PK11007

PK11007 targets p53 by alkylating surface-exposed cysteines Cys182 and Cys277 in the DNA-binding domain (DBD) of p53, leading to protein stabilization. [1]
PK11007 acts on mutant p53 protein, converting it to a wild-type-like conformation as evidenced by increased PAb1620 (wild-type p53) staining and decreased PAb240 (mutant p53) staining. [2]

在 15 至 30 µM 的浓度范围内，用 PK11007（0-120 µM；24 小时；四种 p53 野生型细胞系和四种 p53 突变型细胞系）处理后，突变型 p53 细胞系 MKN1 (V143A)、HUH-7 (Y220C)、NUGC-3 (Y220C) 和 SW480 (R273H/P309S) 的活力显著降低。PK11007 主要引起不依赖于 caspase 的细胞死亡 [1]。在NUGC-3 (p53-Y220C)、HUH-7 (p53-Y220C)和MKN1 (p53-V143A)细胞中，PK11007（0-60 µM；3小时或6小时；NUGC-4、NUGC-3、MKN1、HUH-6和HUH-7癌细胞）处理以浓度依赖的方式上调p53靶基因p21、MDM2和p53 PUMA的蛋白水平。这表明不稳定的p53突变体的转录活性得到了部分恢复。HUH-6和NUGC-4细胞中MDM2、PUMA和p21蛋白水平的升高表明，PK11007也能增强这些细胞中p53的功能[1]。用PK11007（15–20 µM；4.5或6小时；MKN1、HUH-7、NUGC-3、HUH-6细胞）处理三种突变型p53细胞系后，p53靶基因的转录增加。用NOXA处理NUGC-3、MKN和HUH-7细胞以及NUGC-3和HUH-6细胞后，PUMA和p21 mRNA水平升高两倍。MKN1和NUGC-3细胞的MDM2水平降低了一半[1]。谷胱甘肽的消耗加剧了PK11007活性的下降。为了观察PK11007是否也会提高ROS水平，将PK11007与NUGC-3、NUGC-4、HUH-6、HUH-7和MKN1细胞孵育两小时。所有细胞系在两小时后均显示ROS水平升高。然而，在突变型p53细胞MKN1、HUH-7和NUGC-3中，60 µM PK11007处理后ROS水平的升高幅度高于NUGC-4和HUH-6细胞，表明突变型p53细胞系对PK11007更为敏感。ROS诱导的增加是由PK11007介导的。MKN1细胞的ROS水平至少是其他细胞系的两倍，无论是在基础水平还是PK11007诱导水平下[1]。 PK11007 具有重新激活突变 p53 的能力，能够抑制细胞生长、触发细胞凋亡并修饰与细胞死亡相关的基因 [2]。

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PK11007 (15-30 µM，24 小时) 可显著降低突变 p53 癌细胞系 MKN1 (V143A)、HUH-7 (Y220C)、NUGC-3 (Y220C) 和 SW480 (R273H/P309S) 的细胞活力，而 p53 野生型细胞系 HUH-6、NUGC-4 和成纤维细胞 WI-38 的敏感性较低（仅在 60-120 µM 时细胞活力降低）。 [1]
PK11007 (15-30 µM) 可在 3-6 小时内诱导 HUH-7 和 MKN1 细胞死亡，而 p53 野生型 HUH-6 细胞仅在 10 小时后才出现活力下降。[1]
PK11007 (15-20 µM) 可显著降低 H1299 (p53-/-) 和 H1299-p53 R175H 细胞以及同源 HCT116 p53-/- 细胞的活力，与 HCT116 p53 野生型细胞相比。在 HUH-6 和 HUH-7 细胞中敲低 p53 并不影响 PK11007 介导的活力下降，但在 MKN1 细胞中，敲低 p53 可在 15-20 µM 浓度下部分挽救细胞活力。 [1]
PK11007以浓度依赖的方式上调NUGC-3、HUH-7和MKN1细胞中p53靶基因p21、MDM2和PUMA的蛋白水平（处理3-6小时）。在突变型p53细胞系中，30-60 µM浓度下p53的分子量增加了约3 kDa，提示存在过度烷基化。[1]
PK11007（15-20 µM，6小时）使NUGC-3、MKN1和HUH-7细胞中PUMA和p21 mRNA水平增加约2倍；NOXA mRNA在MKN1和HUH-7细胞中增加。MDM2 mRNA在MKN1和NUGC-3细胞中降低了一半。在p53野生型HUH-6细胞中未观察到p53靶基因mRNA的显著变化。 [1]
PK11007激活了未折叠蛋白反应（UPR）：在HUH-7、MKN1细胞中，以及在较小程度上在HUH-6细胞中（处理3-6小时），XBP-1和CHOP剪接蛋白水平升高。[1]
PK11007（30-60 µM，6小时）并未显著激活HUH-6和HUH-7细胞中的caspase 3/7，但导致HUH-7细胞膜完整性受损。在SW480、SJSA-1和HCT116细胞中，PK11007轻微增加了caspase 3/7的活性（15-60 µM）。 [1]
PK11007 (15 µM) 与丁硫氨酸亚砜亚胺 (BSO, 100 µM，谷胱甘肽合成抑制剂) 联用可协同降低突变型 p53 细胞系 MKN1、HUH-7 和 NUGC-3 的细胞活力，但对野生型 HUH-6 和 NUGC-4 细胞无此作用。[1]
PK11007 (30-60 µM，2 小时) 可提高所有测试细胞系中的细胞内 ROS 水平；突变型 p53 细胞系 (MKN1、HUH-7 和 NUGC-3) 的 ROS 水平升高幅度高于野生型细胞系 (NUGC-4 和 HUH-6)。MKN1 细胞的 ROS 基础水平和诱导水平至少高出两倍。 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 可抑制 PK11007 介导的活性氧 (ROS) 增加。[1] PK11007 (2.5 µM，12 小时) 处理 HCC1143 细胞后，整体基因表达发生改变：390 个基因上调，234 个基因下调（RNA-seq，倍数变化 >1.4，校正后 p<0.05）。富集的 GO 条目包括细胞死亡调控、细胞凋亡调控、信号转导和蛋白质重折叠。[2] PK11007 (5 µM，48 小时) 可抑制 17 种乳腺癌细胞系的增殖，IC50 值范围为 2.3 至 42.2 µM。三阴性乳腺癌 (TNBC) 细胞系的 IC50 值显著低于非 TNBC 细胞系 (p=0.03)。 p53突变细胞系的IC50值低于p53野生型细胞系（p=0.003）。IC50值与p53蛋白水平呈负相关（Spearman r=0.59，p=0.01）。[2]在HCC1143、MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞中敲低p53（siRNA，40 nM）显著降低了PK11007（5 µM，48 h）的生长抑制作用，p53蛋白水平降低了79-89%。 [2]
PK11007（2.5-20 µM，24-72 小时）以时间和浓度依赖的方式诱导 p53 突变型 TNBC 细胞系 HCC1143 和 MDA-MB-468 发生凋亡，但在 p53 野生型 MCF-7 细胞中未观察到此现象。PK11007 以浓度依赖的方式（2.5-20 µM，24-48 小时）上调 HCC1143 和 MDA-MB-468 细胞中 PUMA、NOXA 和 p21 的 mRNA 和蛋白表达。 [2]
PK11007（25-50 µM，3 小时）可增强 SKBR3 细胞（p53 Arg175His）中野生型 p53 抗体 PAb1620 的染色，并降低突变型 p53 抗体 PAb240 的染色，表明突变型 p53 重折叠为野生型样构象。ELISA 检测的总 p53 蛋白水平未发生变化。[2]
PK11007 与顺铂联用在 MDA-MB-468 (CI=0.6) 和 BT549 (CI=0.8) 细胞系中显示出协同生长抑制作用，但在 HCC1143 (CI=1.3) 细胞系中未观察到此现象。与卡铂、多西他赛或艾立布林联用仅在所测试的三种 TNBC 细胞系中的一种中显示出协同作用；与阿霉素联用未显示出协同作用。 [2]

通过 1H-NMR 测定了 PK11000（一种相关化合物）与谷胱甘肽的反应动力学（二级速率常数为 1.37 L·mol⁻¹·s⁻¹）[1]

细胞活力检测[1]
细胞类型： p53 野生型细胞系（WI-38、HUH-6、NUGC-4、SJSA-1）和 p53 突变型细胞系（HUH-7、NUGC-3、SW480、MKN1），浓度范围为 15 至 30 µM，NUGC-3 (Y220C) 和 SW480 (R273H/P309S)，以及 p53 野生型细胞系 SJSA-1。p53 野生型癌细胞系 HUH-6、NUGC-4 和 WI-38 的敏感性较低，仅在化合物浓度较高（60 和 120 µM）时细胞活力才降低。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： NUGC-4、NUGC-3、MKN1、HUH-6 和 HUH-7 癌细胞
测试浓度： 0 μM、15 μM、30 μM、60 μM
孵育时间： 3 小时或 6 小时
实验结果： 在 NUGC-3 (p53-Y220C)、HUH-7 (p53-Y220C) 和 MKN1 (p53-V143A) 细胞中，p53 靶基因 p21、MDM2 和 PUMA 的蛋白水平呈浓度依赖性上调。 MDM2、PUMA 和 p21 蛋白水平的升高表明 HUH-6 和 NUGC-4 细胞中 p53 活性也增强。

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RT-PCR[1]
细胞类型：MKN1、HUH-7、NUGC-3、HUH-6 细胞
测试浓度：15 μM、20 μM 孵育

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细胞活力检测：将细胞以 7,500-15,000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，过夜培养，然后用 PK11007（终浓度 DMSO 0.5%）处理 24 小时（或指定时间）。使用 CellTiter-Fluor 细胞活力检测试剂盒（400/500 nm 荧光）或 CellTiter-Glo 2.0 检测试剂盒（发光法）检测细胞活力。实验重复四次。[1]
蛋白质印迹：将细胞接种于6孔板（0.5-0.8百万/孔），用PK11007处理3-6小时，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞。将蛋白（每泳道20 µg）在NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶上进行电泳分离，电转印至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭，与一抗（p53 DO-1、p21 187、PUMA ab9643、MDM2 2A10、CHOP sc-793、XBP-1 sc-7160、GSTP1 3F2C2、β-actin AC-15）于4℃孵育1小时或过夜，然后与HRP标记的二抗孵育，最后用ECL化学发光法检测。 [1]
实时荧光定量PCR：用PK11007（15-20 µM）处理细胞4.5-6小时，使用RNeasy Mini试剂盒提取总RNA，使用iScript cDNA合成试剂盒合成cDNA，在Rotor-Gene 6000实时荧光定量PCR仪上使用SYBR Green试剂盒进行实时荧光定量PCR。采用相对标准曲线法定量mRNA水平。所有样品均进行三次重复实验。[1]
p53基因敲低：使用INTERFERin转染试剂将细胞转染人特异性p53 siRNA（40 nM）或阴性对照siRNA 24小时，然后用PK11007（5-15 µM）处理24-48小时。通过Western blot验证基因敲低。使用CellTiter-Glo或MTT法检测细胞活力。 [1][2]
Caspase 3/7 活性和膜完整性：经 PK11007 处理 6 小时后，检测 caspase 活性和膜完整性丧失情况。未提供具体的试剂盒信息。[1]
ROS 检测：用 PK11007 (30-60 µM) 处理细胞 2 小时后，用 CellROX Deep Red 染料（ROS 氧化后发出荧光）染色，通过流式细胞术测定中值荧光强度，每个样品重复三次。 [1]
p53 构象的免疫荧光：将 SKBR3 细胞接种于 8 孔室载玻片上，用 PK11007 (25-50 µM) 处理 3 小时，用 1% 戊二醛固定，用 5% 山羊血清/0.1% Triton-X 封闭，用 PAb1620 (抗野生型 p53) 或 PAb240 (抗突变型 p53) 以 1:500 的比例染色过夜，然后用山羊抗大鼠二抗 (1:2000) 染色，用 Dapi 染色细胞核，通过荧光显微镜观察。 [2]
p53构象的流式细胞术分析：细胞用PK11007（25-50 µM）处理3小时，用0.5%多聚甲醛固定，透化并用10%山羊血清/0.1% Triton-X封闭，用PAb1620或PAb240（1:500）染色，再用二抗（1:2000）染色，用BD FACSCanto流式细胞仪进行分析。数据用FlowJo软件进行分析。[2]
Annexin V/PI凋亡检测：细胞接种于6孔板（2×10⁵/孔），在低血清（2% FBS）中用不同浓度的PK11007处理指定时间，用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒进行Annexin V-FITC和碘化丙啶染色，用BD FACSCalibur流式细胞仪进行分析。 [2] MTT 细胞增殖实验：将乳腺细胞系以 1×10³/孔的密度接种于 96 孔板中，用 PK11007 (0-50 µM) 处理 5 天，然后加入 0.5 mg/mL MTT 孵育 5 小时，再加入 DMSO，于 550 nm 波长处测定吸光度。使用 CalcuSyn 软件计算 IC50 值。所有实验均重复三次。[2] RNA-seq：将 HCC1143 细胞用 PK11007 (2.5 µM) 或 DMSO 对照处理 12 小时，每个处理重复三次。使用 RNeasy Mini Kit 和 MinElute Cleanup Kit 提取 RNA，使用 Illumina TruSeq stranded mRNA library prep kit 构建文库，并在 Illumina HiSeq 2500 测序仪上进行测序（51bp 单端测序）。使用 Subread 将 reads 比对至人类基因组版本 19，采用 TMM 方法进行标准化，使用 Limma 确定差异表达（校正后的 p<0.05，倍数变化 >1.4）。使用 goseq 进行 GO 分析。[2]

与癌细胞相比，PK11007 对正常细胞（成纤维细胞 WI-38）的细胞毒性较低；仅在高浓度（60-120 µM，24 小时）下才会降低细胞活力。[1] 在乳腺细胞系中，PK11007 在非三阴性乳腺癌 (TNBC) 细胞和 p53 野生型细胞中的 IC50 值较高，表明其对这些细胞系的毒性较低。[2]

[1]. 2-Sulfonylpyrimidines: Mild alkylating agents with anticancer activity toward p53-compromised cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Sep 6;113(36):E5271-80.

[2]. Mutant p53 as a therapeutic target for the treatment of triple-negative breast cancer: Preclinical investigation with the anti-p53 drug, PK11007. Cancer Lett. 2018 Feb 1;414:99-106.

PK11007 通过多种机制发挥抗癌作用：(1) 通过选择性烷基化 Cys182 和 Cys277，稳定并重新激活突变型 p53，且不影响其 DNA 结合亲和力；(2) 耗竭细胞内谷胱甘肽，并将活性氧 (ROS) 水平提高至毒性水平；(3) 诱导内质网 (ER) 应激和未折叠蛋白反应 (UPR)，表现为剪接型 XBP-1 和 CHOP 的增加。[1] PK11007 对 p53 功能受损的癌细胞（突变型或缺失型 p53）的杀伤作用强于对 p53 野生型细胞的杀伤作用。该化合物对三阴性乳腺癌 (TNBC) 细胞系具有选择性，而 TNBC 细胞系通常携带 p53 突变。疗效与 p53 蛋白水平和突变状态相关。 [1][2]
PK11007 可诱导高度敏感细胞系（例如 HUH-7、MKN1）发生不依赖于 caspase 的细胞死亡，而诱导其他细胞系（例如 SJSA-1、SW480）发生依赖于 caspase 的细胞凋亡。[1]
PK11007 可上调 p53 靶基因（PUMA、p21、NOXA）的 mRNA 和蛋白水平，部分恢复不稳定 p53 突变体的转录活性。[1][2]
PK11007 可将突变型 p53 的构象从突变体（PAb240 阳性）转变为野生型样（PAb1620 阳性）形式，而不改变 p53 总蛋白水平。 [2]
PK11007与顺铂联合使用，对某些三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-468、BT549）显示出协同生长抑制作用。[2]

C15H11CLFN5O3S2

427.86094212532

427

C, 42.11; H, 2.59; Cl, 8.29; F, 4.44; N, 16.37; O, 11.22; S, 14.99

874146-69-7

16446482

White to off-white solid powder

2.3

151

1

9

5

27

629

0

CC1=NN=C(S1)NC(=O)C2=NC(=NC=C2Cl)S(=O)(=O)CC3=CC=C(C=C3)F

IVZQUWCWXYFPOQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H11ClFN5O3S2/c1-8-21-22-14(26-8)20-13(23)12-11(16)6-18-15(19-12)27(24,25)7-9-2-4-10(17)5-3-9/h2-6H,7H2,1H3,(H,20,22,23)

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。