δ Opioid Receptor/DOR; mAChR1

脑渗透代谢物 N-去甲基氯氮平优先与 M1 毒蕈碱受体结合，IC50 为 55 nM，并且是比氯氮平更有效的部分激动剂（EC50、115 nM 和 50% 乙酰胆碱反应）[1]。N-desmethylclozapine对 M1 mAChR 具有轻微的激动作用，并对大脑皮层和海马中的 5-HT1A 受体具有激动作用。该化合物还充当大脑皮层和纹状体中 δ-阿片受体的激动剂[2]。 N-去甲基氯氮平 (3 μM) 大大降低兴奋性神经元的外向电流，但不降低抑制性神经元的外向电流。在兴奋性神经元中，单独使用 N-去甲基氯氮平比单独使用氯氮平或氯氮平与 N-去甲基氯氮平的组合更有效。 0.1 μM 哌仑西平和 1 μM 阿托品可显着抑制 N-去甲基氯氮平对兴奋性神经元的作用。 N-去甲基氯氮平（而非氯氮平）通过兴奋性细胞中的 M1 受体抑制 K+ 通道[3]。在未刺激条件下以及 TSST-1 刺激下，N-去甲基氯氮平会导致 TxB2 水平降低。氯氮平、N-去甲基氯氮平和 CPZ 可能通过调节 TxA2 或 TxB2 的产生来作用于神经递质系统 [5]。 N-去甲基氯氮平、盐酸氟西汀和沙美特罗希那菲特在感染 DENV-2 的 Huh-7 细胞中的 IC50 值分别为 1 μM、0.38 μM 和 0.67 μM。与 DMSO 处理相比，用所有三种抑制剂处理的细胞中 NS3 的水平均降低，表明抑制剂在病毒蛋白翻译之前的阶段发挥作用。 N-去甲基氯氮平处理的细胞显示负链 RNA 水平降低了 75% 以上[6]。

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非典型抗精神病药氯氮平广泛用于治疗难治性精神分裂症患者。氯氮平及其主要活性代谢产物N-desmethylclozapine/N-去甲基氯氮平（NDMC）具有复杂的药理学特性，并与各种神经递质受体相互作用。有几项生化研究报告称，NDMC在人重组M1毒蕈碱受体上表现出部分激动剂特征。然而，显示NDMC激活完整神经元中天然M1受体的能力的直接电生理证据很差。我们之前使用大鼠海马神经元证明，毒蕈碱激动剂oxotremorine M（oxo-M）激活毒蕈碱受体会导致-40mV时外向K（+）电流的减少。在本研究中，我们使用这种毒蕈碱电流反应评估了氯氮平和NDMC在完整海马兴奋性和抑制性神经元中天然毒蕈碱受体上的激动剂和拮抗剂活性。M1拮抗剂哌仑西平对氧代-M诱导的电流反应的抑制仅在兴奋性神经元中明显，而M3拮抗剂达非那新对这两种类型的神经元都有效。NDMC的毒蕈碱激动剂活性高于氯氮平，兴奋性神经元的活性高于抑制性神经元，对哌仑西平敏感，与氯氮平合用时部分被掩盖。氯氮平的毒蕈碱拮抗剂活性以及NDMC在兴奋性和抑制性神经元之间没有差异，但氯氮平比NDMC更有效。这些结果表明，NDMC具有激活海马兴奋性神经元中表达的天然M1受体的能力，但由于存在过量具有毒蕈碱拮抗剂活性的氯氮平，其激动剂活性在氯氮平治疗的患者中可能受到限制。[3]

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血栓素A2（TxA2）及其受体的激活已被证明可以调节血管收缩和血小板聚集，以及多巴胺能和5-羟色胺能信号传导。多巴胺能和5-羟色胺能系统在精神分裂症的病理生理学中起着至关重要的作用，这些系统是抗精神病药物（AP）的主要靶点。由于第一种抗精神病药物氯丙嗪（CPZ）已被证明可以降低TxA2，我们假设AP氯氮平及其代谢产物N-desmethylclozapine/N-去甲基氯氮平（NDMC）也可能影响TxA2的产生。我们使用毒性休克综合征毒素-1（TSST-1）和抗表面抗原CD3与蛋白CD40的单克隆抗体（OKT3/CD40）作为兴奋剂，在全血测定中测量了10名健康女性受试者的未刺激和刺激血液样本中非常不稳定的分子TxA2的代谢产物血栓素B2（TxB2）的水平。血液中补充了四种不同浓度的APs-CPZ、氯氮平或NDMC。此外，在不同刺激条件下，在不添加AP的情况下测量血液中的血栓素水平。在TSST-1和OKT3/CD40刺激下，氯氮平在所有应用浓度下均显著降低了TxB2的平均浓度（p<0.05）。NDMC导致未刺激条件下和TSST-1刺激下TxB2水平降低。在未刺激和TSST-1刺激的条件下，CPZ在低浓度下降低了TxB2的产生。氯氮平、NDMC和CPZ可能通过调节TxA2或TxB2的产生作用于神经递质系统。此外，AP的已知副作用，如直立性低血压，可能是TxA2或TxB2浓度变化的结果。[5]

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每年约有1万人死于严重的登革热，世界人口的三分之二生活在登革热流行的地区。登革热病毒疫苗开发取得了显著进展；然而，目前还没有获得许可的登革热抗病毒药物，而且似乎也没有一种正在进行临床试验。我们采取了通过筛选药理学活性化合物库来重新定位已批准的抗登革热病毒活性药物的方法。基于感染细胞数量和病毒滴度的减少，我们确定N-desmethylclozapine/N-去甲基氯氮平、盐酸氟西汀和沙美特罗新酸盐为登革热病毒抑制剂。在抑制剂处理的细胞中，登革热病毒RNA水平降低，这种作用是登革热病毒特有的，因为其他黄病毒，如日本脑炎病毒和西尼罗河病毒，或其他RNA病毒，如呼吸道合胞病毒和轮状病毒，不受这些抑制剂的影响。所有三种抑制剂都以高纳摩尔范围内的50%抑制浓度（IC50）特异性抑制登革热病毒复制。对负链RNA中间体的估计和添加时间实验表明，抑制发生在进入后阶段，最有可能发生在病毒RNA复制的起始阶段。最后，我们表明抑制最有可能是由于内溶酶体途径的调节和自噬的诱导[6]。

大鼠和人体内的 N-去甲基氯氮平/N-desmethylclozapine在 M2 和 M4 mAChR 上分别进行突触前调节 GABA 和谷氨酸释放。特别是，N-desmethylclozapine/N-去甲基氯氮平可能是大鼠中的 M2 mAChR 拮抗剂，但在人新皮质中对该受体没有活性。然而，N-去甲基氯氮平在人类中对 M4 mAChR 有激动作用，但在大鼠新皮质中没有这种作用[4]。

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氯氮平是典型的抗精神病药物，其活性部分由氯氮平及其主要代谢产物N-desmethylclozapine/N-去甲基氯氮平（NDMC）组成。先前的研究表明，NDMC在改善氯氮平治疗的精神分裂症患者的认知方面可能比专利化合物本身更重要。虽然氯氮平和NDMC的药理学在大多数方面相似，但NDMC已被证明是M1毒蕈碱受体部分激动剂，而氯氮平在体外和体内都是M1拮抗剂。我们假设，NDMC可能通过直接刺激M1受体增加内侧前额叶皮层（mPFC）中多巴胺（DA）和乙酰胆碱（ACh）的释放来改善认知，而NDMC和氯氮平本身也会通过其他机制这样做，氯氮平会抑制NDMC的M1激动剂作用。在本研究中，我们在清醒、自由活动的大鼠中使用微透析，发现10和20毫克/千克剂量的NDMC显著增加了mPFC和HIP中DA和ACh的释放，但在伏隔核（NAC）中没有。M1偏好拮抗剂telenzepine（3mg/kg）完全阻断了NDMC（10mg/kg）诱导的皮质DA和ACh释放的增加。氯氮平（1.25 mg/kg）本身对皮质中DA或ACh的释放没有影响，它阻断了NDMC（10 mg/kg）诱导的ACh在mPFC中的释放，但不阻断DA的释放。5-HT1A受体拮抗剂WAY100635（0.2 mg/kg）阻断了NDMC（20 mg/kg）诱导的皮质DA，但不阻断ACh的释放。这些发现表明：（1）NDMC是M1激动剂，而氯氮平在体内是M1拮抗剂；（2）NDMC的M1激动作用有助于皮质ACh和DA的释放；（3）NDMC由于其M1激动作用，可能比氯氮平本身更有效地治疗精神分裂症中观察到的认知障碍；（4）M1受体激动可能是开发可以改善精神分裂症认知缺陷的药物的有价值的靶点，也可能是其他神经精神疾病的靶点。[1]

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黄氨酸对所有脑区的M1毒蕈碱乙酰胆碱受体（mAChR）以及大脑皮层和海马的5-HT1A受体具有激动活性。另一方面，N-去甲基氯氮平对M1 mAChR表现出轻微的激动作用，并对大脑皮层和海马中的5-HT1A受体表现出激动作用。该化合物还表现为大脑皮层和纹状体δ-阿片受体的激动剂。此外，N-去甲基氯氮平对[（35）S]GTPγS与Gαi/o结合的刺激作用部分是通过mAChR（最有可能是M4 mAChR亚型）介导的，至少在纹状体中是这样。 结论：对天然脑组织中表达的mAChRs（特别是M1亚型，也可能是M4亚型）、5-HT1A受体和δ-阿片受体的激动作用，其中一些是这两种化合物共有的，另一些则是两者的特异性，可能形成了这两种化合物在治疗精神分裂症患者方面的独特有益效果。这些特征为我们开发新的抗精神病药物提供了线索，这些药物超越了多巴胺D2受体拮抗的框架，不仅对阳性症状有效，而且对阴性症状和/或认知/情感障碍也有效。[2]

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胆碱能传递在学习、记忆和认知中起着关键作用，胆碱能传递的紊乱与阿尔茨海默病、癫痫和精神分裂症等神经系统疾病有关。包括N-desmethylclozapine/N-去甲基氯氮平（NDMC）在内的药物对这些疾病的药物缓解在动物模型中很有希望，但在患者身上往往失败。因此，我们比较了NDMC对大鼠和人类新皮层切片中谷氨酸能和GABA能传递的影响。我们使用卡巴胆碱（CCh；一种已建立的代谢型毒蕈碱乙酰胆碱（ACh）受体（mAChRs）激动剂）作为参考。使用标准电生理学方法，包括细胞内和场电位记录。在大鼠新皮层中，NDMC阻止了CCh诱导的GABAA和GABAB受体介导的反应的减少，但没有阻止CCh导致的成对脉冲抑制的增加。NDMC既不降低兴奋性突触后电位（EPSP）的振幅，也不拮抗CCh诱导的EPSP抑制。然而，在人类新皮层中，NDMC未能阻止CCh诱导的GABAB反应的减少，并直接降低了EPSP的振幅。这些数据表明，NDMC在M2和M4 mAChRs分别对GABA和谷氨酸释放的突触前调节有明显的影响。特别是，NDMC可能是大鼠的M2 mAChR拮抗剂，但在人类新皮层中对该受体没有活性。然而，NDMC在人类中对M4 mAChR具有激动作用，但在大鼠新皮层中没有这种作用。本研究证实，mAChRs的药理学在物种之间可能存在差异，并强调了对人体组织进行研究的必要性[4]。

抑制剂治疗。[6]
用Huh-7和A549细胞进行登革热病毒感染和抑制剂治疗实验，并通过BHK-21细胞的空斑试验测定培养上清液中的病毒滴度。从8μM浓度开始，使用2倍稀释的抑制剂进行IC50（50%抑制浓度）实验。将总共30000个细胞铺在48孔板中，以3的感染复数（MOI）感染DENV-2，并与含有抑制剂的2%Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）一起孵育。感染后24小时收集上清液（p.i.），通过BHK-21细胞的空斑试验估算病毒滴度。对于蛋白质印迹，在下文所述的抑制剂处理条件下，如前所述制备细胞裂解物（10），并用识别DENV非结构蛋白3（NS3）（Raj Bhatnagar的一种礼物）、微管蛋白单克隆抗体、钙网蛋白和78 kDa葡萄糖调节蛋白（GRP78）抗体探测膜。对于LC3检测，使用对LC3-II型具有高特异性的抗体（LC3b[D11]；细胞信号技术）。通过化学发光检测信号。（流式细胞术实验的描述见补充材料。）

药物[1]
NDMC/N-去甲基氯氮平和氯氮平溶于少量0.1 M酒石酸溶液中，并用0.1 N NaOH调节pH至6-7。WAY100635（Wyeth Laboratories，费城，宾夕法尼亚州）和替仑西平（Research Chemical Inc.）溶于去离子水。将溶剂或药物以1.0 ml/kg的剂量皮下注射给随机分组的大鼠。
插管后3-5天，在异氟烷轻度麻醉下，将透析探针植入大鼠的内侧前额叶皮层（mPFC）和伏隔核（NAC）。然后将大鼠单独饲养在透析笼中过夜。探针以0.4 μl/min的流速进行过夜灌注后，将流速增加至1.5 μl/min。1小时后，每30分钟收集一次透析液样本。灌注液为Dulbecco磷酸盐缓冲液，含Ca2+（138 mM NaCl、8.1 mM Na2HPO4、2.7 mM KCl、1.5 mM KH2PO4、0.5 mM MgCl2、1.2 mM CaCl2，pH 7.4）。本实验无需在透析液中添加酯酶抑制剂（Ichikawa等，2002b）。透析液基线值稳定后，每只大鼠分别接受两次注射：载体/NDMC（N-去甲基氯氮平）、WAY100635/NDMC、替仑西平/NDMC或氯氮平/NDMC。每次实验结束后，通过脑组织解剖验证透析探针的位置。

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背景：3-(3-己氧基-1,2,5-噻二唑-4-基)-1,2,5,6-四氢-1-甲基吡啶（沙诺美林）和去甲基氯氮平作为有前景的抗精神病药物，因其疗效更佳，尤其对阴性症状和/或认知/情感障碍具有改善作用，而备受关注。方法：采用以下三种方法，在从大鼠大脑皮层、海马和纹状体制备的脑膜上，进行鸟苷-5'-O-(3-[(35)S]硫代)三磷酸([(35)S]GTPγS)结合实验：(1) 常规过滤法；(2) 抗体捕获闪烁邻近分析法；(3) 免疫沉淀法。[2]

代谢/代谢物
N-去甲基氯氮平已知的代谢物包括去甲基氯氮平N-葡萄糖醛酸苷。
N-去甲基氯氮平是氯氮平已知的代谢物。

[1]. N-desmethylclozapine, a major metabolite of clozapine, increases cortical acetylcholine and dopamine release in vivo via stimulation of M1 muscarinic receptors. Neuropsychopharmacology. 2005 Nov;30(11):1986-95.

[2]. Comparative analysis of pharmacological properties of xanomeline and N-desmethylclozapine in rat brain membranes. J Psychopharmacol. 2016 Sep;30(9):896-912.

[3]. Electrophysiological evidence showing muscarinic agonist-antagonist activities of N-desmethylclozapine using hippocampal excitatory and inhibitory neurons. Brain Res. 2016 Jul 1;1642:255-62.

[4]. Different pharmacology of N-desmethylclozapine at human and rat M2 and M 4 mAChRs in neocortex. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2015 May;388(5):487-96.

[5]. Impact of clozapine, N-desmethylclozapine and chlorpromazine on thromboxane production in vitro. Med Chem. 2012 Nov;8(6):1032-8.

[6]. N-Desmethylclozapine, Fluoxetine and Salmeterol inhibit post-entry stages of dengue virus life-cycle. Antimicrob Agents Chemother. 2016 Oct 21;60(11):6709-6718.

N-去甲基氯氮平是一种二苯并二氮杂卓类化合物，其分子结构中含有氯和哌嗪基团，是氯氮平的主要代谢产物；氯氮平是一种强效且选择性的5-HT2C血清素受体拮抗剂。它既是氯氮平的代谢产物，又是δ-阿片受体激动剂和血清素能拮抗剂。它属于二苯并二氮杂卓类化合物、哌嗪类化合物和有机氯化合物。
ACP-104，即N-去甲基氯氮平，是氯氮平的主要代谢产物，目前正由ACADIA公司开发，作为一种治疗精神分裂症的新型独立疗法。它结合了非典型抗精神病药物的疗效特征，并具有增强认知功能的潜在益处，从而解决了当今治疗精神分裂症的一大挑战。

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药物适应症
已研究用于治疗精神分裂症和分裂情感性障碍。

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作用机制
ACP-104 将 M1 毒蕈碱受体激动剂、5-HT2A 受体反向激动剂以及 D2 和 D3 多巴胺受体部分激动剂结合于单一化合物中。ACP-104 可独特地刺激被称为 M1 毒蕈碱受体的脑细胞，这些受体在认知中发挥着重要作用。ACP-104 是一种部分激动剂，可弱激活多巴胺 D2 和 D3 受体。 ACP-104 的这些部分激动剂特性可能导致其运动副作用比大多数其他抗精神病药物更少。

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药效学
ACP-104 是我们正在开发的一种用于治疗精神分裂症的新疗法的小分子候选药物。已知服用氯氮平后，体内会生成大量的 ACP-104，即 N-去甲基氯氮平。也就是说，氯氮平会代谢为 ACP-104。我们发现 ACP-104 具有刺激 m1 毒蕈碱受体（一种关键的毒蕈碱受体）的独特能力。众所周知，m1 毒蕈碱受体在认知中发挥着重要作用。由于氯氮平本身会阻断 m1 毒蕈碱受体，患者需要将氯氮平大量代谢为 ACP-104 才能刺激该受体，从而克服氯氮平的阻断作用。使用 ACP-104 可避免代谢过程的变异性以及氯氮平的竞争性作用。与氯氮平一样，ACP-104 是一种多巴胺拮抗剂和 5-HT2A 反向激动剂。我们认为，ACP-104 代表了一种治疗精神分裂症的新方法，它结合了非典型抗精神病药物的疗效特征以及有益的认知效应这一额外优势。

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本研究的主要发现是：(1) 氯氮平的主要活性代谢物 NDMC 显著增加了内侧前额叶皮层 (mPFC) 和海马 (HIP) 中多巴胺 (DA) 和乙酰胆碱 (ACh) 的释放，但对伏隔核 (NAC) 没有影响；(2) M1 受体优先拮抗剂替仑西平完全阻断了 NDMC 引起的 mPFC 中 DA 和 ACh 的释放； (3) 氯氮平 (1.25 mg/kg) 完全阻断了 NDMC (10 mg/kg) 诱导的 ACh 释放，这与之前的报道一致，即 NDMC 是一种强效的 M1 受体激动剂，而氯氮平在体内具有 M1 受体拮抗剂的特性；(4) 氯氮平预处理并未阻断 NDMC 诱导的皮质 DA 释放，表明 M1 受体激动作用并非 NDMC 产生此效应的原因；(5) 5-HT1A 受体拮抗剂 WAY100635 部分阻断了 NDMC 引起的 mPFC 中 DA（而非 ACh）释放的增加，表明皮质 DA 释放部分依赖于 5-HT1A 受体的刺激。
氯氮平对 DA 或 ACh 释放的影响很可能是氯氮平和 NDMC 的联合作用，即激动剂/拮抗剂混合作用的结果。因此，高水平的NDMC，尤其是高NDMC/氯氮平比值，会增强M1毒蕈碱受体的刺激作用，这与质量作用理论和激动剂/拮抗剂混合实验的预测一致（Brauner-Osborne等，1996）。据报道，大鼠在长期服用氯氮平期间脑内氯氮平浓度是NDMC浓度的三倍（Weigmann等，1999）。目前尚无关于人体内NDMC和氯氮平相对水平的信息。在一些接受氯氮平治疗的患者血浆样本中检测到高浓度的NDMC（Hasegawa等，1993）。高水平的NDMC，尤其是高NDMC/氯氮平比值，会进一步增强M1毒蕈碱受体的刺激作用。目前关于氯氮平阻断NDMC诱导的ACh释放的数据与我们实验室的临床数据一致，这些数据表明，NDMC/氯氮平比值比单独的氯氮平浓度更能预测氯氮平的临床疗效（Frazier等，2003；Mauri等，2003；Weiner等，2004）。
总之，NDMC优先增加mPFC和HIP中的DA和ACh释放，但不增加NAC中的DA和ACh释放，这与氯氮平和其他非典型抗精神病药物的作用相似。替利嗪平和氯氮平对NDMC诱导的ACh释放的阻断表明，M1受体的刺激有助于NDMC增加皮质DA和ACh的释放，证实NDMC具有显著的M1受体激动作用，而其母体化合物氯氮平则是一种拮抗剂。[1]

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在本研究中，我们通过监测毒蕈碱电流反应，评估了氯氮平及其主要活性代谢物NDMC在大鼠完整海马兴奋性和抑制性神经元中天然毒蕈碱受体上的激动剂和拮抗剂活性。我们的数据清楚地表明，氯氮平主要作为拮抗剂发挥作用，而NDMC则作为混合型激动剂-拮抗剂发挥作用。NDMC的激动剂活性（这可以解释为它作用于M1而非M3亚型受体）在同时应用相同浓度的氯氮平时被很大程度上掩盖。这些结果表明，氯氮平治疗患者体内氯氮平/NDMC浓度比值可能决定NDMC激活M1受体的程度。[3]

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总之，目前的数据对将大鼠神经元的研究结果外推至人类神经元提出了一些质疑，尤其是在使用标准化合物之外的其他药物时，因为NDMC在两种物种中的药理学特性存在显著差异（Thomas等人，2010）。因此，尽管人体组织本身存在局限性，但本研究强调了在人体组织中开展研究的必要性。[4]

C17H17CLN4

312.797

312.114

C, 65.28; H, 5.48; Cl, 11.33; N, 17.91

6104-71-8

N-Desmethylclozapine-d8; 1189888-77-4; N-Desmethylclozapine-d8 hydrochloride; 2705402-91-9

135409468

Light yellow to green yellow solid powder

1.38g/cm3

490.1ºC at 760 mmHg

120-125°C

250.2ºC

1.709

3.22

39.66

2

3

1

22

421

0

ClC1=CC=C2C(N=C(N3CCNCC3)C4=CC=CC=C4N2)=C1

JNNOSTQEZICQQP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H17ClN4/c18-12-5-6-15-16(11-12)21-17(22-9-7-19-8-10-22)13-3-1-2-4-14(13)20-15/h1-6,11,19-20H,7-10H2

3-chloro-6-piperazin-1-yl-11H-benzo[b][1,4]benzodiazepine

AZD-5991; AZD-5991 S-enantiomer; N-Desmethylclozapine; Norclozapine; 6104-71-8; Desmethylclozapine; N-desmethyl clozapine; N-desmethyl-clozapine; N-DEMETHYLCLOZAPINE; 8-Chloro-11-(1-piperazinyl)-5H-dibenzo(b,e)(1,4)diazepine; AZD 5991 S-enantiomer.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ≥ 50 mg/mL (~159.9 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。