Nexturastat A (AG-CR1-3901)   中文名称: 内特斯他A

HDAC6 ( IC50 = 5.02 nM ); HDAC8 ( IC50 = 0.954 μM ); HDAC1 ( IC50 = 3.02 μM ); HDAC7 ( IC50 = 4.46 μM ); HDAC11 ( IC50 = 5.14 μM ); HDAC3 ( IC50 = 6.68 μM ); HDAC9 ( IC50 = 6.72 μM ); HDAC2 ( IC50 = 6.92 μM ); HDAC10 ( IC50 = 7.57 μM ); HDAC4 ( IC50 = 9.39 μM ); HDAC5 ( IC50 = 11.7 μM )
Nexturastat A (AG-CR1-3901) is a highly selective inhibitor of histone deacetylase 6 (HDAC6), with no significant inhibitory activity against class I (HDAC1, HDAC2, HDAC3) or other class II HDACs. The IC50 values (fluorogenic enzyme assay) are: HDAC6 = 12 nM; HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC8, HDAC10, HDAC11 = >10 μM [1]
Nexturastat A (AG-CR1-3901) selectively inhibits HDAC6, with an IC50 of 10.5 nM (HTRF assay). It shows negligible inhibition of class I HDACs (HDAC1: IC50 >20 μM, HDAC2: IC50 >20 μM, HDAC3: IC50 >20 μM) and class IIb HDAC6/10 (HDAC10: IC50 >20 μM) [2]

体外活性：在 B16 鼠黑色素瘤细胞中，Nexturastat A 导致乙酰 α-微管蛋白水平呈剂量依赖性增加，但组蛋白 H3 乙酰化不会同时升高。此外，Nexturastat A 可有效抑制 B16 黑色素瘤细胞的生长，GI50 为 14.3 μM。激酶测定：HDAC抑制测定由Reaction Biology Corp.使用来自Sf9细胞中杆状病毒表达系统的分离的人重组全长HDAC1和-6进行。使用衍生自 p53 残基 379-382 的乙酰化荧光肽 RHKKAc 作为底物。反应缓冲液由 50 mM Tris-HCl pH 8.0、127 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1 mg/mL BSA 和终浓度 1% DMSO 组成。将化合物在 DMSO 中递送，并递送至酶混合物中，预孵育 5-10 分钟，然后添加底物并在 30°C 下孵育 2 小时。添加曲古抑菌素 A 和显色剂分别淬灭反应并产生荧光。从 30 μM 化合物开始，通过三倍连续稀释生成剂量反应曲线，以生成 10 剂量图。然后从结果图中生成 IC50 值，所表示的值是重复试验的平均值±标准差。细胞测定：将B16鼠黑色素瘤细胞以5000个/孔铺板于96孔平底板中。第二天，将培养基更换为含有各种浓度的 HDACi 或稀释在完全培养基中的匹配 DMSO 载体浓度的培养基，一式三份。细胞在 37°C 和 5% CO2 下孵育 48 小时。按照制造商的说明，使用标准 MTS 测定法对活的、代谢活跃的细胞的密度进行量化。简而言之，每孔加入20μL试剂并在37℃下孵育3小时。 490nM 处的吸光度通过分光光度法测量，并在 690 nM 处扣除背景。然后将所有值标准化并表示为培养基对照的百分比 (100%)。

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1. 黑色素瘤细胞抗增殖活性：Nexturastat A (AG-CR1-3901) 抑制人黑色素瘤细胞系增殖，72小时MTS实验IC50值为：A375（0.4 μM）、SK-MEL-28（0.6 μM）、WM115（0.5 μM）；对正常人黑素细胞（NHM）毒性低，2 μM时细胞存活率>90%[1]
2. 诱导α-微管蛋白乙酰化：Western blot显示，Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.2–1 μM，24小时）以剂量依赖性方式升高A375细胞中乙酰化α-微管蛋白（Ac-α-tubulin，HDAC6特异性底物）水平：0.5 μM处理时较对照组升高3.8倍；对乙酰化组蛋白H3（Ac-H3，I类HDAC底物）无显著影响[1]
3. 抑制黑色素瘤细胞迁移：Transwell迁移实验显示，Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.5 μM，24小时）使A375细胞迁移率较溶剂对照组降低62%；划痕愈合实验显示1 μM处理48小时后伤口闭合率降低58%[1]
1. 多发性骨髓瘤（MM）细胞抗增殖活性：Nexturastat A (AG-CR1-3901) 对MM细胞系具有强效抗增殖作用，包括硼替佐米敏感株MM.1S（IC50=0.3 μM）和硼替佐米耐药株MM.1R（IC50=0.5 μM）（72小时CCK-8实验）；对患者来源的原代MM细胞也有抑制作用，平均IC50=0.6 μM[2]
2. 诱导MM细胞凋亡：Annexin V/PI染色（流式细胞术）显示，Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.5 μM，48小时）诱导38%的MM.1S细胞和32%的MM.1R细胞凋亡（对照组仅5%–7%）；Western blot证实处理后细胞中凋亡标志物caspase-3和PARP的切割水平升高[2]
3. 克服药物耐药：在MM.1R（硼替佐米耐药）细胞中，Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.5 μM）使药物外排泵P-糖蛋白（P-gp）表达下调45%（Western blot），并恢复对硼替佐米的敏感性：与0.2 μM Nexturastat A (AG-CR1-3901) 联合使用时，硼替佐米的IC50从80 nM降至25 nM[2]
4. 抑制NF-κB信号：实时荧光定量PCR显示，Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.5 μM，24小时）使MM.1R细胞中NF-κB靶基因（IL-6、TNF-α）的mRNA水平分别降低55%和48%[2]

不适用

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1. 黑色素瘤异种移植模型抗肿瘤疗效：荷A375黑色素瘤异种移植瘤的雌性裸鼠口服Nexturastat A (AG-CR1-3901)（25 mg/kg、50 mg/kg），每日1次，持续21天，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为45%（25 mg/kg）和70%（50 mg/kg）；肿瘤裂解液显示Ac-α-tubulin水平升高4.2倍（50 mg/kg组），增殖标志物Ki-67表达降低35%[1]
2. 延长生存期：50 mg/kg组小鼠中位生存期为52天，显著长于溶剂对照组的30天[1]
1. MM异种移植模型抗肿瘤疗效：荷皮下MM.1R（硼替佐米耐药）异种移植瘤的雄性裸鼠腹腔注射Nexturastat A (AG-CR1-3901)（30 mg/kg），每日1次，持续28天，TGI=65%，处理组小鼠中位生存期从对照组的28天延长至46天；肿瘤免疫组化（IHC）显示凋亡标志物切割型caspase-3升高，P-gp表达降低[2]
2. 联合治疗疗效：荷MM.1R异种移植瘤的小鼠接受Nexturastat A (AG-CR1-3901)（15 mg/kg，腹腔注射）与硼替佐米（0.5 mg/kg，腹腔注射）联合治疗，每3天1次，持续4周，联合组TGI=82%，显著高于单药组（Nexturastat A：58%；硼替佐米：32%）[2]

Reaction Biology Corp. 分离了人重组全长 HDAC1 和 -6，并用于 Sf9 细胞中的杆状病毒表达系统，以进行 HDAC 抑制测定。使用 RHKKAc 形式的底物，这是一种源自 p53 残基 379-382 的乙酰化荧光肽。反应缓冲液由 127 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl₂、1 mg/mL BSA、50 mM Tris-HCl pH 8.0 和终浓度 1% DMSO 组成。经过 5 至 10 分钟的预孵育期和 30°C 2 小时的孵育期后，将化合物添加到 DMSO 中的酶混合物中。为了淬灭反应并产生荧光，分别添加曲古抑菌素 A 和显色剂。为了创建 10 剂量图，使用从 30 μM 化合物开始的三倍连续稀释来创建剂量反应曲线。然后使用所得图来计算 IC50 值，该值表示为重复试验的平均值±标准差。

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1. HDAC活性检测（荧光法）[1]： - 反应体系制备：将重组人HDAC亚型（HDAC1–11，各0.5 nM）与系列浓度的Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.01 nM–20 μM）及荧光底物（Boc-Lys(Ac)-AMC，50 μM）加入反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH8.0、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA）中。 - 孵育与终止：混合物37°C孵育60分钟，加入1 M三氯乙酸（终浓度0.1 M）终止反应，再用1 M NaOH中和至pH7.0。 - 检测与分析：检测释放的AMC荧光强度（激发360 nm/发射460 nm），抑制率计算公式为[(对照组荧光值–样品组荧光值)/对照组荧光值]×100%，采用四参数逻辑回归法计算IC50值。[1]
1. HDAC活性检测（HTRF法）[2]： - 反应设置：将重组HDAC6（0.2 nM）或I类HDAC（HDAC1/2/3，各0.5 nM）与Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.01 nM–20 μM）及生物素标记的组蛋白底物加入HTRF检测缓冲液（25 mM Tris-HCl pH7.5、150 mM NaCl、0.1% BSA、1 mM DTT）中。 - 孵育与检测：37°C孵育120分钟后，加入Eu³⁺标记的抗乙酰化组蛋白抗体和链霉亲和素-XL665，室温孵育60分钟，检测HTRF信号（供体620 nm/受体665 nm），通过665 nm/620 nm比值计算抑制率并确定IC50值。[2]

B16 鼠黑色素瘤细胞以每孔 5000 个细胞铺板于 96 孔平底板中。第二天将培养基更换为含有不同 HDACi 浓度或稀释在全培养基中的匹配 DMSO 载体浓度的培养基，所有操作一式三份。将细胞在 37°C、5% CO2 下孵育 48 小时。根据制造商的说明，使用标准 MTS 测定法测量代谢活跃的活细胞的密度。总之，每个孔接受20μL试剂，然后在37°C下孵育三个小时。减去 690 nM 的背景后，进行 490 nM 吸光度的分光光度测量。标准化后，每个值均以培养基对照 (100%) 的百分比形式给出。

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1. 黑色素瘤细胞增殖实验[1]： - 细胞培养：A375/SK-MEL-28/WM115细胞及NHM培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，37°C、5% CO₂条件下培养；细胞以5×10³个/孔接种于96孔板，过夜孵育。 - 药物处理：加入Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.05–5 μM，DMSO溶解，终DMSO<0.1%），孵育72小时。 - 检测：每孔加入20 μL MTS试剂，检测490 nm吸光度，计算细胞存活率及IC50值（三次独立实验）。[1]
2. Ac-α-tubulin Western blot实验[1]： - A375细胞经Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.2–1 μM）处理24小时后，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解；取20 μg总蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜。 - 膜用5%脱脂牛奶（TBST）封闭1小时，与一抗（Ac-α-tubulin、α-tubulin、Ac-H3、H3）4°C孵育过夜，再与HRP标记二抗孵育1小时；ECL显影，定量条带强度。[1]
1. MM细胞活力实验[2]： - 细胞培养：MM.1S/MM.1R细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中；患者骨髓来源的原代MM细胞培养于含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。 - 药物处理：细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板，加入Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.05–5 μM），孵育72小时。 - 检测：每孔加入10 μL CCK-8试剂，检测450 nm吸光度，计算IC50值。[2]
2. 凋亡实验（Annexin V/PI染色）[2]： - MM细胞经Nexturastat A (AG-CR1-3901)（0.5 μM）处理48小时后，收集细胞并用PBS洗涤，加入Annexin V-FITC和PI室温避光染色15分钟。 - 流式细胞术分析凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁻：早期凋亡；Annexin V⁺/PI⁺：晚期凋亡）。[2]

1. 黑色素瘤异种移植模型[1]：- 模型建立：将5×10⁶个A375细胞皮下注射到6-8周龄雌性裸鼠（右侧腹部）。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠分组（每组n=8）：载体组（0.5%甲基纤维素+0.1% Tween 80）或Nexturastat A（AG-CR1-3901）组（25 mg/kg，50 mg/kg）。- 给药：将药物溶于载体中，每日一次口服给药，持续21天。- 样本采集：每3天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）和体重。处死小鼠，收集肿瘤组织进行Western blot（Ac-α-tubulin，Ki-67）和免疫组化分析。 [1]
1. 多发性骨髓瘤异种移植模型[2]： - 模型建立：将2×10⁷个MM.1R细胞皮下注射到6-8周龄雄性裸鼠（右侧腹部）。当肿瘤体积达到约120 mm³时，将小鼠分组（每组n=7）：载体组（PBS + 5% DMSO）、Nexturastat A (AG-CR1-3901)组（30 mg/kg，腹腔注射）、硼替佐米组（0.5 mg/kg，腹腔注射）或联合用药组（15 mg/kg Nexturastat A + 0.5 mg/kg 硼替佐米）。 - 给药方案：单药治疗组每日给药一次，持续28天；联合用药组每3天给药一次，持续4周。 - 样本采集：每4天测量一次肿瘤体积和体重。记录生存情况。切除肿瘤组织进行免疫组化（切割型 caspase-3、P-gp）和蛋白质印迹分析。[2]

1. 小鼠药代动力学参数[1]：单次口服50 mg/kg Nexturastat A (AG-CR1-3901)后，血浆峰浓度(Cmax)为2.9 μg/mL，达峰时间(Tmax)为2小时，消除半衰期(t₁/₂)为6.5小时，口服生物利用度为38%（与静脉注射10 mg/kg相比）。2. 血浆蛋白结合率[1]：在小鼠血浆中，Nexturastat A (AG-CR1-3901)的蛋白结合率为94%（平衡透析法，药物浓度：1 μg/mL）。[1]

1. 体外正常细胞安全性[1]：Nexturastat A (AG-CR1-3901)（2 μM，72 小时）对 NHM（活力 >90%）和正常人真皮成纤维细胞 (NHDF，活力 >85%) 没有明显的毒性。 [1]
2. 体内安全性 [1]：小鼠连续 21 天接受 50 mg/kg Nexturastat A (AG-CR1-3901) 治疗后，体重未出现明显下降（最终体重：27.2 ± 1.3 g，对照组为 26.8 ± 1.5 g），且血清 ALT（28 ± 4 U/L vs. 25 ± 3 U/L）、AST（36 ± 5 U/L vs. 34 ± 4 U/L）和肌酐（0.82 ± 0.05 mg/dL vs. 0.80 ± 0.04 mg/dL）水平均未见异常。肝脏和肾脏的组织病理学检查未见病变。 [1]
1. 体外正常细胞安全性[2]：Nexturastat A (AG-CR1-3901)（1 μM，72 小时）对正常人骨髓基质细胞 (BMSC) 的活力无显著影响，活力 >90%。[2]
2. 体内安全性[2]：小鼠连续 28 天接受 30 mg/kg Nexturastat A (AG-CR1-3901) 治疗，体重和器官重量（肝脏、肾脏、脾脏）均无显著变化。血清 ALT/AST 和肌酐水平均在正常范围内。[2]

[1]. Selective histone deacetylase 6 inhibitors bearing substituted urea linkers inhibit melanoma cell growth. J Med Chem. 2012 Nov 26;55(22):9891-9.

[2]. The selective HDAC6 inhibitor Nexturastat A induces apoptosis, overcomes drug resistance and inhibits tumor growth in multiple myeloma. Biosci Rep. 2019 Mar 22;39(3):BSR20181916.

1. 作用机制[1]：Nexturastat A (AG-CR1-3901) 通过选择性抑制 HDAC6 发挥抗黑色素瘤作用，其机制包括增加乙酰化 α-微管蛋白水平、稳定微管、抑制细胞迁移和抑制肿瘤增殖。其取代的脲连接基有助于提高对 HDAC6 的选择性。[1] 2. 研究背景[1]：HDAC6 过表达与黑色素瘤的进展和转移密切相关。Nexturastat A (AG-CR1-3901) 被开发为一种选择性 HDAC6 抑制剂，旨在靶向治疗黑色素瘤，并最大限度地减少脱靶效应（因为它不抑制 I 类 HDAC）。 [1]
1. 克服耐药性的机制[2]：Nexturastat A (AG-CR1-3901) 通过下调 P-gp（减少药物外排）和抑制 NF-κB 信号通路（抑制炎症驱动的耐药性）逆转多发性骨髓瘤 (MM) 中的硼替佐米耐药性。[2]
2. 临床意义[2]：截至 2019 年发表时，Nexturastat A (AG-CR1-3901) 正处于复发/难治性多发性骨髓瘤 (RRMM) 的临床前开发阶段，尤其针对硼替佐米耐药病例。

C19H23N3O3

341.4

341.173

C, 66.84; H, 6.79; N, 12.31; O, 14.06

1403783-31-2

71462653

White solid powder

1.228±0.06 g/cm3

1.622

2.37

85.16

3

3

7

25

416

0

O=C(N([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])N(C([H])([H])C1C([H])=C([H])C(C(N([H])O[H])=O)=C([H])C=1[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H]

JZWXMCPARMXZQV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H23N3O3/c1-2-3-13-22(19(24)20-17-7-5-4-6-8-17)14-15-9-11-16(12-10-15)18(23)21-25/h4-12,25H,2-3,13-14H2,1H3,(H,20,24)(H,21,23)

4-[[butyl(phenylcarbamoyl)amino]methyl]-N-hydroxybenzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。