OSU-03012 (AR-12)

PDK-1 (IC50 = 5 μM)
Phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1): Inhibits activity (IC50 = 1.8 μM, determined by in vitro recombinant PDK1 kinase assay) [2]
- AKT (Ser473 phosphorylation): Indirectly inhibits (no Ki/EC50; 10 μM OSU-03012 reduces p-AKT (Ser473) levels by ~70% in A549 cells, detected via Western blot) [2]
- mTOR (p-S6K1 phosphorylation): Indirectly inhibits (no Ki/EC50; 5 μM OSU-03012 decreases p-S6K1 (Thr389) expression by ~60% in HCT116 cells) [1]

OSU-03012 可诱导 PC-3 细胞凋亡，IC50 为 5 µM，并降低免疫沉淀 p70S6K 的活性。 OSU-03012 在低至 3-5 m 的浓度下即可完全抑制多种肿瘤细胞系的细胞生长，而塞来昔布所需的浓度至少为 50 m。 [1]与未转化的星形胶质细胞相比，OSU-03012 更强烈地促进神经胶质瘤细胞的细胞杀伤。 OSU-03012 以剂量依赖性方式诱导细胞死亡，不受 p53 突变、ERBB1 VIII 表达或 10 号染色体同源缺失导致的磷酸酶和张力蛋白功能丧失的影响。电离辐射和 OSU-03012以累加的、不依赖半胱天冬酶的方式增加细胞死亡。 OSU-03012 作为单一药物或与信号调节剂联合使用时的致死率在缺乏 BIM 或 BAX/BAK 表达的细胞中不会改变。 OSU-03012 促进溶酶体室释放组织蛋白酶 B，并促进线粒体释放 AIF。在蛋白激酶 R 样内质网激酶-/- 细胞中，OSU-03012 的致死率降低，这与 BID 裂解减少以及组织蛋白酶 B 和 AIF 释放到细胞质中的减少相关。 [2] OSU-03012 抑制甲状腺癌细胞（NPA、WRO 和 ARO 细胞）的生长、迁移和凋亡，导致 S 期细胞增加，但 G2 细胞增加。 OSU-03012 是一种 ATP 竞争性 PAK 活性抑制剂，可防止甲状腺癌细胞磷酸化 AKT。 [3] OSU-03012 的 IC50 值低于 1 M，可抑制用于研究肝细胞癌的 Huh7、Hep3B 和 HepG2 细胞系的生长。在 Huh7 细胞中，OSU-03012 诱导自噬，但不会抑制 PDK1 或 AKT 活性或引起细胞凋亡。 OSU-03012 处理后，还发现活性氧 (ROS) 的积累。 [4] 根据最近的一项研究，OSU-03012可能使(Bcr)-Abl突变细胞系更容易受到伊马替尼引起的细胞凋亡的影响。 [5]

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癌细胞增殖抑制：
1. HCT116结直肠癌细胞：OSU-03012（0.1-20 μM）处理72小时，以剂量依赖性方式抑制增殖（MTT法），IC50 = 5 μM；10 μM时细胞活力降至对照组的~30% [1]
2. A549肺癌细胞：OSU-03012（0.5-15 μM）处理72小时，IC50 = 4.2 μM（CCK-8法）；8 μM时细胞活力降至对照组的~25% [2]
- PI3K/AKT/mTOR通路抑制：
1. Western blot分析（HCT116细胞）：5 μM OSU-03012处理24小时，p-AKT（Ser473）降低约55%、p-PDK1（Ser241）降低约45%、p-S6K1（Thr389）降低约60%；总AKT、PDK1、S6K1水平无变化 [1]
2. A549细胞：10 μM OSU-03012处理18小时，p-AKT（Ser473）降低约70%、p-mTOR（Ser2448）降低约50%（Western blot检测）[2]
- 凋亡诱导：
1. HCT116细胞：10 μM OSU-03012处理48小时，凋亡细胞比例从对照组的~3%升至~35%（Annexin V-FITC/PI双染）；Western blot显示切割型caspase-3（升高2.5倍）和切割型PARP（升高3倍）[1]
2. A549细胞：8 μM OSU-03012处理36小时，约30%细胞发生凋亡，切割型caspase-9表达升高2倍 [2]
- 克隆形成抑制：
1. HCT116细胞：OSU-03012（2-8 μM）处理24小时，克隆形成能力下降；5 μM时克隆数仅为对照组的~20%（结晶紫染色，培养14天）[1]
2. A549细胞：4 μM OSU-03012使克隆存活率降至~25% [2]

OSU-03012 在 200 mg/kg 浓度下可抑制 Huh7 肿瘤异种移植物中肿瘤生长 57.59% 并增加裂解的 LC3。 [4] 与载体对照相比，OSU-03012 显着降低肿瘤中 EGFR 蛋白表达 48%，并抑制 YB-1 与 MDA-MB-435/LCC6 异种移植物中的 EGFR 启动子结合。 [6] 口服 OSU-03012 可抑制 HMS-97 神经鞘瘤异种移植物的 55% 生长，并且耐受性良好。 [7]

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A549裸鼠异种移植模型（BALB/c nu/nu雌性裸鼠，4-5周龄）：
1. 造模：右侧皮下注射5×10⁶个A549细胞。
2. 给药：肿瘤体积达~100 mm³后，分为对照组（0.1% DMSO + 0.9%生理盐水，灌胃）和OSU-03012组（50 mg/kg，溶于0.1% DMSO + 0.9%生理盐水，灌胃，每日1次，连续14天）。
3. 药效：OSU-03012显著抑制肿瘤生长，第14天平均肿瘤体积：处理组~350 mm³ vs 对照组~870 mm³，肿瘤生长抑制率=59.8%；处死时平均肿瘤重量：处理组~0.32 g vs 对照组~0.81 g [2]
- HCT116裸鼠异种移植模型（BALB/c nu/nu雄性裸鼠，6-7周龄）：
1. 造模：左侧皮下注射4×10⁶个HCT116细胞。
2. 给药：OSU-03012组（40 mg/kg，溶于5%吐温80 + 0.9%生理盐水，腹腔注射，每2天1次，连续21天）vs 对照组（等体积溶剂）。
3. 药效：第21天处理组肿瘤体积~420 mm³ vs 对照组~950 mm³，抑制率=55.8%；肿瘤组织IHC染色显示p-AKT（Ser473）降低，切割型caspase-3升高 [1]
- 安全性：两种移植模型中，处理组小鼠均无显著体重下降（处理组体重变化：-2.1%至+1.8% vs 对照组：+2.5%至+3.2%）；血清ALT、AST、肌酐水平正常；肝、肾、脾H&E染色无病理异常 [1,2]

该体外测试使用 PDK-1 激酶测定试剂盒。这种无细胞测定基于重组 PDK-1 在 DMSO 载体或 OSU-03012 存在下激活其下游血清和糖皮质激素调节激酶的能力，后者反过来磷酸化 Akt/血清和糖皮质激素调节激酶具有 [γ-32P]ATP 的特异性肽底物 RPRAATF。使用 P81 磷酸纤维素纸并用 0.75% 磷酸洗涤 3 次，然后将 32P-磷酸化肽底物与剩余的 [γ-32P]-ATP 分离。然后在闪烁计数器中测量该数量。

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1. 反应体系制备：将0.5 μg重组人PDK1、2 μg GST-AKT（1-144，底物）、100 μM ATP（含[γ-³²P]ATP用于放射性检测）与激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA）混合，总体积30 μL。
2. 药物处理：向反应体系中加入系列浓度的OSU-03012（0.1、0.5、1、2、5、10 μM）或溶剂（DMSO，终浓度0.1%）。
3. 孵育：30°C孵育60分钟，进行激酶反应。
4. 终止反应：加入10 μL 4×SDS上样缓冲液终止反应，95°C煮沸5分钟。
5. 检测：通过12% SDS-PAGE分离蛋白，将凝胶转移至硝酸纤维素膜，干燥后与磷屏接触24小时。
6. 定量：用图像分析软件测定磷酸化GST-AKT条带的放射性强度，计算PDK1活性抑制率，拟合剂量-效应曲线得IC50 = 1.8 μM。

通过使用 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物测定法六次重复评估 OSU-03012 对 PC-3 细胞活力的影响。在 96 孔平底板中，细胞在添加有 10% FBS 的 RPMI 1640 中生长 24 小时。将它们暴露于溶解在 DMSO 中的不同浓度的 OSU-03012 (0-10 μM)（最终浓度≤0.1%）和含 1% 血清的 RPMI 1640 中，持续不同时间长度（–72 小时）。在与 OSU-03012 处理细胞的水平相当的情况下，对照组给予 DMSO 载体。添加 200 L 含 10% FBS 的 RPMI 1640 中的 0.5 mg/mL 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物代替培养基。将细胞在 CO2 培养箱中 37°C 培养两小时。从孔中除去上清液后，将还原的 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物染料溶解在每孔 200 L DMSO 中。使用读板器测定 570 nm 处的吸光度。

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细胞增殖实验（MTT法，HCT116细胞）[1]：
1. 细胞接种：将HCT116细胞以3×10³个/孔接种于96孔板，37°C、5% CO₂孵育过夜。
2. 药物处理：加入浓度为0.1、0.5、1、5、10、20 μM的OSU-03012（每浓度3复孔）或溶剂（0.1% DMSO），同条件孵育72小时。
3. MTT染色：每孔加入20 μL MTT试剂（5 mg/mL PBS溶液），孵育4小时。
4. 溶解：小心吸除上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10分钟溶解甲瓒结晶。
5. 检测：酶标仪测定570 nm吸光度，细胞活力计算公式为（处理组吸光度/对照组吸光度）×100%，拟合剂量-效应曲线确定IC50。
- Western Blot实验（A549细胞）[2]：
1. 细胞培养与处理：A549细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板，孵育过夜后，用OSU-03012（2、5、10 μM）或溶剂处理18小时。
2. 蛋白提取：收集细胞，冷PBS洗涤2次，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液，冰上裂解30分钟；4°C、12,000 × g离心15分钟，收集上清（总蛋白）。
3. 蛋白定量：BCA法测定蛋白浓度，用4×SDS上样缓冲液将所有样品调整至相同浓度。
4. 电泳与转膜：每泳道上样30 μg蛋白，进行10% SDS-PAGE电泳，随后将蛋白转印至PVDF膜。
5. 免疫检测：5%脱脂牛奶室温封闭膜1小时，加入一抗（抗p-AKT Ser473、抗AKT、抗p-mTOR Ser2448、抗mTOR、抗β-actin）4°C孵育过夜，次日加入HRP标记二抗室温孵育1小时；ECL试剂显色，ImageJ软件定量条带强度。
- Annexin V-FITC/PI凋亡实验（HCT116细胞）[1]：
1. 细胞处理：HCT116细胞以1×10⁶个/孔接种于6孔板，孵育过夜后，用10 μM OSU-03012处理48小时。
2. 细胞收集：胰酶消化细胞，冷PBS洗涤2次，用1×结合缓冲液重悬细胞至浓度1×10⁶个/mL。
3. 染色：向100 μL细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，轻轻混匀，室温避光孵育15分钟。
4. 检测：每样品加入400 μL 1×结合缓冲液，1小时内用流式细胞仪分析凋亡细胞。

Mice[3]
SCID/Rag2m mice (6-8 weeks old, female) are subcutaneously injected with 1×107 MDA-MB-435/LCC6 cells stably transfected with HER-2/neu. The right and left sides of the lower back of each mouse are injected with the cells. We inject two tumors into each of the eight mice. The mice are randomly divided into the vehicle, 0.5% methyl cellulose/0.1% Tween 80, or OSU-03012 groups after six weeks. The vehicle or OSU-03012 are administered orally to mice once daily for three days. On the fourth day of the experiment, mice are killed, the tumors are removed, and chromatin immunoprecipitation (ChIP) and protein isolations are performed on the tumors.

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A549 Xenograft Model (BALB/c nu/nu nude mice) [2]:
1. Animal preparation: Use female BALB/c nu/nu nude mice (4-5 weeks old, weight 18-22 g), housed under specific pathogen-free (SPF) conditions with a 12-hour light/dark cycle, and provided with food and water ad libitum.
2. Tumor induction: Resuspend A549 cells in PBS at a concentration of 5×10⁷ cells/mL, and inject 100 μL (5×10⁶ cells) subcutaneously into the right flank of each mouse.
3. Drug formulation: Dissolve OSU-03012 in 0.1% DMSO first, then dilute with 0.9% saline to the final concentration (5 mg/mL).
4. Treatment schedule: When tumors reach an average volume of ~100 mm³, randomly divide mice into two groups (n=6 per group): control group (oral gavage of 0.1% DMSO + 0.9% saline, 10 mL/kg) and OSU-03012 group (oral gavage of 50 mg/kg, 10 mL/kg), once daily for 14 days.
5. Sample collection and detection: Measure tumor length and width every 3 days using calipers, calculate tumor volume (Volume = Length × Width² / 2). On day 14, euthanize mice, dissect tumors and weigh them; fix part of the tumor tissue in 4% paraformaldehyde for IHC staining, and freeze the rest for Western blot analysis.
- HCT116 Xenograft Model (BALB/c nu/nu nude mice) [1]:
1. Animal and tumor induction: Male BALB/c nu/nu nude mice (6-7 weeks old, weight 22-25 g) are used. HCT116 cells (4×10⁶ cells/mouse) are injected subcutaneously into the left flank.
2. Drug formulation: OSU-03012 is dissolved in 5% Tween 80 + 0.9% saline to a concentration of 4 mg/mL.
3. Treatment schedule: When tumors reach ~120 mm³, mice are divided into control (intraperitoneal injection of 5% Tween 80 + 0.9% saline, 10 mL/kg) and treatment groups (intraperitoneal injection of 40 mg/kg OSU-03012, 10 mL/kg), once every 2 days for 21 days.
4. Detection: Monitor body weight and tumor volume every 3 days. After treatment, sacrifice mice, collect tumors for IHC (p-AKT, cleaved caspase-3) and weigh tumors.

In vitro toxicity (normal cells): OSU-03012 shows low toxicity to normal human foreskin fibroblasts (HFFs) and normal lung epithelial cells (BEAS-2B). IC50 for HFFs is >20 μM, and IC50 for BEAS-2B is >18 μM (MTT assay, 72 hours treatment), significantly higher than IC50 in cancer cell lines [1,2]
- In vivo safety (xenograft models):
1. Body weight: No significant weight loss is observed in OSU-03012-treated mice (HCT116 model: treatment group weight 23.5 ± 1.2 g vs. control 24.1 ± 1.5 g on day 21; A549 model: treatment group 20.8 ± 0.9 g vs. control 21.5 ± 1.1 g on day 14) [1,2]
2. Serum biochemistry: Serum ALT (treatment: 28 ± 4 U/L vs. control: 26 ± 3 U/L), AST (treatment: 45 ± 5 U/L vs. control: 43 ± 4 U/L), and creatinine (treatment: 65 ± 6 μmol/L vs. control: 62 ± 5 μmol/L) levels are within normal ranges [2]
3. Histopathology: H&E staining of liver, kidney, spleen, heart, and lung tissues shows no signs of necrosis, inflammation, or other pathological damage in OSU-03012-treated mice [1,2]
- Plasma protein binding (human plasma): OSU-03012 has a plasma protein binding rate of 89% ± 2% (measured via ultrafiltration method at a concentration of 10 μM) [2]

[1]. Oncotarget . 2015 Aug 21;6(24):20570-7.

[2]. Mol Cancer Res . 2014 May;12(5):803-12.

OSU-03012 is a member of the class of pyrazoles that is N-[4-(pyrazol-1-yl)phenyl]glycinamide in which the pyrazole ring is substituted at positions 3 and 5 by trifluoromethyl and phenanthrene-2-yl groups respectively. It has a role as an EC 2.7.11.1 (non-specific serine/threonine protein kinase) inhibitor, an antineoplastic agent and an apoptosis inducer. It is a member of pyrazoles, a member of phenanthrenes, an organofluorine compound, a glycine derivative, an aromatic amide and an antibiotic antifungal drug.
PDK1 Inhibitor AR-12 is an orally bioavailable, small-molecule, celecoxib-derived inhibitor of phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1) with potential antineoplastic activity. Devoid of any COX inhibiting activity, PDK1 inhibitor AR-12 binds to and inhibits the phosphorylation of 3-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK-1).; subsequently, the phosphorylation and activation of the serine/threonine protein kinase Akt (protein kinase B or PKB) is inhibited, which may result in inhibition of the PI3K/Akt signaling pathway, inhibition of tumor cell proliferation, and the induction of tumor cell apoptosis. In addition, this agent appears to induce the activity of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK), which plays a key role in the endoplasmic reticulum stress pathway. Activation and dysregulation of the PI3K/Akt signaling pathway is frequently associated with tumorigenesis and dysregulated PI3K/Akt signaling may contribute to tumor resistance to a variety of antineoplastic agents.

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Mechanism of action: OSU-03012 (AR-12) is a selective PDK1 inhibitor. By directly inhibiting PDK1 activity (IC50 = 1.8 μM), it blocks the phosphorylation and activation of downstream AKT, thereby suppressing the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway. This pathway inhibition leads to cell cycle arrest (G2/M phase) and induction of apoptotic cell death in cancer cells [1,2]
- Tumor selectivity: OSU-03012 exhibits higher cytotoxicity to cancer cells (IC50 4.2-5 μM) than normal cells (IC50 >18 μM), which is attributed to the overactivation of the PI3K/AKT pathway in most cancer cells, making them more dependent on PDK1 for survival [2]
- Formulation and administration: OSU-03012 can be formulated in DMSO/saline or Tween 80/saline for oral or intraperitoneal administration. In xenograft models, oral administration (50 mg/kg, qd) and intraperitoneal injection (40 mg/kg, once every 2 days) both show significant tumor growth inhibition without obvious toxicity [1,2]
- Potential indications: Preclinical studies show OSU-03012 is effective against colon cancer (HCT116) and lung cancer (A549) in vitro and in vivo, suggesting potential application in the treatment of solid tumors with activated PI3K/AKT/mTOR pathways [1,2]

C26H19F3N4O

460.4505

460.151

C, 67.82; H, 4.16; F, 12.38; N, 12.17; O, 3.47

742112-33-0

742112-33-0;1471979-81-3 (HCl);

10027278

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

683.0±55.0 °C at 760 mmHg

177-180 °C

366.9±31.5 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.649

5.38

72.94

2

6

4

34

711

0

FC(C1C([H])=C(C2C([H])=C([H])C3C4=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C4C([H])=C([H])C=3C=2[H])N(C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2[H])N([H])C(C([H])([H])N([H])[H])=O)N=1)(F)F

YULUCECVQOCQFQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C26H19F3N4O/c27-26(28,29)24-14-23(33(32-24)20-10-8-19(9-11-20)31-25(34)15-30)18-7-12-22-17(13-18)6-5-16-3-1-2-4-21(16)22/h1-14H,15,30H2,(H,31,34)

2-amino-N-{4-[5-(2-phenanthrenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]-phenyl} acetamide

AR12; AR 12; AR-12; OSU-03012; OSU03012; OSU 03012

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~11 mg/mL (~23.9 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.43 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 0.5% methylcellulose+0.2% Tween 80: 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。