Abrocitinib (PF04965842)   中文名称: 阿布罗替尼

JAK1 (IC50 = 29 nM); JAK2 (IC50 = 803 nM); Tyk2 (IC50 = 1253 nM)
Abrocitinib (compound 25) inhibits, with IC50 values of 189, 163 nM, and 7.178 μM, respectively, the phosphorylation of STAT3 in response to IFNα, the phosphorylation of STAT1 in human whole blood (HWB), and pSTAT5 integrated into CD34+ of HWB (JAK2).

Abrocitinib（化合物 25）抑制 STAT3 响应 IFNα 的磷酸化、人全血 (HWB) 中 STAT1 的磷酸化以及整合到 HWB CD34+ 中的 pSTAT5，IC50 值分别为 189、163 nM 和 7.178 μM （JAK2）。

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在生理 ATP 浓度（1 mM）的生化实验中，阿布昔替尼 抑制 JAK1 的 IC₅₀ 为 29 nM，显示出对 JAK2（28 倍）、JAK3（>340 倍）和 TYK2（43 倍）的高选择性。
在人全血实验中，其抑制 IFNα 诱导的 pSTAT3（JAK1/TYK2 通路）的 IC₅₀ 为 189 nM，而对 EPO 诱导的 pSTAT5（JAK2/JAK2 通路）的抑制显著较弱（IC₅₀ 为 7.178 µM），证实了细胞水平的选择性。
在全血中，它还能强效抑制涉及 JAK1 异源二聚体的细胞因子通路（IFNγ、IL-6、IL-21）诱导的 STAT 磷酸化，IC₅₀ 值在 0.163–0.511 µM 范围内，而对 JAK2/TYK2（IL-12、IL-23）和 JAK2/JAK2（EPO）通路抑制较弱（IC₅₀ > 13 µM）。
该化合物在人肝微粒体中清除率低（<9 µL/min/mg），渗透性可接受（RRCK Papp AB = 16 x 10⁻⁶ cm/s）。[1]

在大鼠佐剂诱导的关节炎模型中，brachicitinib (Compound 25 (Abrocitinib or PF04965842)；5、15、50 mg/kg，口服，每日1次，连用7天)显著降低足跖肿胀[1]。
在大鼠佐剂性关节炎（AIA）疾病模型中，使用治疗性给药模式评估25 (Abrocitinib或PF04965842)对JAK1的体内抑制作用。（31a）经完全弗氏佐剂免疫的雌性Lewis大鼠在发病后连续7天口服25 (Abrocitinib或PF04965842)或对照物，通过体积描记仪测量后爪体积。在整个研究过程中，研究人员跟踪了狗爪的体积和重量。在给药7天结束时，评估25 (Abrocitinib或PF04965842)的血浆浓度。完成了两项研究。在最初的研究中，免疫大鼠被给予5、15或50 mg/kg 25 (Abrocitinib或PF04965842)或对照（PO）的QD（图S3）。由于在所有剂量下均观察到足跖肿胀的显著减少，因此进行了第二项研究，重点关注较低剂量（0.5、1、5或15 mg/kg 25 (Abrocitinib或PF04965842)或对照）。观察到后爪肿胀显著减少至1 mg/kg（图8，第6天和第7天）。使用Emax模型拟合的两项研究的集体药效学建模显示，未结合的Cave50约为1.3 μM （r2 ~ 0.91）。

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在大鼠佐剂性关节炎治疗模型中，口服给予 阿布昔替尼（疾病发作后，每日一次灌胃给药 0.5、1、5、15 或 50 mg/kg，持续 7 天）能剂量依赖性地显著减轻后爪肿胀。在低至 1 mg/kg 的剂量下即可观察到显著效果。
药效学模型表明，其产生疗效所需的未结合血浆平均浓度（Cave₅₀）约为 1.3 µM。
在大鼠靶点调节研究中，单次口服给药（5、15、50 mg/kg）能以血浆浓度依赖的方式抑制离体细胞因子（IL-6、IFNγ、IL-21）刺激后全血中的 STAT 磷酸化，计算得到的未结合血浆 IC₅₀ 值分别为 176 nM（IL-6 pSTAT1）、191 nM（IFNγ pSTAT1）和 938 nM（IL-21 pSTAT3）。
在 1 mg/kg 的有效剂量下，对 JAK1 依赖性细胞因子（IL-21、IFNα、IFNγ）的抑制 >60%，而 JAK2/JAK2 依赖性的 GM-CSF 信号传导基本不受影响（低剂量时抑制 <5%，15 mg/kg 时约 30%）。[1]

Caliper JAK酶终点IC50在1mm ATP下的测定[1]
将测试化合物在DMSO中溶解至30 mM的原始浓度。将化合物在DMSO中稀释，形成11点半对数稀释系列，最高浓度为600 μM。测试复合板还包含含有已知抑制剂的阳性对照孔，以确定100%的抑制作用，以及含有DMSO的阴性对照孔，以确定无抑制作用。化合物板在实验中以1:60稀释，最终测定化合物浓度范围为10 μM ~ 100 pM， DMSO浓度为1.7%。
人类JAK的活性是通过微流控实验来检测合成肽的磷酸化，这些肽是通过重组人JAK家族四成员（JAK1、JAK2、JAK3和TYK2）的重组人激酶结构域来测定的。各实验条件对酶浓度和室温孵育时间进行优化，获得20%-30%磷酸化肽产物的转化率。将250 nL溶于100% DMSO的测试化合物和对照物样品通过非接触式声学分点器添加到384孔聚丙烯板上。室温下，15 μL反应缓冲液中含有20 mM HEPES、pH 7.4、1 mM ATP、10 mM氯化镁、0.01%牛血清白蛋白（BSA）、0.0005% Tween 20和1 mM DTT。反应混合物中含有1 μM的荧光标记合成肽，浓度小于表观Km。JAK1和TYK2检测中含有1 μM肽5FAM-KKSRGDYMTMQID， JAK2和JAK3检测中含有1 μM肽FITC-KGGEEEEYFELVKK。测定是通过添加酶开始的。用含有180 mM HEPES， pH 7.4, 20 mM EDTA， 0.2% Coating Reagent的缓冲液15 μL停止测定，最终浓度为10 mM EDTA， 0.1% Coating Reagent, 100 mM HEPES, pH 7.4。利用LabChip 3000迁移转移技术，对每个分析反应取样以确定磷酸化水平。该技术是基于分离的，允许直接检测荧光标记的底物和产品。分离是由真空压力和电场强度为每个肽底物优化的组合控制。

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JAK 激酶活性通过微流控迁移变化实验测定。将重组人激酶结构域（JAK1、JAK2、JAK3、TYK2）与测试化合物（在 DMSO 中进行 11 点半对数稀释，终浓度 DMSO 1.7%）在反应缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4，1 mM ATP，10 mM MgCl₂，0.01% BSA，0.0005% Tween 20，1 mM DTT）中室温孵育，缓冲液中包含 1 µM 荧光标记的肽底物（JAK1/TYK2 用 5FAM-KKSRGDYMTMQIG；JAK2/JAK3 用 FITC-KGGEEEEYFELVKK）。
反应通过添加含 180 mM HEPES pH 7.4，20 mM EDTA，0.2% 包被试剂的缓冲液终止。使用 LabChip 3000 系统通过测量磷酸化和非磷酸化肽的分离来定量磷酸化水平。
IC₅₀ 值通过归一化的剂量反应曲线确定。各激酶实验均经过优化以达到 20-30% 的底物转化率。[1]

人全血（HWB）测定[1]
用100% DMSO配制30 mM原液，稀释至5 mM，用DMSO配制10点2.5稀释系列，最高浓度为5 mM，再将4 μL上述试验品溶液加入96 μL最高浓度为200 μM的PBS中稀释。 在96孔聚丙烯板上，每孔加入90 μL的HWB，再加入5 μL以上制备的试样溶液，最高浓度为10 μM。混合后37℃孵育45 min。每孔加细胞因子5 μL （5 uL/孔）；最终，5000 U/mL IFNα, 100 ng/mL IFNγ, 50 ng/mL IL-6, 30 ng/mL IL-10, 5 ng/mL IL-12, 30 ng/mL IL-15, 50 ng/mL IL-21, 100 ng/mL IL-23, 1200 ng/mL IL-27或2 U/mL EPO)，持续15分钟。在IL-6和IFNγ刺激前15分钟，分别加入抗cd3 - pacific Blue和抗cd14 - pacific Blue抗体（在D-PBS中1:6稀释，3 uL/孔）。在所有孔中加入Lyse/Fix Buffer （1000 μL/孔）淬灭反应，37℃孵育20 min；用FACS缓冲液[含0.1% BSA和0.1%叠氮化钠的D-PBS]洗涤后，每孔加入400 μL冷水90% MeOH/H2O，冰孵育30 min。用冷FACS缓冲液再洗涤一次，最后用250 μL/孔的alexfluor 647偶联抗磷酸化stat抗体在FACS缓冲液中以1:25稀释重悬。抗pstat1 - alexafluor647在IFNγ和IL-6刺激下用于实验。Anti-pSTAT3-AlexaFluor647在IFNα、IL-6、IL-10、IL-21、IL-23和IL-27的刺激下用于实验。抗pstat4 - alexafluor647在IL-12刺激下用于实验。Anti-pSTAT5-AlexaFluor647用于IL-15和EPO刺激的细胞。4°C孵育过夜后，将所有样品转移到96孔聚丙烯u型底板(Falcon cat；不。353077)，在配备HTS板装载机的FACSCalibur、FACSCanto或LSRFortessa上进行流式细胞分析。对于IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、IL-27和IFNα刺激，对淋巴细胞群进行pSTAT3、4或5染色的直方图分析。对于EPO刺激，对所有事件（整个群体）进行门控，进行pSTAT5染色的直方图分析。对于IFNγ刺激，CD14+细胞进行pSTAT1染色的直方图分析。对于IL-6刺激，CD3+细胞进行pSTAT1和3染色的直方图分析。使用未受刺激的细胞定义背景荧光，并在峰脚下放置一个门，包括约0.5%的门控群体。使用CellQuest Pro 5.2.1版本、FACSDiva 6.2版本或FlowJo 7.6.1版本软件进行直方图统计分析。相对荧光单位（RFU），测量磷STAT水平，通过将阳性群体百分比与其平均荧光相乘计算。根据公式将10种化合物浓度（每种浓度均为单酸盐）的数据归一化为对照的百分比。 其中，A为含化合物和细胞因子的孔的RFU， B为不含细胞因子的孔的RFU（荧光最小），C为只含细胞因子的孔的RFU（荧光最大）。采用Prism version 5软件测定抑菌曲线和IC50值。

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使用人全血实验评估对细胞因子通路的功能性抑制。测试化合物在 DMSO 中系列稀释，然后用 PBS 稀释。新鲜或冻存的全血（90 µL/孔）与化合物在 37°C 预孵育 45 分钟。
加入优化浓度的细胞因子（如 5000 U/mL IFNα，100 ng/mL IFNγ，2 U/mL EPO）刺激 15 分钟。对于特定细胞群，在刺激前加入表面染色抗体（如抗 CD3、抗 CD14）。
反应用 Lyse/Fix Buffer 终止，细胞用冰预冷的 90% 甲醇透化，然后在 4°C 下与 Alexa Fluor 647 标记的、针对特定通路的抗磷酸化 STAT 抗体（pSTAT1、pSTAT3、pSTAT4、pSTAT5）孵育过夜。
样本通过流式细胞术分析。根据情况圈选淋巴细胞、单核细胞或 CD34⁺ 细胞。STAT 磷酸化水平以相对荧光单位计算。通过归一化至溶剂对照（0% 抑制）和仅细胞因子对照（100% 抑制）来确定抑制百分比和 IC₅₀ 值。[1]

动物/疾病模型：雌性Lewis大鼠（8-10周龄）[1]
剂量：5、15、50 mg/kg
给药途径：每日口服，连续7天
实验结果：所有剂量均显著减轻了爪肿胀。

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大鼠佐剂诱导关节炎模型[1]
本研究采用治疗剂量方案，在大鼠佐剂诱导关节炎模型中评估了JAK1抑制剂25（阿布西替尼或PF04965842）的体内疗效。该分子的疗效在两项独立的研究中进行了评估，分别使用了递减的剂量。通过对8-10周龄的雌性Lewis大鼠进行免疫，诱导其发生关节炎。免疫方法为：在尾根部皮内注射三次50 μL的完全弗氏佐剂（含15 mg/mL结核分枝杆菌的不完全弗氏佐剂）。首次免疫7天后，使用体积描记法测量免疫大鼠的基线后爪体积。每日监测大鼠的关节炎症状，包括体重变化和后爪体积测量值。当单个后爪的体积测量值增加0.2 mL（或以上）时，将动物随机分配到治疗组。每日通过灌胃给予25（阿布西替尼或PF04965842）治疗。实验 1 的治疗组分别为 50、15 和 5 mg/kg 的药物剂量或溶剂对照（2% Tween 80/0.5% 甲基纤维素/去离子水）。实验 2 的治疗组分别为 15、5、1 和 0.5 mg/kg 的药物剂量或溶剂对照（2% Tween 80/0.5% 甲基纤维素/去离子水）。动物入组后立即开始给药，持续 7 天。给药 7 天后，对动物实施安乐死。研究结束时，于给药后15分钟（血浆峰浓度）采集全血样本，用于分析STAT磷酸化水平；并在峰值（0.25小时）和谷值（24小时）时间点采集血浆样本，用于药物暴露药代动力学分析。

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对于大鼠佐剂诱导关节炎（AIA）模型，雌性Lewis大鼠经尾根部皮内注射含结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂进行免疫。
7天后，采用体积描记法测量基线后爪体积。当后爪体积增加≥0.2 mL时，将大鼠纳入研究并随机分配至治疗组。
阿布昔替尼或赋形剂（2% Tween 80/0.5%甲基纤维素去离子水）每日一次灌胃给药，连续7天。测试剂量包括 0.5、1、5、15 和 50 mg/kg。
在整个研究过程中监测爪体积和体重。在第 7 天给药后，分别于峰值（0.25 小时）和谷值（24 小时）采集血样，用于药代动力学和药效学分析（STAT 磷酸化）。[1]
在大鼠药代动力学研究中，Sprague-Dawley 大鼠分别接受静脉注射（1 mg/kg）或口服（3 mg/kg）阿布昔替尼。在不同时间点采集血样，并测定血浆浓度以计算药代动力学参数。[1]
在大鼠靶点调节研究中，未经处理的 Lewis 大鼠接受单次口服阿布昔替尼（5、15、50 mg/kg）。分别于给药后 0.25、0.5、2、4、8 和 24 小时采集系列血样，用于药物浓度测定和体外细胞因子刺激试验。[1]

药代动力学[1]
基于JAK1效力（生化和HWB）、JAK1/JAK2选择性以及可接受的体外代谢稳定性，我们选择了第二代磺胺类药物35和36（表5）以及砜类化合物19（表2）和磺胺类药物25（阿布昔替尼或PF04965842）（表3）进行药代动力学分析。在大鼠中以1 mg/kg静脉注射或3 mg/kg口服给药测定了药代动力学参数（表6）。化合物19和25（阿布昔替尼或PF04965842）的清除率相对于总肝血流量较低，而化合物35和36的清除率较高。化合物 19 和 25（阿布昔替尼或 PF04965842）的口服生物利用度更高，这与较低的清除率以及良好的体外渗透性和溶解度相一致。此外，该组类似物的分布容积适中（0.74–1.99 L/kg）。因此，单物种异速缩放预测化合物 19 和 25 的人体清除率值优于化合物 35 和 36。[1]
尽管化合物 19 和25（阿布西替尼或 PF04965842）在 JAK 生化和细胞分析中表现出相似的药代动力学特征和相似的效力，但一项包含多种 GPCR、离子通道、转运蛋白和酶（共 64 个靶点）的 10 μM 广泛功能性 CEREP 筛选表明，化合物 19 在结合试验中显示出对 CB-1 受体的活性（IC50 = 120 nM）。这转化为在大鼠毒代动力学研究中观察到的运动效应，与 CB-1 抑制作用一致。化合物25（阿布昔替尼或PF04965842）除对KDR激酶（VEGFR2，IC50 = 1.2 μM）和单胺氧化酶A（MAO-A，IC50 = 6 μM）有微弱活性外，对其他所有靶点均未显示出可测量的活性（>50%）。后续在功能性Caliper全细胞KDR激酶活性测定中的研究表明，浓度高达30 μM时，该化合物对KDR激酶活性没有影响。[1]
磺酰胺25（阿布昔替尼或PF04965842）也在广泛的激酶谱中进行了评估（表S3），结果表明它是一种高选择性化合物，对JAK3的抑制作用最强，在1 μM浓度下抑制率为61%。考虑到为了最大程度提高检测潜在脱靶活性的灵敏度，我们采用ATP Km浓度进行广泛的激酶谱分析，因此缺乏脱靶激酶抑制尤为值得关注。尽管JAK3在广泛的激酶谱分析中显示为脱靶靶点，但化合物25在ATP Km浓度下测得的IC50值为605 nM，在1 mM ATP浓度下测得的IC50值大于10 μM。总之，化合物25（阿布西替尼或PF04965842）是一种强效的JAK1抑制剂，在1 mM ATP浓度下，其对JAK2的选择性是JAK1的28倍，对JAK3的选择性是JAK3的340倍以上，对TYK2的选择性是TYK2的43倍（表S1），并且在更广泛的激酶组中具有优异的选择性。基于其良好的总体特性和在多种物种中的药代动力学特征（表S4和S5），化合物25进入了体内药效学和疗效研究。[1]

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在Sprague-Dawley大鼠中，静脉注射1 mg/kg剂量后，阿布西替尼的清除率(CL)为26.6 mL/min/kg，稳态分布容积(Vdss)为1.04 L/kg，半衰期(T₁/₂)为1.1小时。
口服3 mg/kg剂量后，生物利用度为95.6%。
体外研究表明，该药物在人肝微粒体中的清除率较低（<9 µL/min/mg），渗透性中等（RRCK Papp AB = 16 x 10⁻⁶ cm/s），且水溶性良好（pH 7.4时为503 µM）。
体外研究结果预测了人体清除率。系统（人肝微粒体、肝细胞）和来自大鼠和犬的单一物种异速缩放表明，该药物在人体内的清除率较低至中等（2.4-6.5 mL/min/kg），稳态分布容积（Vss）约为 1 L/kg。
主要的清除机制是通过 CYP450 代谢介导的，预计肾脏和胆汁清除有限。血浆蛋白结合率在不同物种间保持一致（游离分数约为 0.4）。[1]

在浓度为 10 µM 的广泛脱靶筛选（包含 64 个靶点，例如 GPCR、离子通道、转运蛋白和酶）中，阿布昔替尼 未显示出显著活性（抑制率 >50%），仅对 KDR 激酶（VEGFR2，IC₅₀ = 1.2 µM）和单胺氧化酶 A（MAO-A，IC₅₀ = 6 µM）有微弱抑制作用。后续的基于细胞的功能性 KDR 活性测定显示，浓度高达 30 µM 时也未观察到活性。
相反，一种相关的砜类似物（化合物 19）显示出对 CB-1 受体的活性（IC₅₀ = 120 nM），并在大鼠毒代动力学研究中转化为运动效应。阿布昔替尼 未表现出这种毒性。[1]

[1]. Identification of N-{cis-3-[Methyl(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)amino]cyclobutyl}propane-1-sulfonamide (PF-04965842): A Selective JAK1 Clinical Candidate for the Treatment of Autoimmune Diseases. J Med Chem. 2018 Feb 8;61(3):1130-1152.

阿布昔替尼是一种 Janus 激酶抑制剂。阿布昔替尼的作用机制是作为 Janus 激酶抑制剂和 P-糖蛋白抑制剂。
另见：阿布昔替尼（注释已移至）。

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阿布昔替尼 (PF-04965842)是通过修饰托法替尼的 3-氨基哌啶连接基而发现的，用磺酰胺封端的顺式-1,3-环丁二胺取代了该连接基，从而实现了对 JAK1 的高选择性。
该设计基于化合物与 JAK1 和 JAK2 结合的 X 射线晶体衍射分析，揭示了其与铰链区（JAK1 中的 Glu957 和 Leu959）、P 环的相互作用，以及一个关键残基差异（JAK1 中的 Glu966 与 JAK2 中的 Asp939）对选择性的贡献。
它被开发为治疗 JAK1 介导的自身免疫性疾病的临床候选药物。基于异速生长比例和人肝细胞数据，预计每日一次服用约 200 mg 的人体剂量即可达到 Cave₈₀ 对 IFNα 的抑制作用。
在成功的临床前研究之后，该药物进入了 I 期临床试验。[1]

C14H21N5O2S

323.41384100914

323.141

C, 51.99; H, 6.55; N, 21.65; O, 9.89; S, 9.91

1622902-68-4

2204280-33-9 (trans-isomer);1622902-68-4 (cis-isomer);

78323835

White to off-white solid powder

1.7

99.4

2

6

6

22

474

0

S(CCC)(NC1CC(C1)N(C)C1C2C=CNC=2N=CN=1)(=O)=O

IUEWXNHSKRWHDY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H21N5O2S/c1-3-6-22(20,21)18-10-7-11(8-10)19(2)14-12-4-5-15-13(12)16-9-17-14/h4-5,9-11,18H,3,6-8H2,1-2H3,(H,15,16,17)

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。