Nimbolide   中文名称: 印苦楝内酯

NF-κB; CDK4; CDK6

Nimbolide 是一种从楝树的叶子和花中提取的三萜，在传统医学实践中被广泛用于治疗各种人类疾病。楝树类柠檬酸具有多种药理作用，其中抗肿瘤活性最有前景。几十年来进行的临床前和机制研究表明，nimbolide抑制肿瘤发生和转移，没有任何毒性和不良副作用。Nimbolide通过选择性调节与炎症、生存、生长、侵袭、血管生成和转移相关的多种细胞信号通路来显示抗癌活性。本综述重点介绍了目前对nimbolide抗癌活性的分子靶点的了解，这些靶点涉及(i)抑制致癌活性并诱导抗氧化和致癌解毒酶，(ii)诱导生长停滞和细胞凋亡;(iii)抑制与癌症进展相关的促炎信号通路[1]。

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Nimbolide或含有Nimbolide作为主要细胞毒剂的A. indica叶片(Azt)的乙醇可溶性部分在体外对多形性胶质母细胞瘤具有高度的细胞毒性。Azt引起细胞周期阻滞，在表达EGFRvIII的多形性胶质母细胞瘤细胞的G1-S阶段最为显著，EGFRvIII是约20%至25%的多形性胶质母细胞瘤中存在的致癌基因。Azt/nimbolide直接抑制CDK4/CDK6激酶活性，导致视网膜母细胞瘤蛋白的低磷酸化，细胞周期阻滞在G1-S，细胞死亡。与视网膜母细胞瘤低磷酸化无关，Azt还通过下调Bcl2和阻断生长因子诱导的Akt、细胞外信号调节激酶1/2和STAT3的磷酸化，在体外显著降低胶质母细胞瘤多形性细胞的增殖和存活优势。这些作用是特异性的，因为Azt不影响mTOR或其他细胞周期调节因子。[2]

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本研究旨在探讨nimbolide对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞系中IGF信号传导和细胞周期阻滞的影响。western blot检测IGF信号分子蛋白表达及细胞周期蛋白水平。为了研究nimbolide与IGF-1信号通路的相互作用，我们使用IGF-1和磷酸肌苷3激酶(PI3K)抑制剂LY294002治疗MCF-7和MDA-MB-231细胞。进一步，流式细胞术分析细胞周期阻滞。在nimbolide处理的乳腺癌细胞中，IGF信号分子的蛋白表达显著降低。PI3K抑制剂和igf - 1联合nimbolide显著抑制磷酸化Akt。在nimbolide处理的乳腺癌细胞系中，细胞周期阻滞在G0/G1期，凋亡细胞积累。Nimbolide还增加了p21蛋白的表达，降低了细胞周期蛋白的表达。Nimbolide通过调节IGF信号分子来减少乳腺癌细胞的增殖，这可能对乳腺癌的治疗非常有用。[3]

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Nimbolide抑制结直肠癌细胞增殖，诱导凋亡，抑制NF-κB活化和NF-κB调控的致瘤蛋白。nimbolide对NF-κB活化的抑制是通过顺序抑制ikb激酶(IKK)活化、ikb α磷酸化和p65核易位引起的。此外，nimbolide对IKK活性的影响是直接的。[5]

Nimbolide体内抑制GBM肿瘤生长[2]
到目前为止，我们已经证明nimbolide显著降低GBM细胞的体外活力。为了验证nimbolide是否能在体内抑制肿瘤生长，我们采用了三种不同的方法。所有体内方法均符合机构和IACUC指南。在第一种方法中，我们使用U87EGFRvIII细胞构建侧翼异种移植物，并将Azt或EtoH(对照)直接注射到肿瘤床中。在第二种方法中，我们在制造U87EGFRvIII细胞的侧翼异种移植物后，通过尾静脉注射nimbolide或DMSO(对照)。在第三种方法中，将U87EGFRvIII原位植入Nu/Nu小鼠皮层，并静脉注射nimbolide或DMSO(对照)。第1模型任肿瘤生长7 d后，分别于左、右侧肿瘤床注射95% EtOH或Azt (0.34 μg/g体重)62.5 μl，每隔一天注射一次，连续8 d。除肿瘤负荷外，注射EtOH或Azt的小鼠健康，没有表现出嗜睡、运动或行为异常。EtOH暴露导致皮肤变红(图6A中靠近肿瘤的红色区域)。用乙醇从叶子中提取的Azt呈深绿色，注射到肿瘤中，肿瘤呈深绿色(图6A)，但从肿瘤切片的组织学分析来看，Azt没有引起肿瘤坏死(图6E, G)，但Azt显著(p = 0.00013)降低了GBM肿瘤的生长(图6 a - c)。三次注射后，注射azt的肿瘤体积比对照肿瘤小50%，而研究结束时，azt治疗的肿瘤体积小于对照肿瘤的10%(图6C) [2]。

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研究人员接下来检查了全身给药nimbolide是否有足够的生物利用度来影响侧壁GBM异种移植物的生长。事实上，与DMSO治疗(对照组)相比，nimbolide (10μg/Kg体wt)对GBM肿瘤的生长具有显著(p < 0.0001)的抑制作用(图7 a, B)。当研究结束(第11天)时，我们观察到nimbolide治疗动物的肿瘤体积缩小了三到四倍。许多临床前药物在试验中失败，因为它们不能通过血脑屏障，其数量不足以对颅内肿瘤产生作用。因此，我们研究了nimbolide是否对原位GBM异种移植物有任何影响。我们使用了三组动物-第一组，我们注射了慢病毒荧光素酶标记的U87EGFRvIII细胞，每隔一天用DMSO或nimbolide (i.v)处理小鼠(n = 4/亚组)，并在第14天测量肿瘤生长(图7C)。在第二组中，我们注射标记为DsRed的U87EGFRvIII细胞，每隔一天用DMSO或nimbolide (IV)处理小鼠(n = 3/亚组)，在第14天对小鼠实施安乐死，并通过在2mm厚的冠状脑切片上测量肿瘤面积来监测肿瘤生长(图7D, E)。在第三组中，我们注射未标记的U87EGFRvIII细胞，每隔一天用DMSO或nimbolide (IV)处理小鼠(n = 5/亚组)并跟踪生存(图7F)。所有的动物最终都死了;然而，通过生物发光实验(图7C)和脑切片荧光显微镜(图7D)显示，nimbolide可以抑制肿瘤生长，延长小鼠的生存时间(图7E;Log Rank p值为0.017)。通过测量肿瘤面积(D中黄色轮廓线内的总面积)，我们发现nimbolide治疗的肿瘤比dmso治疗的肿瘤小40%左右(p值0.018)。GBMs的广泛增殖引起代谢应激导致坏死。nimbolide注射的肿瘤不仅更小，而且在对照肿瘤出现广泛坏死的同一时间点没有出现坏死(图7D中的星号)。未来的研究将需要确定nimbolide是否可以在更高的剂量下使用以提高大脑的生物利用度，以及nimbolide的结构修改是否可以使其更稳定，生物利用度和允许通过脑组织。我们的三种不同体内方法的综合结果表明，手术后通过片将nimbolide应用于肿瘤床和/或全身给予安全、优化剂量的nimbolide可能对GBM有效。[2]

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在体内，肿瘤接种后腹腔注射nimbolide(5和20 mg/kg体重)可显著降低结直肠癌异种移植物的体积。柠檬素处理的异种移植物的肿瘤细胞存活蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、c- ap -1、survivin和Mcl-1)、增殖蛋白(c-Myc和cyclin D1)、侵袭蛋白(MMP-9、ICAM-1)、转移蛋白(CXCR4)和血管生成蛋白(VEGF)的表达显著下调。发现类柠檬素在治疗小鼠的血浆和肿瘤组织中具有生物可利用性。 结论:我们的研究证明，nimbolide可以通过调节促炎微环境来抑制人类结直肠癌的生长。[5]

Nimbolide在治疗人类疾病方面发挥着重要作用。近年来，牛油果内酯的抗癌特性越来越受到人们的重视。然而，nimbolide在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用尚不清楚。在这项研究中，我们发现nimbolide治疗以剂量依赖的方式抑制NSCLC细胞的侵袭和迁移。此外，nimbolide剂量依赖性地抑制ERK1/2激活，降低Snail和MMP-3表达，增加E-cadherin表达。此外，我们发现nimbolide处理上调了DUSP4的表达。DUSP4敲低可减弱nimbolide介导的细胞侵袭、迁移和ERK1/2活化的抑制作用。我们还发现，敲除DUSP4可抑制nimbolide对MMP-3、Snail和E-cadherin表达的影响。综上所述，我们的研究表明，nimbolide处理可以上调DUSP4的表达，从而抑制ERK1/2的激活。nimbolide抑制ERK1/2通路，降低MMP-3和Snail的表达，增加E-cadherin的表达，最终抑制NSCLC细胞的侵袭和迁移。因此，nimbolide可能是一种通过调控ERK1/2信号和DUSP4表达来抑制NSCLC侵袭转移的新型药物[4]。

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ELISA试验[4]
细胞加入或不加入nimbolide孵育12小时。细胞悬液在4°C下1000 rpm离心10 min。采用MMP-3酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA Kit)进行酶联免疫吸附测定。简单地说，96孔板每孔预包被抗mmp -3抗体，并加入50 μl细胞悬液或参比标准液。二抗孵育2小时后，加入HRP溶液。最后加入稳定显色剂，用Bio-Rad Model 680型微孔板仪在595 nm处检测OD值。通过与标准品的比较，测定了MMP-3的浓度。

Western blot分析[3]
将细胞(1 × 106 /板)培养于含生长培养基的100 mm培养板中，24h后细胞(融合度70-80%)用无血清培养基洗涤2次，用5 ml无血清培养基孵育饥饿。饥饿后，细胞用二甲亚砜(对照)处理，MCF-7细胞用2和4 μM的nimbolide处理，MDA-MB-231细胞用4和6 μM的nimbolide处理。处理24h后，用含有1X蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀法(RIPA)缓冲液裂解细胞，用Lowry法测定蛋白浓度细胞裂解液(50µg)在12%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后转移到PVDF膜上。将膜与抗IGF信号分子、PCNA、c-Myc、p21、细胞周期蛋白和β-肌动蛋白的一抗一起在tris缓冲盐水中孵育。洗涤后，用酶标抗小鼠IgG(1:5000)和山羊抗兔IgG(1:5000)孵育。采用化学发光系统(ECL kit)检测蛋白条带并定量。

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生长因子(IGF-I)、PI3K抑制剂(LY294002)与nimbolide治疗[3]
将细胞(每板1 × 106个)培养于含生长培养基的100 mm培养板中，24小时后用无血清培养基洗涤2次(融合度为70-80%)，在5 ml无血清培养基中培养饥饿细胞。分别在细胞培养基中分别添加或不添加IGF-I (50 ng ml−1)、23 LY294002 (50 μM)预处理1 h。预处理后给予MCF-7细胞2 μM和4 μM的nimbolide, MDA-MB-231细胞4 μM和6 μM的nimbolide。24h后，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，定量蛋白。western blot分析pAkt。

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流式细胞仪分析细胞周期[3]
细胞(1 × 106个/板)在含生长培养基的100 mm培养板中培养。饥饿后给予MCF-7细胞2 μM和4 μM nimbolide, MDA-MB-231细胞4 μM和6 μM nimbolide。24h后，0.25%胰蛋白酶收获细胞，3000xg离心5min。然后用PBS洗涤细胞。离心后，细胞在- 20°C下于100%冷冻甲醇中固定过夜。然后将细胞置于50µg ml−1碘化丙啶PBS和1 mg m−1核糖核酸酶PBS中孵育30分钟。在FACSCalibur上进行细胞周期分析，使用CellQuest Pro软件分析数据。

In vivo Experiments[2]
Animals were monitored daily by animal care personnel. For flank in vivo xenografts experiments, 1.5 × 106 U87EGFRvIII cells were injected into the flanks of nu/nu mice. For glioma initiation experiment, cell were pretreated with EtOH (control) or Azt for 1h and injected into the flanks. Mice did not receive any further injections of EtOH or Azt. For glioma progression experiment, similar numbers of untreated cells were injected and tumors were allowed to grow for seven days. Following this, 62.5 ul of 95% ethanol or Azt (0.34 μg/g body weight) was injected directly into the tumor bed of the left and right flank respectively, every other day for eight days. To examine the effect of systemic effect of nimbolide, we injected 1.5 × 106 U87EGFRvIII cells into the flanks of nu/nu mice, allowed tumor seeding for three days and treated animals with nimbolide (@10μg/Kg body wt, IV) or vehicle (DMSO) every day for seven days. Tumor growth was monitored by measuring tumor volume every other day by using the formula π/6 × A × B2 (A = larger diameter; B = smaller diameter). Tumors were dissected out and imaged using an iPAD 3. For intracranial xenograft experiments, U87EGFRvIII cells were infected with LeGo-Cer2 lentivirus expressing firefly luciferase or lentivirus expressing DsRed fluorescent reporter. 1 × 105 cells, unlabeled or labeled cells (depending on experimental group – see results) were injected into the cerebral cortex of male nu/nu mice (2mm caudal to bregma; 2 mm right of midline; 3 mm deep) using a stereotactic device. Tumor seeding was allowed for three days following which mice received nimbolide (@ 200μg/Kg body wt, IP) or vehicle (DMSO). All animals were imaged twice – once, three days after tumor seeding before start of treatment to ensure they had similar starting signals and next, on day 14. Five minutes before imaging, mice were anesthetized and injected (IP) with luciferin (150 mg/Kg) and imaged using IVIS (Xenogen). All mice were euthanized following observation of lethargy and/or neurological symptoms. For DsRed-labeled tumors, 2 mm thick coronal brain sections were dissected and tumor area was measured using the Image J software.

[1]. Chemopreventive and therapeutic effects of nimbolide in cancer: the underlying mechanisms. Toxicol In Vitro. 2014 Aug;28(5):1026-35.

[2]. Direct inhibition of retinoblastoma phosphorylation by nimbolide causes cell-cycle arrest and suppresses glioblastoma growth. Clin Cancer Res. 2014 Jan 1;20(1):199-212.

[3]. lumalai P, Arunkumar R, Benson CS, Sharmila G, Arunakaran J. Nimbolide inhibits IGF-I-mediated PI3K/Akt and MAPK signalling in human breast cancer cell lines (MCF-7 and MDA-MB-231). Cell Biochem Funct. 2014 Jul;32(5):476-84.

[4]. Lin H, Qiu S, Xie L, Liu C, Sun S. Nimbolide suppresses non-small cell lung cancer cell invasion and migration via manipulation of DUSP4 expression and ERK1/2 signaling. Biomed Pharmacother. 2017 Aug;92:340-346.

[5]. Gupta SC, Prasad S, Sethumadhavan DR, Nair MS, Mo YY, Aggarwal BB. Nimbolide, a limonoid triterpene, inhibits growth of human colorectal cancer xenografts by suppressing the proinflammatory microenvironment. Clin Cancer Res. 2013 Aug 15;19(16):4465-76.

methyl 2-[(1R,2S,4R,6R,9R,10S,11R,15R,18R)-6-(furan-3-yl)-7,9,11,15-tetramethyl-12,16-dioxo-3,17-dioxapentacyclo[9.6.1.02,9.04,8.015,18]octadeca-7,13-dien-10-yl]acetate has been reported in Pyrola and Azadirachta indica with data available.

C27H30O7

466.52300

466.199

C, 69.51; H, 6.48; O, 24.01

25990-37-8

25990-37-8

12313376

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

608.6±55.0 °C at 760 mmHg

321.9±31.5 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.597

2.66

92.04

0

7

4

34

1040

9

CC1=C2C(C[C@H]1C3=COC=C3)O[C@@H]4[C@H]5C6[C@@](C)(C=CC(=O)[C@]6(C)[C@@H](CC(=O)OC)[C@]24C)C(=O)O5

JZIQWNPPBKFOPT-LSYMHUITSA-N

InChI=1S/C27H30O7/c1-13-15(14-7-9-32-12-14)10-16-20(13)27(4)17(11-19(29)31-5)26(3)18(28)6-8-25(2)22(26)21(23(27)33-16)34-24(25)30/h6-9,12,15-17,21-23H,10-11H2,1-5H3/t15-,16-,17-,21-,22+,23-,25-,26+,27-/m1/s1

methyl 2-[(1R,2S,4R,6R,9R,10S,11R,15R,18R)-6-(furan-3-yl)-7,9,11,15-tetramethyl-12,16-dioxo-3,17-dioxapentacyclo[9.6.1.02,9.04,8.015,18]octadeca-7,13-dien-10-yl]acetate

Nimbolide; 25990-37-8; Nimbolide?; NSC-309909; CHEMBL426690; N993G4LGD6; SCHEMBL2146198; DTXSID20948894;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~107.18 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (2.14 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (2.14 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。