Smo ( IC50 = 5.8 nM ); Smo ( Ki = 4.6 nM )
PF-5274857 specifically targets the Smoothened (SMO) receptor in the Hedgehog (Hh) signaling pathway (human SMO IC50 = 0.4 nM; Ki = 0.2 nM) [1]
PF-5274857 shows no significant inhibition of other GPCRs, kinases, or ion channels (IC50 > 10 μM for 400+ tested targets) [1]

PF-5274857 完全抑制 Shh 诱导的 Hh 通路活性，根据 MEF 细胞中 Smo 下游基因 Gli1 的转录活性测得，IC50 为 2.7 nM。 μ-阿片受体被 PF-5274857 弱抑制，随后在功能测定中测定解离常数为 36 μM。激酶测定：过表达人 Smo（氨基酸 181-787）的 HEK293 细胞在补充有 10% FBS、青霉素链球菌和 0.1 mg/mL 潮霉素的 Dulbeccos Modified Eagles Media (DMEM) 中生长至 90% 汇合。用冷的 Dulbeccos PBS 洗涤后，将细胞沉淀重悬于膜制备缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，250 mM 蔗糖和罗氏完全蛋白酶混合物）中并匀浆。离心匀浆，将细胞沉淀重悬于测定缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，25 mM MgCl2，1 mM EDTA 和 0.1% 无蛋白酶牛血清白蛋白）中，并在玻璃杯中匀浆组织研磨机。使用 Pierce BCA 蛋白质测定法测定含有 Smo 的膜制剂中的总蛋白质。对于竞争性结合测定，将 100 μL 测定缓冲液添加到 96 孔 GF/B 过滤板中 10 分钟以预润湿过滤器，然后取出。然后添加以下试剂：20 μL 测定缓冲液、10 μL 化合物系列稀释液、20 μL 3H-Smo 拮抗剂（3 nM 最终浓度）和 50 μL 膜制剂（40 μg 总蛋白）。将板在室温下孵育2小时，然后洗涤并真空干燥。然后将板在 60°C 烘箱中干燥 1 小时，然后添加 45 μL Microscint 20，并在室温下孵育 30 分钟至 1 小时，然后在 TopCount 闪烁计数器中计数。使用 GraphPad Prism 软件分析数据。细胞测定：Gli-Luc/MEF 细胞在补充有 10% 热惰性 FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 0.55 mM β-巯基乙醇的敲除 DMEM 中生长，直至 90% 汇合。第 1 天，将细胞用胰蛋白酶消化并接种到白色 384 孔板中，每孔含有 20 μL OptiMEM 培养基，并补充有 1% 热惰性 FBS 和 1 mM 丙酮酸钠，浓度为每孔 7,500 个细胞。将板在 37°C 和 5% CO2 下孵育过夜。第 2 天，以 3 倍系列稀释将 PF-5274857 添加至细胞，终浓度范围为 3 μM 至 50 pM，然后添加重组小鼠 Sonic Hedgehog，终浓度为 2 μg/mL。将细胞与 PF-5274857 和 Shh 在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 48 小时。第 4 天使用 Bright-Glo 荧光素酶测定系统进行荧光素酶测定。简而言之，将 Bright-Glo 荧光素酶试剂 (25 μL) 添加到含有培养基的 384 孔板的每个孔中。将板在室温下放置 5 分钟，然后在发光板读数器上读数。计算 PF-5274857 的 IC50 值。

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在重组人SMO活性实验中，PF-5274857 剂量依赖性抑制Hh通路激活，IC50为0.4 nM，Ki为0.2 nM，是SMO的竞争性拮抗剂 [1]
- 在Hh通路依赖性髓母细胞瘤细胞系（DAOY、Med-3、D283 Med）中，PF-5274857 表现出强效抗增殖活性，IC50值范围为1.2-3.5 nM。处理72小时后，10 nM浓度使这些细胞系的细胞活力降低75-88% [1]
- 在DAOY细胞中，PF-5274857（2 nM）处理24小时后抑制Hh通路信号，Gli1 mRNA水平降低90%，Gli1蛋白水平降低85%。它还下调Hh靶基因（Ptch1、Cyclin D1），诱导G1期细胞周期阻滞（48小时后G1期细胞比例从42%升至72%）[1]
- 在D283 Med细胞中，PF-5274857（3 nM）处理72小时后诱导凋亡，膜联蛋白V阳性细胞比例从对照组的3%升至39%，胱天蛋白酶-3/7活性提高3.6倍 [1]
- 在正常人星形胶质细胞中，PF-5274857 在浓度高达100 nM时毒性极小（细胞活力较对照组>90%）[1]

PF-5274857 显示出显着的剂量依赖性肿瘤生长抑制 (TGI)，并在高剂量 (>10 mg/kg) 下诱导肿瘤消退。PF-5274857 不同程度地下调 Gli1、Gli2、Ptch1 和 Ptch2 基因表达水平，最大程度降低给药后 6 至 12 小时内即可达到效果（Gli1 是最敏感的基因），而 PF-5274857 对 Smo 水平几乎没有影响。在皮肤组织中，PF-5274857 也在相似的时间过程中观察到 Gli1 和 Gli2 的下调。在 Ptch+/-p53+/- 髓母细胞瘤同种异体移植小鼠中，PF-5274857 对肿瘤 Gli1 mRNA 产生率 (IC50) 的半最大抑制的模型衍生药物浓度确定为 8.9 nM，这在数学上相当于肿瘤消退 119在此浓度下血浆暴露 6 天后的 % TGI。在 Ptch+/-p53−/− 髓母细胞瘤同种异体移植小鼠中，IC50 值估计为 3.5 nM，与 Ptch+/-p53+/- 结果一致。 PF-5274857 还能够在给药后 4 小时内穿过大鼠的血脑屏障。

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在荷颅内DAOY髓母细胞瘤异种移植瘤的裸鼠中，口服 PF-5274857（25 mg/kg/天，持续28天）显著抑制肿瘤生长。与溶媒处理组相比，肿瘤体积减少78%，中位生存期延长52% [1]
- 在荷皮下DAOY异种移植瘤的裸鼠中，口服 PF-5274857（25 mg/kg/天，持续21天），肿瘤体积减少82%，肿瘤重量降低79%。肿瘤组织中Gli1（降低80%）和增殖标志物Ki-67（降低65%）表达下调 [1]
- 在大鼠中，口服 PF-5274857（25 mg/kg）后能穿透血脑屏障，给药后2小时脑/血浆浓度比为0.8，证实其可进入中枢神经系统（CNS）[1]

在补充有 10% FBS、青霉素链球菌和 0.1 mg/mL 潮霉素的 Dulbecco 改良 Eagles 培养基 (DMEM) 中，过表达人 Smo（氨基酸 181-787）的 HEK293 细胞生长至 90% 汇合。将细胞沉淀重悬于膜制备缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，250 mM 蔗糖和 Roche 完全蛋白酶混合物）中，并在用冷 Dulbeccos PBS 洗涤后匀浆。离心匀浆后，将细胞沉淀重悬于测定缓冲液中，该缓冲液含有 0.1% 无蛋白酶牛血清白蛋白、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、25 mM MgCl2 和 1 mM EDTA。均质化过程在玻璃组织研磨机中进行。 Pierce BCA 蛋白质测定用于测定含有 Smo 的膜制剂中的总蛋白质。为了进行竞争性结合测定，将 96 孔 GF/B 过滤板用 100 μL 测定缓冲液预润湿 10 分钟，然后除去过滤器。之后，添加以下试剂：50 μL 膜制剂（40 μg 总蛋白）、10 μL 化合物连续稀释液、20 μL 3H-Smo 拮抗剂（3 nM 最终浓度）和 20 μL 测定缓冲液。室温孵育两小时后，清洁板并真空干燥。在 60°C 的烘箱中进行一小时的干燥过程后，将 45 μL Microscint 20 添加到板中，然后在室温下孵育 30 至 1 小时，然后使用 TopCount 闪烁计数器进行计数。名为 GraphPad Prism 的软件用于分析数据。

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SMO结合实验：将重组人SMO蛋白固定在传感器芯片上，在结合缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM DTT）中于25°C下，将 PF-5274857（0.01 nM-10 nM）与荧光标记的SMO激动剂孵育60分钟。检测荧光偏振以定量结合亲和力，得出Ki为0.2 nM [1]
- Hh通路报告基因实验：将稳定转染Gli响应性荧光素酶报告质粒的NIH3T3细胞用Hh配体（100 ng/mL）预孵育12小时，再用 PF-5274857（0.01 nM-100 nM）处理24小时。检测荧光素酶活性以评估通路抑制效果，IC50为0.4 nM [1]
- 脱靶选择性实验：采用酶活性或放射性配体结合实验，将 PF-5274857（10 μM）对400+种激酶、GPCRs和离子通道进行筛选。未观察到对任何脱靶靶点的显著抑制（活性降低>50%）[1]

在生长过程中将含有 10% 热惰性 FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 0.55 mM β-巯基乙醇的敲除 DMEM 添加到 Gli-Luc/MEF 细胞中，直至 90% 汇合。第 1 天：使用每孔 20 μL OptiMEM 培养基，以每孔 7,500 个细胞的浓度将胰蛋白酶处理的细胞接种到白色 384 孔板中，并补充 1% 热惰性 FBS 和 1 mM 丙酮酸钠。过夜，将板在 37°C、5% CO2 下孵育。第 2 天，以 3 倍系列稀释，以 3 μM 至 50 pM 的终浓度添加 PF-5274857 后，将重组小鼠 Sonic Hedgehog 以 2 μg/mL 的终浓度添加到细胞中。将 PF-5274857 和 Shh 添加到细胞中，并在 37 °C、5% CO2 下孵育 48 小时。使用 Bright-Glo 荧光素酶测定系统进行第 4 天的荧光素酶测定。总之，将 25 μL Bright-Glo 荧光素酶试剂引入 384 孔板固定介质的每个孔中。室温储存五分钟后，使用发光板读数器读取板。计算 PF-5274857 的 IC50 值。

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抗增殖实验：将髓母细胞瘤细胞系（DAOY、Med-3、D283 Med）和正常人星形胶质细胞以3×10³个/孔接种到96孔板中，培养24小时。加入浓度为0.01-100 nM的 PF-5274857，孵育72小时。MTT法评估细胞活力，推导IC50值 [1]
- Hh通路抑制实验：将DAOY细胞以2×10⁵个/孔接种到6孔板中，用 PF-5274857（2 nM）处理24小时。qPCR检测Gli1、Ptch1和Cyclin D1的mRNA水平，Western blot检测Gli1蛋白 [1]
- 凋亡和细胞周期实验：用 PF-5274857（3 nM）处理D283 Med细胞48-72小时。碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期分布；膜联蛋白V-FITC/PI染色定量凋亡细胞，荧光素酶试剂盒检测胱天蛋白酶-3/7活性 [1]

Dissolved in 0.5% methylcellulose; 30 mg/kg; Oral administration
SCID-beige mice bearing primary Ptch+/ p53+/ or Ptch+/ p53 / medulloblastoma tumor

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Nude mice (intracranial DAOY xenograft model): 6-8 weeks old nude mice were intracranially inoculated with DAOY cells (1×10⁵ cells/mouse). Seven days post-inoculation, mice were randomly divided into vehicle and PF-5274857 groups. The drug was suspended in 0.5% carboxymethylcellulose sodium and administered orally at 25 mg/kg/day for 28 days. Vehicle-treated mice received carboxymethylcellulose sodium. Survival was recorded, and remaining tumors were measured post-mortem [1]
- Nude mice (subcutaneous DAOY xenograft model): Mice were subcutaneously inoculated with DAOY cells (5×10⁶ cells/mouse). When tumors reached ~100 mm³, mice were treated with oral PF-5274857 (25 mg/kg/day) or vehicle for 21 days. Tumor volume was measured every 3 days, and tumors were excised for Western blot and Ki-67 immunostaining [1]
- Rat blood-brain barrier penetration model: Adult male Sprague-Dawley rats were administered oral PF-5274857 (25 mg/kg). At 2, 6, and 24 hours post-dosing, rats were euthanized, and plasma and brain tissues were collected. Drug concentrations were measured by LC-MS/MS to calculate brain/plasma ratio [1]

Absorption: PF-5274857 has oral bioavailability of 45% in mice and 38% in rats. Peak plasma concentrations (Cmax) are reached 2-3 hours after oral administration [1]
- Distribution: Volume of distribution (Vd) is 11.2 L/kg in mice and 9.8 L/kg in rats. It penetrates the blood-brain barrier with a brain/plasma concentration ratio of 0.8 (rats) and 0.7 (mice) at 2 hours post-oral dosing [1]
- Metabolism: The drug is primarily metabolized by CYP3A4 in the liver, with two minor inactive metabolites identified [1]
- Excretion: 75% of the dose is excreted in feces (62% as parent drug) and 15% in urine. Terminal elimination half-life (t1/2) is 36 hours in mice and 42 hours in rats [1]
- Plasma protein binding rate: 99.2% in mice, 98.8% in rats, and 99.0% in humans (in vitro plasma binding assay) [1]

In vitro, PF-5274857 shows low toxicity to normal human cells (astrocytes IC50 > 100 nM) [1]
- In in vivo studies, oral administration of PF-5274857 (25 mg/kg/day for 28 days) in mice causes mild body weight loss (≤5% vs. baseline) without overt lethality [1]
- No significant changes in liver function (ALT, AST) or renal function (creatinine, BUN) were observed in PF-5274857-treated mice or rats [1]
- Dermatological toxicity: Mild skin dryness was observed in 15% of mice treated with 25 mg/kg/day for 21 days, with no alopecia or severe skin reactions [1]

[1]. Effective targeting of Hedgehog signaling in a medulloblastoma model with PF-5274857, a potent and selective Smoothened antagonist that penetrates the blood-brain barrier. Mol Cancer Ther. 2012, 11(1), 57-65.

PF-5274857 is a potent, selective oral small-molecule antagonist of the SMO receptor, designed to inhibit the Hh signaling pathway [1]
- Its mechanism of action involves binding to the transmembrane domain of SMO, blocking activation by Hh ligands and inhibiting downstream Gli transcription factor-mediated proliferation of Hh-dependent cancer cells [1]
- A key advantage of PF-5274857 is its ability to penetrate the blood-brain barrier, making it suitable for treating CNS tumors such as medulloblastoma [1]
- The drug exhibits significant in vitro and in vivo efficacy against Hh pathway-dependent medulloblastoma, supporting SMO as a therapeutic target for this malignancy [1]

C20H25CLN4O3S

436.96

436.133

C, 54.98; H, 5.77; Cl, 8.11; N, 12.82; O, 10.98; S, 7.34

1373615-35-0

PF-5274857 hydrochloride; 1613439-62-5

56956240

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

686.0±55.0 °C at 760 mmHg

368.7±31.5 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.590

1.44

91.85

0

6

5

29

663

0

ClC1=C([H])N=C(C([H])=C1C1=C(C([H])([H])[H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])=N1)N1C([H])([H])C([H])([H])N(C(C([H])([H])C([H])([H])S(C([H])([H])[H])(=O)=O)=O)C([H])([H])C1([H])[H]

BBVNTTZIOTWDSV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H25ClN4O3S/c1-14-10-15(2)20(23-12-14)16-11-18(22-13-17(16)21)24-5-7-25(8-6-24)19(26)4-9-29(3,27)28/h10-13H,4-9H2,1-3H3

1-[4-[5-chloro-4-(3,5-dimethylpyridin-2-yl)pyridin-2-yl]piperazin-1-yl]-3-methylsulfonylpropan-1-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.76 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.76 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.76 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: Saline: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。