DY131 (GSK-9089)

ERRγ; ERRβ; DY131 selectively targets estrogen-related receptors ERRβ and ERRγ. It exhibits no significant agonistic activity on ERRα, ERα, or ERβ . The compound demonstrates an EC50 of approximately 130 nM for ERRβ/γ activation . Additionally, DY131 also inhibits Smo (Smoothened) signaling, with an IC50 of 0.8 μM for inhibiting Shh-induced Smo::EGFP accumulation, and approximately 2 μM for inhibiting SAG-induced Gli transcriptional activity in primary cilia .
DY131 is a selective agonist ligand for estrogen-related receptors ERRβ/γ; it has no effect on ERRα, estrogen receptors α and β (ERα/β) [1]
DY131 exerts antimitotic effects in breast cancer cells via ERRβ2 splice variant [2]

DY131 是 ERRβ/γ 特有的配体，在较低浓度下对 ERRγ 表现出优先选择性。相关受体 ERα、ERβ 和 ERRα 不受其影响 [1]。在多种乳腺癌细胞系中，DY131 抑制生长，导致双峰细胞周期停滞，并且 p38 应激激酶途径参与细胞死亡。 DY131 推迟从前期到后期的转变，而 ERRβ2 则促进 G2/M 期的阻断。有丝分裂纺锤体缺陷是由 DY131 处理引起的，导致多极和单极纺锤体的出现。 ERRβ2（一种也定位于中心体的胞质蛋白）也参与其中[2]。

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1. DY131可有效且选择性激活ERRβ/γ，对结构相关的ERRα、ERα、ERβ无激动或拮抗作用 [1]
2. DY131浓度依赖性抑制多种乳腺癌细胞系（包括MDA-MB-231、MCF7、HCC1806）的生长，对非转化乳腺上皮细胞系的作用未明确；结晶紫染色证实其随时间延长抑制细胞生长（n=6，双因素方差分析+Bonferroni事后检验，第10/11天与DMSO对照组相比差异显著） [2]
3. DY131诱导乳腺癌细胞凋亡：流式细胞术显示，暴露24 h后亚G1期DNA含量（碎片化DNA）增加（n=3–5，单因素方差分析+Tukey事后检验）；Annexin V/PI染色证实处理12–24 h后凋亡细胞比例呈剂量依赖性升高（n=3–5，单因素方差分析+Tukey事后检验）；Western blot检测到PARP剪切和γH2AX上调（阿霉素为阳性对照） [2]
4. DY131诱导乳腺癌细胞双相细胞周期阻滞（G1期和G2/M期）：流式细胞术显示，暴露24 h后G1、S、G2/M期分布显著改变（n=3–5，单因素方差分析+Tukey事后检验）；Western blot证实p21上调及组蛋白H3（Ser10）磷酸化 [2]
5. DY131诱导的细胞死亡依赖p38 MAPK激活：Western blot检测到处理后细胞中磷酸化p38（p-p38）增加（密度分析：n=3，单因素方差分析+Tukey事后检验）；预先用p38抑制剂SB203580处理可消除DY131诱导的亚G1期DNA含量升高（n=3，双因素方差分析+Bonferroni事后检验），但不影响G2/M期阻滞 [2]
6. ERRβ2促进DY131诱导的G2/M期阻滞：MCF7细胞瞬时转染ERRβ2 cDNA后，DY131介导的组蛋白H3（Ser10）磷酸化增强；DY131延迟稳定表达GFP-H2B的MCF7细胞从前期到后期的进程（n=4–11个细胞，单因素方差分析+Tukey事后检验） [2]
7. DY131导致乳腺癌细胞（HCC1806、MDA-MB-231）有丝分裂纺锤体缺陷：γ-微管蛋白/β-微管蛋白/DAPI免疫染色显示，5 μM DY131处理24 h后单极和多极纺锤体比例增加（n=3，卡方检验） [2]
8. DY131不诱导常规DNA损伤应答，也不直接结合DNA：Western blot显示ATM信号通路未激活；表面等离子体共振（BIAcore）证实DY131不结合双链DNA（dsDNA）或单链DNA（ssDNA）（米托蒽醌为阳性对照，实验重复两次） [2]
9. DY131对乳腺癌细胞中ERRβ2无转录因子活性：荧光素酶报告基因实验（ERRE-荧光素酶）显示，MDA-MB-231/MCF7细胞经DY131处理后荧光素酶活性无显著变化（n=3，双因素方差分析+Bonferroni事后检验） [2]
10. 集落形成存活实验：MCF7和MDA-MB-231细胞暴露于DY131 24 h后，培养13 d的集落形成能力下降（无具体IC50报道） [2]

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DY131 (0.1-30 μM；5天) 处理以剂量依赖性方式抑制 LNCaP-ERRγ 和 LNCaP 细胞中的细胞增殖并减少 BrdUrd 阳性细胞，对 LNCaP-ERRγ 克隆具有更强的抑制作用 。在乳腺癌细胞系中，10 μM DY131 可完全抑制所有细胞系的生长，而 5 μM DY131 可显著抑制 MCF7 和 MDA-MB-231 细胞 。在克隆形成存活实验中，MDA-MB-231 细胞在单次暴露于 DY131 24 小时后，集落形成呈剂量依赖性减少 。此外，所有乳腺癌细胞系的 subG1 期细胞比例均呈显著的剂量依赖性增加，表明诱导细胞凋亡 。在 ECa109 和 TE1 细胞中，DY131 (10 μM；48小时) 抑制细胞增殖和糖酵解活性 。在胎盘绒毛外植体中，DY131 (20 μM 或 50 μM；48小时) 增加 ESRRG 信号通路的表达，并防止缺氧诱导的异常细胞更新 。

在雄性 C57BL/6 小鼠（8-10 周龄；约 24.3 克）的研究中，DY131（5 μg/kg；皮下注射；隔日一次，持续 12 天）治疗增加了 P450 侧链裂解酶、类固醇生成急性调节蛋白和 HMG-CoA 还原酶的表达，同时降低了激素敏感性脂肪酶的表达 。在大鼠蛛网膜下腔出血模型中，DY131（6 mg/kg；腹腔注射；SAH 后 1 小时给药，并在第 2 天和第 3 天追加剂量）显著改善了神经功能缺损，减少了氧化应激和神经元凋亡 。在 LPS 诱导的急性肝损伤小鼠模型中，DY131 预处理（5 mg/kg/天；腹腔注射；每日一次，连续 3 天）改善了肝损伤、氧化应激、炎症和细胞凋亡 。在食管鳞状细胞癌异种移植模型中，DY131（80 mg/kg；腹腔注射；每 2 天一次，持续 25 天）抑制了肿瘤生长并增强了抗 PD-1 治疗的疗效 。

1. 受体激活实验（ERRβ/γ、ERRα、ERα/β）：将受体cDNA和相关报告基因载体转染至细胞，随后用DY131（浓度未明确）或DMSO对照处理18–20 h；检测荧光素酶活性以评估受体激活情况，以GSK4716为参考化合物（n=3，双因素方差分析+Bonferroni事后检验） [1,2]
2. 表面等离子体共振（BIAcore）实验：将DY131、GSK4716或米托蒽醌（阳性对照）注射至固定有dsDNA/ssDNA的传感器芯片；记录60 s注射后的峰值相对单位（RU）值，评估直接DNA结合能力（实验重复两次，未检测到DY131的结合） [2]

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该化合物的代谢特征已通过使用肝微粒体和大鼠/人 S9 组分进行体外孵育进行评估。这些孵育后通过高分辨率质谱分析来鉴定和表征代谢物。共鉴定出 GSK-9089 的 9 种未知代谢物，大多数 I 相代谢物是在亚胺键水解后经脱酰胺、氧化和 N-氧化反应形成。该化合物通过 II 相代谢生成更多极性代谢物，主要通过葡萄糖醛酸化和硫酸化结合生物转化反应 。

在 12 孔塑料组织培养皿的四个孔中，第 0 天每孔接种 150 个 (MDA-MB-231) 或 200 个 (MCF7) 个细胞。第二天，用 18-24 小时在指定的位置添加 DY131浓度。第 2 天包括去除含有药物的培养基，用 1X PBS 清洁孔，并向其中添加不含药物的新培养基。再进行 13 天的无药物培养并更换两次培养基后，用结晶紫溶液对细胞进行染色。

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1. 细胞生长实验（结晶紫染色）：将乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF7、HCC1806）和非转化乳腺上皮细胞系在不同浓度DY131或DMSO对照下培养至多10/11天；固定细胞并进行结晶紫染色，通过染色强度定量评估细胞生长情况（n=6，双因素方差分析+Bonferroni事后检验） [2]
2. 凋亡实验（流式细胞术）：乳腺癌细胞经DY131处理24 h后固定，用碘化丙啶（PI）染色检测亚G1期DNA含量（碎片化DNA）；对于活细胞凋亡检测，用Annexin V/PI染色并通过流式细胞术分析（n=3–5，单因素方差分析+Tukey事后检验） [2]
3. Western blot实验：将DY131处理24 h的细胞裂解，提取蛋白并检测PARP、γH2AX、总H2AX、p21、磷酸化/总p38、磷酸化/总组蛋白H3（Ser10）、ERRβ2、ERRβsf、ERRγ；对p-p38/总p38比值进行密度分析（归一化至β-肌动蛋白，n=3，单因素方差分析+Tukey事后检验） [2]
4. 细胞周期实验（流式细胞术）：DY131处理24 h的乳腺癌细胞固定后用PI染色，分析细胞周期相分布（G1、S、G2/M）；数据归一化至DMSO对照组（n=3–5，单因素方差分析+Tukey事后检验） [2]
5. 集落形成存活实验：将MCF7和MDA-MB-231细胞低密度接种，暴露于DY131 24 h后培养13天；计数集落数评估集落形成存活能力 [2]
6. 活细胞共聚焦显微镜实验：将稳定表达GFP-H2B的MCF7细胞用诺考达唑阻滞于G2期，随后释放至DY131或DMSO对照中；定量从染色质凝集（前期）到后期的时间（n=4–11个细胞，单因素方差分析+Tukey事后检验） [2]
7. 免疫荧光染色：HCC1806/MDA-MB-231细胞经5 μM DY131处理24 h后固定，染色γ-微管蛋白（中心体标志物）、β-微管蛋白（有丝分裂纺锤体）和DAPI（DNA）；评分纺锤体形态（单极/双极/多极）（n=3，卡方检验） [2]
8. 亚细胞分离实验（REAP法）：将HCC1806细胞分离为总细胞裂解液（TCL）、核组分（nuc）和胞质组分（cyto）；通过Western blot检测ERRβ2、ERRβsf、纽蛋白（胞质标志物）、组蛋白H3（核标志物）的亚细胞定位 [2]
9. 荧光素酶报告基因实验：将启动子-报告基因荧光素酶载体（ERRE-荧光素酶）和受体cDNA（ERRβ2、ERRβsf、AIB1）瞬时共转染至MDA-MB-231/MCF7细胞；用DY131、GSK4716或DMSO处理18–20 h后检测荧光素酶活性（n=3，双因素方差分析+Bonferroni事后检验） [2]

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在细胞增殖实验中，LNCaP-ERRγ 和 LNCaP 细胞用 0.1、1、10 和 30 μM 的 DY131 处理 5 天。通过 BrdUrd 掺入实验评估细胞增殖，并对 BrdUrd 阳性细胞进行计数 。在乳腺癌细胞研究中，MCF7、MDA-MB-231 和 MDA-MB-468 细胞用不同浓度的 DY131 处理特定时间，随后通过流式细胞术评估细胞活力、克隆形成存活和 subG1 期细胞比例 。在 ECa109 和 TE1 细胞中，DY131 (10 μM) 处理 48 小时以评估细胞增殖和糖酵解活性 。在原代皮层神经元中，DY131 以 10 μM 的浓度处理 24、48 或 72 小时，以评估其对血红蛋白诱导的神经元毒性的保护作用 。

小鼠研究（类固醇生成基因表达）：雄性 C57BL/6 小鼠（8-10 周龄；约 24.3 克）通过皮下注射 DY131（5 μg/kg），隔日一次，持续 12 天 。大鼠研究（蛛网膜下腔出血）：Sprague-Dawley 大鼠建立蛛网膜下腔出血模型，DY131（6 mg/kg）在 SAH 后 1 小时通过腹腔注射给药，并在 SAH 后第 2 天和第 3 天追加剂量 。小鼠研究（急性肝损伤）：C57BL/6J 小鼠在 LPS 攻击前通过腹腔注射 DY131（5 mg/kg/天）预处理，每日一次，连续 3 天 。小鼠研究（异种移植肿瘤）：BALB/c 裸鼠接种 ESCC 异种移植瘤后，通过腹腔注射 DY131（80 mg/kg），每 2 天一次，持续 25 天，以评估肿瘤生长抑制和抗 PD-1 治疗的增效作用 。

DY131 (GSK-9089) 的分子量为 311.38 g/mol，分子式为 C18H21N3O2 。该化合物可溶于 DMSO（高达 30 mg/ml）和乙醇（加热下高达 8 mg/ml）。在研究储存中，建议将储备液保存在 -20°C 条件下，可稳定保存长达 2 年 。粉末形式的化合物可在 -20°C 下保存长达 2 年 。使用肝微粒体和 S9 组分的代谢研究表明，DY131 通过亚胺键水解、脱酰胺、氧化和 N-氧化反应进行 I 相代谢，并通过葡萄糖醛酸化和硫酸化结合进行 II 相代谢。在大鼠生物样品（血浆、尿液、粪便）中已鉴定出 9 种代谢物，但这些代谢物在体内仅以微量存在 。

据报道 DY131 可抑制破骨细胞生成，并在体内保护免受 LPS 诱导的炎性骨丢失 。在神经元保护研究中，DY131 在原代皮层神经元培养中显著减少神经元凋亡和氧化应激，未观察到明显毒性 。在 LPS 诱导的急性肝损伤研究中，DY131 预处理改善了肝损伤，未报告不良反应 。在异种移植肿瘤研究中，DY131 以 80 mg/kg 的剂量（腹腔注射，每 2 天一次，持续 25 天）给药，耐受性良好，未观察到明显毒性。关于 LD50、特定器官毒性或临床安全性数据的详细信息在当前文献中不可用。

[1]. Bioorg Med Chem Lett. 2005 Mar 1;15(5):1311-3.

[2]. Oncotarget . 2016 Jul 26;7(30):47201-47220.

DY131 是苯甲酸类化合物。

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1. DY131 (N'-{(1E)-[4-(二乙氨基)苯基]亚甲基}-4-羟基苯甲酰肼) 是一种腙类化合物，其一个苯环上连接有 4-羟基，另一个苯环上连接有 4-二乙氨基；它是一种新型且选择性的药理学工具，可用于研究ERRβ/γ的生物活性[1]
2. DY131通过靶向ERRβ2剪接变体，在乳腺癌（包括三阴性乳腺癌，TNBC）中发挥抗有丝分裂活性：ERRβ2定位于中心体，DY131导致有丝分裂纺锤体缺陷并延迟染色体分离（从前期到后期）[2]
3. DY131诱导的乳腺癌细胞死亡是由p38应激激酶通路介导的，而细胞周期阻滞（G2/M期）与p38 MAPK无关[2]
4. ERRβ2在乳腺癌细胞中没有转录因子活性，DY131并非通过ERRβ2的转录调控发挥作用[2]
5. DY131不会诱导DNA损伤或直接与DNA结合，这使其作用机制区别于传统的DNA靶向化疗药物（例如，阿霉素、米托蒽醌）[2]

C18H21N3O2

311.38

311.163

C, 69.43; H, 6.80; N, 13.49; O, 10.28

95167-41-2

5497124

Light yellow to green yellow solid powder

1.1±0.1 g/cm3

1.574

3.17

64.93

2

4

6

23

380

0

O=C(C1C=CC(O)=CC=1)NN=CC1C=CC(N(CC)CC)=CC=1

WLKOCYWYAWBGKY-CPNJWEJPSA-N

InChI=1S/C18H21N3O2/c1-3-21(4-2)16-9-5-14(6-10-16)13-19-20-18(23)15-7-11-17(22)12-8-15/h5-13,22H,3-4H2,1-2H3,(H,20,23)/b19-13+

N-[(E)-[4-(diethylamino)phenyl]methylideneamino]-4-hydroxybenzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~10 mM
Water: 1 mg/mL (Insoluble)
Ethanol: 1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.03 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.03 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.03 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。