Smo ( IC50 = 5.8 nM ); Smo ( Ki = 4.6 nM )

体外活性：PF-5274857 完全抑制 Shh 诱导的 Hh 通路活性，根据 MEF 细胞中 Smo 下游基因 Gli1 的转录活性测得，IC50 为 2.7 nM。 μ-阿片受体被 PF-5274857 弱抑制，随后在功能测定中测定解离常数为 36 μM。激酶测定：过表达人 Smo（氨基酸 181-787）的 HEK293 细胞在补充有 10% FBS、青霉素链球菌和 0.1 mg/mL 潮霉素的 Dulbeccos Modified Eagles Media (DMEM) 中生长至 90% 汇合。用冷的 Dulbeccos PBS 洗涤后，将细胞沉淀重悬于膜制备缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，250 mM 蔗糖和罗氏完全蛋白酶混合物）中并匀浆。离心匀浆，将细胞沉淀重悬于测定缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，25 mM MgCl2，1 mM EDTA 和 0.1% 无蛋白酶牛血清白蛋白）中，并在玻璃杯中匀浆组织研磨机。使用 Pierce BCA 蛋白质测定法测定含有 Smo 的膜制剂中的总蛋白质。对于竞争性结合测定，将 100 μL 测定缓冲液添加到 96 孔 GF/B 过滤板中 10 分钟以预润湿过滤器，然后取出。然后添加以下试剂：20 μL 测定缓冲液、10 μL 化合物系列稀释液、20 μL 3H-Smo 拮抗剂（3 nM 最终浓度）和 50 μL 膜制剂（40 μg 总蛋白）。将板在室温下孵育2小时，然后洗涤并真空干燥。然后将板在 60°C 烘箱中干燥 1 小时，然后添加 45 μL Microscint 20，并在室温下孵育 30 分钟至 1 小时，然后在 TopCount 闪烁计数器中计数。使用 GraphPad Prism 软件分析数据。细胞测定：Gli-Luc/MEF 细胞在补充有 10% 热惰性 FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 0.55 mM β-巯基乙醇的敲除 DMEM 中生长，直至 90% 汇合。第 1 天，将细胞用胰蛋白酶消化并接种到白色 384 孔板中，每孔含有 20 μL OptiMEM 培养基，并补充有 1% 热惰性 FBS 和 1 mM 丙酮酸钠，浓度为每孔 7,500 个细胞。将板在 37°C 和 5% CO2 下孵育过夜。第 2 天，以 3 倍系列稀释将 PF-5274857 添加至细胞，终浓度范围为 3 μM 至 50 pM，然后添加重组小鼠 Sonic Hedgehog，终浓度为 2 μg/mL。将细胞与 PF-5274857 和 Shh 在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 48 小时。第 4 天使用 Bright-Glo 荧光素酶测定系统进行荧光素酶测定。简而言之，将 Bright-Glo 荧光素酶试剂 (25 μL) 添加到含有培养基的 384 孔板的每个孔中。将板在室温下放置 5 分钟，然后在发光板读数器上读数。计算 PF-5274857 的 IC50 值。

PF-5274857 显示出显着的剂量依赖性肿瘤生长抑制 (TGI)，并在高剂量 (>10 mg/kg) 下诱导肿瘤消退。PF-5274857 不同程度地下调 Gli1、Gli2、Ptch1 和 Ptch2 基因表达水平，最大程度降低给药后 6 至 12 小时内即可达到效果（Gli1 是最敏感的基因），而 PF-5274857 对 Smo 水平几乎没有影响。在皮肤组织中，PF-5274857 也在相似的时间过程中观察到 Gli1 和 Gli2 的下调。在 Ptch+/-p53+/- 髓母细胞瘤同种异体移植小鼠中，PF-5274857 对肿瘤 Gli1 mRNA 产生率 (IC50) 的半最大抑制的模型衍生药物浓度确定为 8.9 nM，这在数学上相当于肿瘤消退 119在此浓度下血浆暴露 6 天后的 % TGI。在 Ptch+/-p53−/− 髓母细胞瘤同种异体移植小鼠中，IC50 值估计为 3.5 nM，与 Ptch+/-p53+/- 结果一致。 PF-5274857 还能够在给药后 4 小时内穿过大鼠的血脑屏障。

在补充有 10% FBS、青霉素链球菌和 0.1 mg/mL 潮霉素的 Dulbecco 改良 Eagles 培养基 (DMEM) 中，过表达人 Smo（氨基酸 181-787）的 HEK293 细胞生长至 90% 汇合。将细胞沉淀重悬于膜制备缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，250 mM 蔗糖和 Roche 完全蛋白酶混合物）中，并在用冷 Dulbeccos PBS 洗涤后匀浆。离心匀浆后，将细胞沉淀重悬于测定缓冲液中，该缓冲液含有 0.1% 无蛋白酶牛血清白蛋白、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、25 mM MgCl2 和 1 mM EDTA。均质化过程在玻璃组织研磨机中进行。 Pierce BCA 蛋白质测定用于测定含有 Smo 的膜制剂中的总蛋白质。为了进行竞争性结合测定，将 96 孔 GF/B 过滤板用 100 μL 测定缓冲液预润湿 10 分钟，然后除去过滤器。之后，添加以下试剂：50 μL 膜制剂（40 μg 总蛋白）、10 μL 化合物连续稀释液、20 μL 3H-Smo 拮抗剂（3 nM 最终浓度）和 20 μL 测定缓冲液。室温孵育两小时后，清洁板并真空干燥。在 60°C 的烘箱中进行一小时的干燥过程后，将 45 μL Microscint 20 添加到板中，然后在室温下孵育 30 至 1 小时，然后使用 TopCount 闪烁计数器进行计数。名为 GraphPad Prism 的软件用于分析数据。

在生长过程中将含有 10% 热惰性 FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 0.55 mM β-巯基乙醇的敲除 DMEM 添加到 Gli-Luc/MEF 细胞中，直至 90% 汇合。第 1 天：使用每孔 20 μL OptiMEM 培养基，以每孔 7,500 个细胞的浓度将胰蛋白酶处理的细胞接种到白色 384 孔板中，并补充 1% 热惰性 FBS 和 1 mM 丙酮酸钠。过夜，将板在 37°C、5% CO2 下孵育。第 2 天，以 3 倍系列稀释，以 3 μM 至 50 pM 的终浓度添加 PF-5274857 后，将重组小鼠 Sonic Hedgehog 以 2 μg/mL 的终浓度添加到细胞中。将 PF-5274857 和 Shh 添加到细胞中，并在 37 °C、5% CO2 下孵育 48 小时。使用 Bright-Glo 荧光素酶测定系统进行第 4 天的荧光素酶测定。总之，将 25 μL Bright-Glo 荧光素酶试剂引入 384 孔板固定介质的每个孔中。室温储存五分钟后，使用发光板读数器读取板。计算 PF-5274857 的 IC50 值。

[1]. Effective targeting of Hedgehog signaling in a medulloblastoma model with PF-5274857, a potent and selective Smoothened antagonist that penetrates the blood-brain barrier. Mol Cancer Ther. 2012, 11(1), 57-65.

C20H25CLN4O3S

436.96

436.13

C, 54.98; H, 5.77; Cl, 8.11; N, 12.82; O, 10.98; S, 7.34

1373615-35-0

PF-5274857 hydrochloride; 1613439-62-5

Light yellow to yellow solid powder

CC1=CC(=C(N=C1)C2=CC(=NC=C2Cl)N3CCN(CC3)C(=O)CCS(=O)(=O)C)C

BBVNTTZIOTWDSV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H25ClN4O3S/c1-14-10-15(2)20(23-12-14)16-11-18(22-13-17(16)21)24-5-7-25(8-6-24)19(26)4-9-29(3,27)28/h10-13H,4-9H2,1-3H3

1-[4-[5-chloro-4-(3,5-dimethylpyridin-2-yl)pyridin-2-yl]piperazin-1-yl]-3-methylsulfonylpropan-1-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Solubility in Formulation 1: ≥ 2.08 mg/mL (4.76 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 20.8 mg/mL clear DMSO stock solution to 400 μL PEG300 and mix evenly; then add 50 μL Tween-80 to the above solution and mix evenly; then add 450 μL normal saline to adjust the volume to 1 mL.
Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH₂ O to obtain a clear solution.

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Solubility in Formulation 2: ≥ 2.08 mg/mL (4.76 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 20.8 mg/mL clear DMSO stock solution to 900 μL of 20% SBE-β-CD physiological saline solution and mix evenly.
Preparation of 20% SBE-β-CD in Saline (4°C，1 week): Dissolve 2 g SBE-β-CD in 10 mL saline to obtain a clear solution.

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Solubility in Formulation 3: ≥ 2.08 mg/mL (4.76 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 20.8 mg/mL clear DMSO stock solution to 900 μL of corn oil and mix evenly.

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Solubility in Formulation 4: Saline: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。