。同样，通过腹腔注射给予Myricitrin/杨梅苷可以减少腹腔注射谷氨酸和佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA）产生的伤害。Western blot分析显示，杨梅苷处理完全阻止了PMA对小鼠后爪中蛋白激酶C（PKC）α和PKCε的激活。腹腔注射Myricitrin也能抑制缓激肽诱导的机械性痛觉过敏，而不影响肾上腺素和前列腺素E引起的类似反应（2）。用一氧化氮前体L-精氨酸腹腔注射治疗小鼠后，杨梅苷在乙酸试验中引起的镇痛作用显著减弱。相比之下，杨梅苷的镇痛作用不受纳洛酮（阿片受体拮抗剂）或辣椒素对小鼠新生儿预处理的影响，杨梅苷镇痛作用与肌肉松弛或镇静作用无关。总之，这些结果表明，杨梅苷对啮齿动物的化学和机械疼痛模型具有明显的镇痛作用。其作用机制尚不完全清楚，但似乎涉及与一氧化氮-L-精氨酸和蛋白激酶C途径的相互作用。[1]

---

本研究旨在探究在小鼠伤害性化学模型中，Myricitrin所提供的镇痛机制。当对小鼠醋酸诱导的内脏疼痛进行评估时，通过鞘内（i.t.）或侧脑室（i.c.v.）途径给予的Myricitrin产生了剂量相关的镇痛作用。此外，腹腔注射杨梅苷可显著抑制腹腔注射谷氨酸、P物质、辣椒素、白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的叮咬行为。通过静脉注射百日咳毒素（一种Gi/o蛋白灭活剂）和氯化钙（CaCl（2）），完全预防了Myricitrin/杨梅素在醋酸试验中引起的镇痛作用。此外，用apamin（一种小（或低）电导钙门控K（+）通道阻断剂）和四乙基铵（一种电压门控K（-）通道阻断器）对小鼠进行i.t.预处理，显著逆转了杨梅苷诱导的镇痛作用。charybdotoxin（一种大（或快）电导钙控K（+”通道阻断剂”）和格列本脲（一种ATP门控K（++）通道阻断药”对杨梅苷诱导性镇痛作用没有影响。钙摄取分析表明，Myricitrin/杨梅苷在K（+）诱导的去极化条件下抑制了（45）Ca（2+）内流。然而，只有当使用最高浓度的杨梅苷时，钙的运动才会在非去极化条件下发生改变。总之，我们的研究结果表明，杨梅苷在小鼠伤害性化学模型中产生一致的镇痛作用。这些结果清楚地表明，Gi/o蛋白依赖机制参与了杨梅苷引起的镇痛作用。电压和小电导钙门控K（+）通道的开放以及钙内流的减少导致了杨梅苷的镇痛作用[2]。

RA FLS活性测定[3]
细胞计数试剂盒-8（CCK8）用于评估RA FLS的存活率。简而言之，RA FLS与不同浓度（0-800μM）的Myricitrin一起孵育24小时。用DMEM洗涤细胞。随后，将含有10%细胞计数试剂盒-8（CCK-8）的培养基加入每个孔中，并再孵育4小时。然后，用微孔板读数器在450nm处测量平板的吸光度。

---

FLS迁移和侵袭试验[3]
FLS迁移使用带有过滤器（直径6.5mm，孔径8.0μm）的transwell测定法进行。简而言之，FLS以6×104个细胞/ml的浓度悬浮在腔室上部隔室的无血清DMEM中。将含有10%FBS作为化学引诱剂的培养基加入腔室下部隔室。孵育8小时后，用棉签刮膜顶面上的细胞。将迁移到过滤器下侧的RA FLS在甲醇中固定15分钟，并用0.1%结晶紫染色15分钟。染色的FLS数量是5个随机区域的平均细胞数量。为了测量细胞侵袭，我们在涂有BD Matrigel基底膜基质的腔室中进行了类似的实验。

---

FLS增殖试验[3]
按照制造商的方案，使用Cell Light EdU DNA细胞增殖试剂盒测量RA FLS增殖。细胞用不同浓度的Myricitrin（0-400μM）预处理24小时。加入EdU以测量细胞增殖，并再孵育12小时。使用DAPI对细胞核进行染色。通过显微镜定量EdU阳性细胞。

---

FLS凋亡检测[3]
按照制造商的方案，使用Annexin V-APC/PI凋亡检测试剂盒评估RA FLS凋亡。简而言之，将1×105个FLSs悬浮在0.1 ml 1×结合缓冲液中，用5μL PI和5μL膜联蛋白V染色，并在室温下在黑暗中再孵育15分钟。然后在1小时内通过流式细胞术分析样品。

醋酸诱导的腹部收缩[2]
根据先前描述的方法（Collier等人，1968）诱导腹部收缩，在测试时腹腔注射醋酸（0.6%，0.45 ml/只小鼠）后，导致腹部肌肉收缩和后肢伸展。小鼠用乙醚轻度麻醉后，使用连接聚乙烯管的微量注射器，将5 μl无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或杨梅素（0.1–10 μg/位点）直接注射到侧脑室（icv；坐标：前囟后1 mm，头侧1 mm，垂直3 mm）或L5和L6椎体之间（鞘内注射，it），具体方法如前所述（Laursen和Belknap，1986；Hylden和Wilcox，1980）。在注射醋酸前10分钟，小鼠接受PBS或杨梅素处理。挑战结束后，将小鼠单独放入直径为 20 cm 的玻璃圆筒中，并在 20 分钟内累计计数腹部收缩次数。

---

小鼠致痛剂诱导的明显伤害感受 [2]
在另一组实验中，我们研究了杨梅素对谷氨酸、P 物质、辣椒素和促炎细胞因子诱导的伤害感受的影响。在注射 5 μl 药物前 30 分钟，动物腹腔注射杨梅素（30 mg/kg）。注射采用 Hylden 和 Wilcox (1980) 描述的方法，对完全清醒的小鼠进行注射。简而言之，将动物手动固定，并将连接 50 μl 微量注射器的 30 号针头穿过皮肤，插入 L5-L6 脊髓节段的椎骨之间，进入硬膜下腔。注射时间为5秒。采用谷氨酸（30 μg/位点）（Scheidt等人，2002）、P物质（135 ng/位点）（Sakurada等人，1990）、辣椒素（30 ng/位点）（Sakurada等人，1996）、IL-1β（1 pg/位点）和TNF-α（0.1 pg/位点）（Choi等人，2003）等药物诱发伤害性反应，并进行少量修改。另设一组小鼠经皮注射载体（PBS）。局部注射以下激动剂后，评估动物的啃咬时间：谷氨酸（3分钟）；P物质和辣椒素（6分钟）；IL-1β、TNF-α和PBS（15分钟）。咬伤被定义为指向侧腹或后肢的单次头部运动，导致动物的吻部与目标器官接触。

---

杨梅素作用机制分析[2]
在本组实验中，小鼠腹腔注射杨梅素。这使得化合物能够广泛分布，从而可以评估杨梅素在外周和中枢水平的作用。

---

Gi/o蛋白的参与[2]
为了确定Gi/o蛋白是否参与杨梅素的镇痛作用，小鼠预先注射百日咳毒素（0.5 μg/位点），百日咳毒素是Gi/o蛋白的灭活剂。对照组预先鞘内注射PBS（5 μl/位点）。实验按照Sánchez-Blázquez和Garzón（1991）描述的方法进行。预处理7天后，小鼠分别接受赋形剂（10 ml/kg）、杨梅素（1 mg/kg，腹腔注射）或吗啡（2.5 mg/kg，皮下注射）（Santos等，1999）。30分钟后，给动物注射0.6%的醋酸。记录注射醋酸后20分钟内的腹部扭体次数。

---

杨梅素镇痛作用中K+通道的作用接下来，我们研究了杨梅素镇痛作用中K+通道的作用。小鼠预先接受 K+ 通道阻滞剂处理：阿帕明（50 ng/位点，注射；小电导（或低电导）钙门控 K+ 通道阻滞剂）；毒蝎毒素（250 pg/位点，注射；大电导（或快速电导）钙门控 K+ 通道阻滞剂）；四乙铵（1 μg/位点，注射；电压门控 K+ 通道阻滞剂）；或格列本脲（80 μg/位点，注射；ATP 门控 K+ 通道阻滞剂），15 分钟后，小鼠接受杨梅素（1 mg/kg，腹腔注射）、吗啡（2.5 mg/kg，皮下注射）或赋形剂（10 ml/kg，腹腔注射）（Strong，1990；Aronson，1992；Welch 和 Dunlow，1993；Santos 等，1999）。通过腹腔注射醋酸（0.6%，0.45 ml）30分钟后，观察小鼠20分钟内的腹部收缩次数来评估伤害性反应。醋酸注射指尖柽柳苷、吗啡或溶剂对照。

---

钙通道参与指尖柽柳苷的镇痛作用[2]
小鼠按照Liang等人（2003）描述的方法，经脑室内注射5 μl CaCl2（200 nmol/位点）或PBS（溶剂对照）。脑室内注射按上述方法进行（2.3节）。10分钟后，分别给予小鼠指尖柽柳苷（1 mg/kg，腹腔注射）、吗啡（2.5 mg/kg，皮下注射）或生理盐水（10 ml/kg）。给药30分钟后，动物腹腔注射0.45毫升0.6%的乙酸，并记录20分钟内的腹部收缩次数。

---

杨梅素对⁴⁵Ca²⁺内流的调节[2]
为了研究杨梅素对钙离子运动的影响，我们评估了⁴⁵Ca²⁺向大鼠皮层切片的内流。⁴⁵Ca²⁺摄取实验基本按照Eason和Aronstam（1984）描述的方法进行，并做了一些修改。本研究使用了两种盐溶液：（1）Krebs 缓冲液，含有 127 mM NaCl、1.2 mM Na2HPO4、0.44 mM KH2PO4、0.95 mM MgCl2、0.70 mM CaCl2、10 mM 葡萄糖和 0.50 mM Hepes，pH 7.4，其中 KCl 浓度为 5.36 mM 用于基线分析，或 K+ 刺激测定时 KCl 浓度为 80 mM；（2）镧溶液，含有 127 mM NaCl、0.95 mM MgCl2、10 mM LaNO3、10 mM 葡萄糖和 0.60 mM Hepes，pH 7.4，其中 KCl 浓度为 5.0 mM 用于基线分析，或 K+ 刺激测定时 KCl 浓度为 80 mM。为了测定⁴⁵Ca²⁺的摄取，将大鼠断头处死，解剖并分离大脑皮层，将顶叶皮层切成400 μm厚的切片，并用Krebs缓冲液（溶液1）洗涤。将切片（0.8–1.3 mg蛋白）置于96孔聚碳酸酯板中，在32 °C下预孵育22分钟，分别在无（对照组）或有杨梅素（100和200 μM）的条件下进行。然后将切片转移至含有溶液1和21 pmol⁴⁵Ca²⁺的培养基中。在32 °C下监测⁴⁵Ca²⁺的摄取15秒。用冰冷的镧溶液（溶液2）洗涤5次，每次2分钟，以终止反应。洗涤后立即取等分试样，用0.25 ml含有0.5 M NaOH和0.2% SDS的溶液裂解，并在60 °C下保持5分钟。取等分试样，通过液体闪烁计数法测定细胞内钙含量。使用含有非特异性电压依赖性钙通道阻滞剂镧的溶液2进行相同实验，测定非特异性钙摄取（占总摄取的20-30%）。特异性摄取定义为总摄取与非特异性摄取之差。

---

CIA模型和治疗[3]
CIA小鼠模型的建立方法如前所述（Wang C.等，2020）。简而言之，将100 μg牛II型胶原蛋白和弗氏完全佐剂以1:1（体积比）混合的乳液（100 μL）皮内注射到7-8周龄雄性DBA/1J小鼠尾根部。首次免疫后第21天，腹腔注射200 μg牛II型胶原蛋白。在治疗研究中，将小鼠随机分为两组。杨梅素组（100 mg/kg，每日一次，n = 5）或DMSO组（溶剂对照，n = 5）连续14天灌胃给予杨梅素。根据先前描述的评分系统（0 至 4 分），每隔一天监测一次关节炎进展情况（0 分：正常；1 分：爪子或单个趾肿胀或发红；2 分：2 个关节受累；3 分：3 个关节受累；4 分：整个爪子和趾严重关节炎）（Thornton 等，2017）。关节炎评分由独立研究人员以盲法计算，并定义为所有四个爪子评分的综合值。所有小鼠均在特定病原体清除（SPF）条件下饲养。

溶于吐温80，然后用生理盐水溶解；10、30 mg/kg；腹腔注射

雄性成年瑞士白化小鼠

[1]. J Pharmacol Exp Ther.2006 Feb;316(2):789-96.
[2]. Eur J Pharmacol.2007 Jul 19;567(3):198-205.
[3]. Front Pharmacol. 2022 Aug 31:13:905376.

杨梅素是一种糖基氧基黄酮，由杨梅素通过糖苷键与3位α-L-鼠李糖残基连接而成。它从杨梅（Myrica cerifera）中分离得到，具有抗过敏活性。杨梅素可作为抗过敏剂、EC 1.14.13.39（一氧化氮合酶）抑制剂、EC 2.7.11.13（蛋白激酶C）抑制剂以及植物代谢产物发挥作用。它是一种五羟基黄酮、糖基氧基黄酮、α-L-鼠李糖苷和单糖衍生物。其功能与杨梅素类似。它是杨梅素(1-)的共轭酸。
杨梅素已在锥蝽、叶下珠等有相关数据的生物体中被报道。

---

总之，本研究结果与既往数据一致，表明杨梅素在外周或中枢给药时均能产生镇痛作用。此外，这些结果表明杨梅素的镇痛作用与谷氨酸、P物质、辣椒素和促炎细胞因子激活的信号通路密切相关。其镇痛机制依赖于Gi/o蛋白的激活、特定K+通道（电压门控和小电导Ca2+门控通道）的开放以及钙离子内流的抑制。[2]

---

目的：探讨杨梅素(Myr)在调节类风湿关节炎(RA)中成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)介导的滑膜炎和关节破坏中的作用及其潜在机制。方法：从类风湿关节炎（RA）患者的滑膜组织中分离出成纤维样滑膜细胞（FLS）。采用定量RT-qPCR检测基因表达。采用免疫组织化学或Western blot检测蛋白表达。采用Annexin-PI染色法检测细胞凋亡。采用EdU掺入法评估RA FLS的增殖能力。采用Transwell小室实验表征RA FLS的细胞迁移和侵袭能力。通过RNA测序分析鉴定Myr的潜在靶点。在胶原诱导性关节炎（CIA）模型中评估Myr的体内作用。结果：Myr处理抑制RA FLS的伪足形成、迁移和侵袭，但不抑制其凋亡和增殖。Myr还降低了TNF-α诱导的CCL2、IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3和MMP-13的表达。 RNA-seq结果表明，AIM2可能是类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）中Myr的靶基因。此外，与健康对照组相比，RA患者的滑膜组织和FLS中AIM2的表达水平更高。AIM2敲低抑制了RA FLS的迁移、侵袭以及细胞因子和MMP的表达。此外，Myr治疗或AIM2敲低均降低了TNF-α刺激诱导的AKT磷酸化水平。重要的是，Myr给药可缓解胶原诱导关节炎（CIA）小鼠的关节炎症状并抑制其滑膜中AIM2的表达。结论：我们的结果表明，Myr在RA FLS中发挥抗炎和抗侵袭作用，并为Myr治疗RA的潜在疗效提供了证据。[3]

C21H20O12

464.38

464.095

C, 54.32; H, 4.34; O, 41.34

17912-87-7

5281673

White to yellow solid powder

1.9±0.1 g/cm3

896.6±65.0 °C at 760 mmHg

197 °C

315.7±27.8 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.805

1.98

210.51

8

12

3

33

760

5

C[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]([C@@H](O1)OC2=C(OC3=CC(=CC(=C3C2=O)O)O)C4=CC(=C(C(=C4)O)O)O)O)O)O

DCYOADKBABEMIQ-OWMUPTOHSA-N

InChI=1S/C21H20O12/c1-6-14(26)17(29)18(30)21(31-6)33-20-16(28)13-9(23)4-8(22)5-12(13)32-19(20)7-2-10(24)15(27)11(25)3-7/h2-6,14,17-18,21-27,29-30H,1H3/t6-,14-,17+,18+,21-/m0/s1

3-[(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)oxy]-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。