| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
PYK2 (IC50 = 637 nM)
PYK2 (proline-rich tyrosine kinase 2) – IC50 = 637 nM (enzyme assay). [1] FAK (focal adhesion kinase) – no IC50 reported. [1] p38 MAP kinase – reduced activity compared to BIRB796 (selectivity profiling showed improved selectivity over p38). [1] |
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| 体外研究 (In Vitro) |
在人骨髓间充质干细胞（hMSC）培养中，PF-4618433（0.1-1.0 μM；7 天）可刺激成骨作用。PF-4618433 以药物依赖的方式增加碱性磷酸酶（ALP）活性和矿化作用[1]。在 0.1 和 0.3 μM 的剂量下，PF-4618433（0.0125-0.3 μM；14 或 21 天）可改善钙沉积[2]。PF-4618433（0.0125-0.3 μM；24 小时）可促进成骨细胞增殖[2]。PF-4618433（IC50 为 637 nM）与 BIRB796 相比，在多种激酶选择性实验中表现出更高的 PYK2 抑制效力、更低的 p38 活性和更优的总体激酶选择性（10 μM 浓度下的抑制百分比）。 [1] 用 PF-4618433 处理 hMSC 培养物（第 1-7 天）可剂量依赖性地增加碱性磷酸酶活性和矿化作用（钙黄绿素标记的结节），表明其具有成骨活性。[1] 从 P1000:G10 水凝胶中释放的 PF-4618433 在 0.1、0.3 和 0.5 μM 浓度下显著抑制 Pyk2 酪氨酸激酶活性，与未用药对照组相比（p<0.05），其抑制效果与新鲜制备的抑制剂相当。[2] 与未处理的对照组相比，PF-4618433（0.1 和 0.3 μM）显著促进成骨细胞前体增殖（p<0.05），其中 0.1 μM 的活性最高。 [2]
PF-4618433（0.1 和 0.3 μM）在第 7 天显著提高了成骨细胞中的 ALP 活性。[2] PF-4618433（0.1 和 0.3 μM）在第 21 天增强了钙沉积（矿化），而 PF-431396 在这些浓度下对矿化没有影响。[2] 水凝胶释放的 PF-4618433（0.1 和 0.5 μM）与对照组相比显著增强了 ALP 活性（p<0.05），其活性与新鲜制备的抑制剂相当。[2] 水凝胶释放的 PF-4618433（0.5 μM）增强了 Ca²⁺ 结节的形成（茜素红 S 染色），表明成骨细胞分化和矿化增强。[2] |
| 酶活实验 |
结晶——使用浓度为 5 mg/ml 的蛋白储备液，成功实现了 apo-PYK2 与 BIRB796、PF-431396 和 PF-4618433 (PF-46) 抑制剂的共结晶。在共结晶实验中，使用浓度为 30 mM 的 DMSO 储备液配制抑制剂，使其最终浓度达到 0.5-1 mM。将 2 μl + 2 μl 的悬滴置于标准 Linbro 板中 750 μl 的孔溶液上方，并在 22 °C 下孵育。使用 Hampton 筛选法进行初步筛选，得到条件为：0.1 m 双-Tris：pH 6.0-7.0，0.2 m MgCl2，20-27% PEG 3350，1 mm TCEP，由此得到针状晶体，通过改进条件以及多轮划线和微晶播种进行优化。为了进行抑制剂共复合物结晶，将优化后的晶体在 3 mM 抑制剂溶液中浸泡过夜，以提高抑制剂的占有率[1]。
碱性磷酸酶 (ALP) 活性测定[2] 将骨髓间充质干细胞 (BMSC) 以 4 × 10⁴ 个细胞/孔的密度接种，并在 50 μM 抗坏血酸 (AA) 和 5 mM β-甘油磷酸酯 (β-GP) 的条件下，在有或无不同浓度 PF-43 或 PF-4618433 (PF-46) 的情况下培养 7 天，使其分化为成熟的成骨细胞。ALP 活性测定方法如下：将细胞裂解液加入到含有 2 mg/mL 对硝基苯磷酸酯的 1.5 M 碱性缓冲液中的 ALP 底物中，如前所述。加入 20 mM NaOH 终止酶促反应，并使用分光光度计记录 405 nm 处的吸光度。使用 Pierce™ BCA 蛋白测定试剂盒，以总蛋白浓度对 ALP 活性进行标准化。实验重复三次，每次实验均设置三个平行样本。 PYK2 激酶抑制实验：使用未活化的全长 C 端 His 标签人 PYK2 蛋白进行 PYK2 激酶活性测定。在加入 500 μM ATP 之前，将测试化合物与酶预孵育 1 小时。IC50 值由 8 点剂量反应曲线确定。对多种激酶进行选择性分析，结果以 10 μM 浓度下重复实验的平均抑制百分比表示。[1] 表面等离子共振 (SPR) 动力学：将 PYK2 催化结构域生物素化并固定在亲和素表面。动力学分析在 25°C 下进行，缓冲液为 50 mM Tris/HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、10 mM MgCl₂、1 mM MnCl₂、0.05% Tween 20 和 3% DMSO。化合物以 50-100 μL/min 的流速进样。PF-4618433 的结合速率常数为 10³/Ms（DFG-out 抑制剂的特征）。数据使用 Scrubber 2 软件进行处理，动力学分析使用 BiaEval 软件进行。[1] 核磁共振波谱：在有无 PF-4618433 (150 μM) 的情况下，通过 TROSY 谱分析 ¹⁵N-Phe 标记的 PYK2 激酶结构域 (100 μM)。该化合物稳定了 DFG-out 构象，导致 TROSY 谱图变窄，并在 DFG 环中出现了缺失的 Phe 峰。[1] 激酶抑制实验（细胞中表达 PYK2）：将 Pyk2 cDNA 转染至 293VnR 细胞，用释放的 PF-4618433（0.1、0.3、0.5 μM）处理 2 小时，然后对 Pyk2 进行免疫沉淀，并使用商业化的通用酪氨酸激酶检测试剂盒，按照制造商的方案进行酪氨酸激酶活性测定。[2] |
| 细胞实验 |
细胞增殖实验[2] 细胞
细胞类型：小鼠骨髓间充质干细胞 (BMSC) 测试浓度：0.1、0.3 μM 孵育时间：24 小时 实验结果：与未处理组或对照组相比，细胞增殖活性显著增强。 增殖实验 (MTS)：将 BMSC 以 2×10³ 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，加入 PF-4618433 (0-0.3 μM) 处理 24 小时。加入 MTS 试剂，并在 490 nm 波长处测定吸光度。所有实验均设置三个复孔，并重复三次。 [2] ALP活性测定：将BMSCs（4×10⁴个细胞）在有或无PF-4618433（0.1、0.3 μM）的情况下，用抗坏血酸（50 μM）和β-甘油磷酸钠（5 mM）诱导分化7天。用对硝基苯磷酸酯底物（2 mg/mL，溶于1.5 M碱性缓冲液）测定细胞裂解液；用20 mM NaOH终止反应；在405 nm处测定吸光度。ALP活性通过BCA法测定并标准化至总蛋白。[2] 矿化作用测定（茜素红S）：将BMSCs用PF-4618433（0.1、0.3 μM）诱导分化长达21天，固定后用40 mM茜素红S（pH 4.2）染色。结合的染料用 1% 氯化十六烷基吡啶的 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）提取，并在 562 nm 处测量吸光度。[2] 细胞毒性试验（ISO 10993-5）：将 MC3T3-E1 细胞（1.5×10³/孔）与水凝胶洗脱液共培养 24 小时，然后进行 MTS 试验。细胞活力 ≥70% 被认为无细胞毒性。[2] 水凝胶药物释放：将载有 AMC 或 PF-4618433 的水凝胶浸泡在 37°C 的 PBS 缓冲液中，在不同时间点收集等分试样，并测量荧光染料浓度。释放曲线符合菲克扩散定律（Higuchi 方程，R²>0.96）。 PF-4618433 从 P1000:G10 中释放时，最初表现为爆发式释放（1-4 小时），随后释放速度减慢，到第 3-4 天达到 100% 释放。[2] |
| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
PF-4618433 是一种二芳基脲类 PYK2 DFG-out 抑制剂，由 BIRB796 优化而来。该化合物以吡啶氧甲基吡唑部分取代了 BIRB796 中的 N-吗啉基乙氧基萘部分，从而提高了 PYK2 的抑制活性（IC50 = 637 nM）并降低了 p38 的活性。在与 PYK2 的共晶结构（分辨率 1.95 Å，PDB 代码 3FZT）中，吡唑环相对于 BIRB796 中的萘环旋转约 40°，并与催化残基 Lys-457 形成氢键。与 BIRB796 不同的是，Leu-504 保持与 apo 结构相似的构象，使得吡啶氮原子能够与铰链环中 Tyr-505 的主链酰胺形成氢键。在共晶结构中，激活环（DFG 基序之后的 Leu-570-Arg-572）中三个额外的残基清晰可见，Arg-572 的胍基通过与 PF-4618433 的甲苯基的堆积相互作用而稳定。该化合物以缓慢的结合动力学（10³/Ms）结合，这是 DFG-out 抑制剂的特征。选择性分析表明，与 BIRB796 和经典抑制剂（如 PF-431396）相比，该化合物具有更高的整体选择性。PF-4618433 可促进 hMSC 培养物中的成骨作用，并已被整合到 PEGDA-明胶水凝胶 (P1000:G10) 中以实现控释，释放的化合物仍保持其生物活性。[1][2]
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| 参考文献 |
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| 其他信息 |
富含脯氨酸的酪氨酸激酶2 (PYK2) 是一种胞质非受体酪氨酸激酶，参与多种信号通路。它是骨形成的负调控因子，被认为是治疗骨质疏松症的潜在药物靶点。我们解析了人PYK2激酶结构域与不同抑制剂复合物的高分辨率结构，证实了其经典的双叶激酶结构，并揭示了DFG环的构象变异性。我们的结构分析解释了经典激酶抑制剂PF-431396在FAK家族中缺乏选择性的原因。重要的是，两种二芳基脲抑制剂（BIRB796和PF-4618433）诱导的新型DFG-out构象揭示了一类独特的非受体酪氨酸激酶亚类，其特征在于门控氨基酸Met-502和独特的铰链环构象Leu-504。这是DFG-out构象中首次发现铰链环中的亮氨酸残基阻断ATP结合位点的情况。我们的结构、生物物理和药理学研究表明，DFG基序的独特特征，包括Leu-504铰链环的变异性，可用于开发选择性蛋白激酶抑制剂。[1] Pyk2是一种非受体酪氨酸激酶，属于黏着斑激酶家族。我们实验室和其他实验室的研究表明，缺乏Pyk2基因（Ptk2B）的小鼠由于成骨细胞活性增强和破骨细胞活性降低而骨量增加。此前已有报道，一种同时靶向Pyk2及其同源物FAK的化学抑制剂可以增加卵巢切除大鼠的骨形成。本研究开发了一种由聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和明胶组成的水凝胶，该水凝胶可通过可见光固化，适用于递送包括Pyk2靶向化学抑制剂在内的小分子药物。我们对该水凝胶的几个关键特性进行了表征，包括粘度、凝胶时间、溶胀性、降解性和药物释放行为。我们发现，由PEGDA1000和10%明胶组成的水凝胶（P1000:G10）具有宾汉流体特性，在原位聚合前具有良好的抗自由流动性，使其适合作为注射载体用于开放性伤口的治疗。与我们测试的其他水凝胶相比，P1000:G10水凝胶具有良好的细胞相容性和更缓慢的药物释放。重要的是，Pyk2抑制剂水凝胶保持了其对Pyk2酪氨酸激酶的抑制活性，并在体外促进了成骨细胞活性和矿物质沉积。总体而言，我们的研究结果表明，基于 Pyk2 抑制剂的水凝胶可能适用于治疗颅面和四肢骨缺损以及靶向骨再生。[2]
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| 分子式 |
C24H27N7O2
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|---|---|
| 分子量 |
445.52
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| 精确质量 |
445.222
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| 元素分析 |
C, 64.70; H, 6.11; N, 22.01; O, 7.18
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| CAS号 |
1166393-85-6
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| 相关CAS号 |
1166393-85-6
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| PubChem CID |
25203958
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| 外观&性状 |
White to off-white solid powder
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| 密度 |
1.3±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
587.6±50.0 °C at 760 mmHg
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| 闪点 |
309.2±30.1 °C
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| 蒸汽压 |
0.0±1.6 mmHg at 25°C
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| 折射率 |
1.649
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| LogP |
4.86
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| tPSA |
109.75
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
3
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| 氢键受体(HBA)数目 |
5
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| 可旋转键数目(RBC) |
7
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| 重原子数目 |
33
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| 分子复杂度/Complexity |
635
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
O=C(NC1C=C(COC2C=NC=CC=2)NN=1)NC1=CC(C(C)(C)C)=NN1C1C=CC(C)=CC=1
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| InChi Key |
NJARPUHZDSAXPL-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C24H27N7O2/c1-16-7-9-18(10-8-16)31-22(13-20(30-31)24(2,3)4)27-23(32)26-21-12-17(28-29-21)15-33-19-6-5-11-25-14-19/h5-14H,15H2,1-4H3,(H3,26,27,28,29,32)
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| 化学名 |
1-[5-tert-butyl-2-(4-methylphenyl)pyrazol-3-yl]-3-[5-(pyridin-3-yloxymethyl)-1H-pyrazol-3-yl]urea
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| 别名 |
PF-4618433; PF4618433; 1-(3-(tert-butyl)-1-(p-tolyl)-1H-pyrazol-5-yl)-3-(3-((pyridin-3-yloxy)methyl)-1H-pyrazol-5-yl)urea; 1-[5-tert-butyl-2-(4-methylphenyl)-1,2-dihydro-3H-pyrazol-3-ylidene]-3-{3-[(pyridin-3-yloxy)methyl]-1H-pyrazol-5-yl}urea; CHEMBL1084269; 1-[5-tert-butyl-2-(4-methylphenyl)pyrazol-3-yl]-3-[5-(pyridin-3-yloxymethyl)-1H-pyrazol-3-yl]urea; PF 4618433
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO: ~100 mg/mL (~224.5 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.2446 mL | 11.2228 mL | 22.4457 mL | |
| 5 mM | 0.4489 mL | 2.2446 mL | 4.4891 mL | |
| 10 mM | 0.2245 mL | 1.1223 mL | 2.2446 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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463611831
