3-Oxo-5β-cholanoic acid (Dehydrolithocholic acid; 3-oxoLCA)   中文名称: 3-氧代-5β-胆酸

Bile acid metabolite; RORγt (Kd = 1.13 μM)

用 3-Oxo-5β-胆烷酸处理后，RORγt 报告基因的活性显着降低。正如这些数据所表明的，TH17 细胞分化可能是通过与 RORγt 发生物理相互作用并抑制其转录活性而被 3-Oxo-5β-胆烷酸抑制的[1]。

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胆汁酸在哺乳动物肠道中含量丰富，经细菌介导转化后可产生大量生物活性分子。虽然已知胆汁酸会影响宿主代谢、癌症进展和先天免疫，但其是否会影响适应性免疫细胞（如表达IL-17a的辅助性T细胞（TH17细胞）或调节性T细胞（Treg细胞））尚不清楚。本研究通过筛选胆汁酸代谢物库，鉴定出石胆酸（LCA）的两种独特衍生物——3-氧代-5β-胆烷酸/3-氧代石胆酸/3-oxoLCA和异别石胆酸/isoalloLCA可作为小鼠T细胞调节剂。3-oxoLCA通过直接结合关键转录因子视黄酸相关孤儿受体γt（RORγt）抑制TH17细胞分化，而isoalloLCA则通过产生线粒体活性氧（mitoROS）促进Treg细胞分化，进而增加FOXP3表达。isoalloLCA介导的Treg细胞分化增强需要Foxp3基因内含子增强子——保守非编码序列（CNS）3的参与，这与之前发现的依赖CNS1的代谢物作用机制截然不同。[1]

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3-oxoLCA/3-氧代-5β-胆烷酸/3-氧代石胆酸抑制Th17细胞分化[1] 我们进一步通过微量热泳动实验（MST）检测3-oxoLCA与重组人源RORγt配体结合域（LBD）的体外相互作用。结果显示3-oxoLCA与RORγt LBD具有强效结合能力，平衡解离常数（Kd）约为1 μM。对比测试的两种结构相似胆汁酸衍生物——3-氧代胆酸（3-oxoCA）和3-氧代脱氧胆酸（3-oxoDCA）（图2a）的Kd值比3-oxoLCA高约20倍（图2b），且两者对Th17细胞分化的抑制效果均显著弱于3-oxoLCA（图2c,d）。在人胚肾（HEK）293细胞中采用RORγt-Gal4-DBD（DNA结合域）融合蛋白报告系统检测发现，特异性RORγt拮抗剂ML209可完全抑制RORγt活性，而3-oxoLCA处理也显著降低RORγt报告基因活性（图2e）。这些数据表明3-oxoLCA可能通过直接结合RORγt并抑制其转录活性来阻断Th17细胞分化。

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3-oxoLCA/3-氧代-5β-胆烷酸/3-氧代石胆酸对Th17细胞和异别石胆酸/isoalloLCA对Tregs的调节作用具有细胞类型特异性——通过检测细胞因子IFN-γ、IL-4及转录因子T-bet、GATA3的表达证实，两者均不影响Th1或Th2细胞分化（图1a,b及扩展数据图3f,g）。虽然3-oxoLCA不影响Tregs（图1b及扩展数据图2e），但isoalloLCA在不改变RORγt表达的情况下使Th17细胞分化减少约50%（图1a,b及扩展数据图3h）。两种化合物均呈现剂量依赖性效应（扩展数据图4a）。3-oxoLCA不影响细胞增殖，而isoalloLCA处理的T细胞增殖率较DMSO对照组降低（扩展数据图4b）。isoalloLCA处理既不影响细胞活力（扩展数据图4c），也不改变T细胞受体（TCR）介导的活化状态（CD25、CD69、Nur77和CD44等TCR活化标志物表达水平相似）（扩展数据图4d）。增强TCR活化可协同isoalloLCA促进Treg分化——提高抗CD3抗体浓度能在不影响细胞活力的情况下更显著增强FoxP3表达（扩展数据图4e,f）。[1]

3-Oxo-5β-cholanoic Acid（脱氢石胆酸）（0.3%（w/w）；口服；持续 1 周）可显着降低回肠中 TH17 细胞的百分比[1]。

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胆汁酸在体内调控T细胞活性[1] 研究人员通过小鼠模型探究3-氧代-5β-胆烷酸/3-氧代石胆酸/3-oxoLCA与异别石胆酸/isoalloLCA对体内Th17和Treg细胞分化的影响。分段丝状菌(SFB)作为小鼠共生菌，已知可诱导B6小鼠小肠Th17细胞分化41。Taconic Biosciences(Tac)的C57BL/6NTac小鼠因携带SFB，其小肠中存在大量Th17细胞；而Jackson Laboratories(Jax)的C57BL/6J小鼠缺乏SFB，肠道Th17细胞极少。为验证3-oxoLCA是否抑制体内Th17分化，研究者对Jax-B6小鼠灌胃SFB菌液，并分别喂食对照饲料或含0.3%(w/w)3-oxoLCA饲料一周(图4a)。该处理使盲肠内容物中3-oxoLCA平均浓度达24皮摩尔/毫克湿重(约μM级)(扩展数据图7a,b)，该浓度在体外已能有效抑制Th17分化(图1c)。实验证实，3-oxoLCA处理显著降低回肠Th17细胞比例(图4b)。对人溃疡性结肠炎患者粪便及常规饲养小鼠盲肠的检测显示，3-oxoLCA平均浓度分别为23和1.0皮摩尔/毫克(扩展数据图7c,d)。对照组与3-oxoLCA处理组的SFB定植水平相当，表明Th17细胞比例变化非由SFB减少所致(扩展数据图7e)。此外，预先携带SFB的Tac-B6小鼠经3-oxoLCA喂养后，其Th17细胞比例较溶剂对照组显著降低(扩展数据图7f-h)，但Treg比例未受影响(扩展数据图7i)。即使在抗CD3抗体诱导的肠道炎症模型中(该模型可强烈激活Th17反应18,42)，1%(而非0.3%)3-oxoLCA处理仍能降低Th17水平(扩展数据图7j-l)。

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为探究异别石胆酸/isoalloLCA对体内Treg的影响，研究者给SFB定植的B6小鼠喂食含0.03%(w/w)isoalloLCA的饲料。结果显示，无论在稳态条件下(扩展数据图7m)或抗CD3处理后(扩展数据图7n)，单独使用isoalloLCA均不足以提升Treg比例。值得注意的是，体外实验中3-oxoLCA可增强isoalloLCA诱导的Treg分化(扩展数据图7o,p)。与此一致，0.3%(w/w)3-氧代-5β-胆烷酸/3-氧代石胆酸/3-oxoLCA与0.03%(w/w)isoalloLCA联合喂养时，抗CD3处理小鼠的Treg群体较对照组显著扩增(图4c,d)。该处理使回肠固有层CD4+T细胞线粒体活性氧(mitoROS)产量增加(扩展数据图7q)，与体外机制相符。关键的是，3-oxoLCA/isoalloLCA诱导的FoxP3表达增强依赖于CNS3增强子——骨髓混合移植实验显示，ΔCNS3基因型细胞对此处理无反应(图4e,f)。联合喂养使盲肠内容物isoalloLCA平均浓度达47皮摩尔/毫克(扩展数据图7b)，该浓度在体外足以促进Treg分化(图1c)。人溃疡性结肠炎患者粪便中isoalloLCA平均浓度为2皮摩尔/毫克(范围0-17皮摩尔/毫克)(扩展数据图7c)，与小鼠实验达到的生理浓度处于同一数量级[1]。

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进一步研究发现，3-氧代-5β-胆烷酸/3-氧代石胆酸/3-oxoLCA与异别石胆酸/isoalloLCA的免疫调节作用并非通过改变肠道菌群组成实现。16S rDNA测序显示，胆汁酸饲料喂养小鼠的粪便菌群与对照组无显著差异(扩展数据图8a-e)。此外，3-oxoLCA处理仍能降低无菌B6小鼠感染啮齿柠檬酸杆菌后的结肠Th17细胞诱导(扩展数据图8f,g)。这些证据表明，3-oxoLCA与isoalloLCA对Th17和Treg的调控不依赖于共生菌群存在。综上，本研究证实这两种胆汁酸衍生物可直接调控小鼠体内Th17与Treg细胞应答[1]。

哺乳动物萤光素酶报告基因测定[1]
如前所述进行报告测定14。简言之，在含有1%胎牛血清（FCS）的不含抗生素的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中，将每个孔50000个人胚胎肾293细胞接种在96孔板中。用含有0.5μg/mL萤火虫萤光素酶报告质粒、2.5 ng/mL含有雷尼拉萤光素酶的质粒和Gal4 DNA结合结构域RORγ（0.2μg/mL）的DNA混合物转染细胞。根据制造商的说明，使用TransIT-293进行转染。转染后24小时加入胆汁酸或载体对照，16小时后使用双荧光素酶报告试剂盒测量荧光素酶类活性

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微型热电泳测定[1]
用微尺度热泳分析了这些化合物与RORγ配体结合域（LBD）的结合亲和力。纯化的RORγ-LBD用Monolith NT™蛋白质标记试剂盒RED标记。将浓度为1mM至20nM的系列稀释化合物与55nM标记的RORβ-LBD在室温下混合，并加载到Monolith TM标准处理的毛细管中。通过在Monolith NT.115仪器上监测具有20%LED功率和“中等”MST功率的热泳来测量结合，时间设置如下：5秒Fluo，之前；20s MST打开；和5秒Fluo，之后。使用NT分析软件（Nano Temper Technologies）拟合Kd值。

体外T细胞培养[1]
通过FACS分选从指定基因型小鼠的脾脏和淋巴结中分离出幼稚CD4+（CD62L+CD44−CD25−CD4+）T细胞。对于某些实验，使用幼稚的CD4+T细胞分离试剂盒富集幼稚的CD4+T细胞。将幼稚CD4+T细胞（40000个细胞）在96孔板中培养，该板预涂有仓鼠IgG的T细胞培养基（RPMI，10%胎牛血清，25mM谷氨酰胺，55µM 2-巯基乙醇，100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素），补充有0.25µg/mL抗CD3（克隆145–2C11）和1µg/mL反CD28（克隆37.51）。对于Th0培养，在添加100U/mL IL-2的情况下培养T细胞。对于Th1细胞分化，在添加100U/mL IL-2、10µg/mL抗IL-4（克隆11B11）和10ng/mL IL-12的情况下培养T细胞。对于Th2细胞分化，在添加10µg/mL抗IFNγ（克隆XMG1.2）和10 ng/mL IL-4的情况下培养T细胞。对于Th17细胞分化，在添加10ng/mL IL-6和0.5ng/mL TGF-β的情况下培养T细胞。对于Treg培养，在添加100U/mL IL-2和不同浓度的TGF-β的情况下培养T细胞。对于大多数测试异alloLCA效果的体外实验，没有添加额外的TGF-β。在0或16h时间点加入胆汁酸、视黄酸或mitoQ或mitoPQ。在将具有低水溶性的化合物加入培养物之前对其进行超声处理。在第3天收获细胞并通过流式细胞术进行测定。对于ROS和线粒体膜电位检测，将培养2天的细胞与5µM的mitoSOX、10µM的DCFDA或2µM的JC-1孵育30分钟，并用流式细胞术进行分析。

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流式细胞术[1]
在GolgiPlug存在下，用50 ng/mL PMA（Phorbol 12肉豆蔻酸13乙酸酯）和1µM离子霉素刺激从体外培养或体内小鼠实验中收获的细胞4小时，以测定细胞因子表达。刺激后，用细胞表面标记抗体和LIVE/DEAD固定染料Aqua对细胞进行染色，以排除死细胞，用FoxP3/转录因子染色试剂盒固定并透化，然后用细胞因子和/或转录因子特异性抗体染色。所有流式细胞术分析均在LSR-II流式细胞仪上进行，并用FlowJo软件分析数据）

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细胞增殖测定[1]
用1µM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记幼稚CD4+T细胞，并在FACS分析前培养3天

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体外抑制试验[1]
用1µM CFSE标记来自CD45.1 B6小鼠的总共2.5×104个新鲜纯化的幼稚CD4+CD25−CD44−CD62L高T细胞，在96孔圆形底板中用可溶性抗CD3（1µg/mL）和5×104 APC活化，在测试细胞（CD45.2）存在的情况下持续3天。通过流式细胞术评估CD45.1 Tconv细胞的CFSE稀释度。

Animal/Disease Models: B6 Jax mice (with a faecal slurry containing SFB)[1]
Doses: 0.3% (w/w)
Route of Administration: Gavaged; for 1 week
Experimental Results: Dramatically decreased the percentage of ileal TH17 cells.

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In vivo bile acid analysis[1]
Stock solutions of all bile acids were prepared by dissolving the compounds in molecular biology grade DMSO. These solutions were used to establish standard curves. Glycocholic acid or β-muricholic acid (β-MCA) was used as the internal standard for mouse and human samples, respectively. Bile acids were extracted from mouse cecal and human fecal samples and quantified by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS) as previously reported. The limits of detection of individual bile acids in tissues (in picomol/mg wet mass) are as follows: βMCA, 0.10; isoalloLCA, 0.45; isoLCA, 0.29; LCA, 0.12; alloLCA, 0.43; and 3-oxoLCA, 0.18.

[1]. Bile acid metabolites control TH17 and Treg cell differentiation. Nature. 2019 Dec;576(7785):143-148.

3-oxo-5beta-cholanic acid is an oxo-5beta-cholanic acid. It is a conjugate acid of a 3-oxo-5beta-cholanate.

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Certain bile acids are thought to be tissue-damaging agents that promote inflammation due to their enhanced accumulation in patients with liver diseases and their chemical properties as detergents that disrupt cellular membranes. Recent studies, however, have begun to reveal their anti-inflammatory roles, particularly in the innate immune system by suppressing NF-κB-dependent signaling pathways and by inhibiting NLRP3-dependent inflammasome activities. Our studies reveal additional anti-inflammatory roles of two LCA metabolites found in both humans and rodents that directly affect CD4+ T cells: 3-oxoLCA suppresses Th17 differentiation while isoalloLCA enhances Treg differentiation. Our data suggest that both 3-oxoLCA and isoalloLCA are present in the stool samples of human colitis patients as well as in the ceca of conventionally-housed Jax-B6 mice (Extended Data Fig. 7c, d). Importantly, both bile acids are completely absent in germ-free B6 mice (Extended Data Fig. 7d). These data suggest that gut-residing bacteria may contribute to the production of 3-oxoLCA and isoalloLCA, although we cannot rule out the possibility that host enzymes are involved. Given the significant roles of Th17 and Treg cells in a wide variety of inflammatory diseases and their close relationship with gut-residing bacteria, our study suggests the existence of novel modulatory pathways that regulate T cell function through bile acid metabolites. Future studies to elucidate the bacteria or host enzymes that generate 3-oxoLCA and isoalloLCA will provide novel means for controlling T cell function in the context of autoimmune diseases and other inflammatory conditions.[1]

C24H38O3

374.55672

374.282

1553-56-6

5283906

White to off-white solid powder

1.069 g/cm3

509.3ºC

275.9ºC

0mmHg at 25°C

1.52

5.715

54.37

1

3

4

27

613

8

OC(CC[C@H]([C@H]1CC[C@H]2[C@@H]3CCC4CC(CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)=O)C)=O

KIQFUORWRVZTHT-OPTMKGCMSA-N

InChI=1S/C24H38O3/c1-15(4-9-22(26)27)19-7-8-20-18-6-5-16-14-17(25)10-12-23(16,2)21(18)11-13-24(19,20)3/h15-16,18-21H,4-14H2,1-3H3,(H,26,27)/t15-,16-,18+,19-,20+,21+,23+,24-/m1/s1

(4R)-4-[(1R,3aS,3bR,5aR,9aS,9bS,11aR)-9a,11a-dimethyl-7-oxo-hexadecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-1-yl]pentanoic acid

Dehydrolithocholic acid; 3-Oxocholanic acid; 3-oxoLCA; Dehydrolithocholic acid; 1553-56-6; 3-Ketolithocholic acid; 3-Oxo-5beta-cholanoic Acid; 3-keto-lithocholic acid; 3-Oxocholan-24-oic acid; 3-Ketolithocholic acid; 3-Oxolithocholic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 100 mg/mL (266.98 mM)
H2O: < 0.1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 3.33 mg/mL (8.89 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液； 超声助溶 (<60°C).
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。