ML162-yne

GPX4[1]
The primary target of ML162-yne is glutathione peroxidase 4 (GPX4), a key enzyme that protects cells against oxidative damage by reducing lipid hydroperoxides. ML162-yne is a potent inhibitor of GPX4. By inhibiting GPX4, the compound induces ferroptosis, a form of regulated cell death characterized by iron-dependent lipid peroxidation. The alkyne group allows for the conjugation of the compound to azide-containing probes for protein labeling and target identification studies.

研究人员近期发现，谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4) 是一种有望通过铁死亡杀死耐药癌细胞的靶点。多种治疗方法导致的耐药性会使细胞进入一种稳定的状态，其特征是多不饱和脂质水平升高以及对GPX4的依赖性增强。然而，目前所有GPX4抑制剂均通过活性烷基氯部分以共价键结合，导致选择性和药代动力学性质较差。本文报道了我们的一项新发现：此前未被用作共价细胞探针的掩蔽腈氧化物亲电试剂，在细胞内会发生显著的化学转化，为选择性靶向GPX4提供了一种有效策略。我们描述的新型GPX4抑制剂展现出意想不到的蛋白质组范围选择性，并且在某些情况下，其理化性质和药代动力学性质相比现有的氯乙酰胺类GPX4抑制剂有了显著改善。这些特性使它们成为研究铁死亡生物学机制的优良工具化合物，并为开发更有效的GPX4抑制剂奠定了基础[1]。

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体外实验表明，ML162-yne是一种强效的GPX4抑制剂。它可用作亲和探针，用于研究GPX4的功能并鉴定与GPX4相互作用的蛋白质。该化合物的炔基可通过点击化学反应与含叠氮基团的标签偶联，用于检测和下拉实验。ML162-yne是研究GPX4在铁死亡、癌症和其他疾病中作用的宝贵工具。

遗憾的是，目前所有GPX4抑制剂均通过活性烷基氯部分以共价键结合，导致选择性和药代动力学性质较差。本文报道了我们的一项发现：此前未被用作共价细胞探针的掩蔽腈氧化物亲电试剂，在细胞内会发生显著的化学转化，为选择性靶向GPX4提供了一种有效策略。我们描述的新型GPX4抑制化合物展现出意想不到的蛋白质组范围选择性，并且在某些情况下，与现有的基于氯乙酰胺的GPX4抑制剂相比，其理化性质和药代动力学性质得到了显著改善。这些特性使其成为研究铁死亡生物学机制的优良工具化合物，并为开发更有效的GPX4抑制剂奠定了基础[1]。

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在体内，ML162-yne可用于研究GPX4在疾病模型中的作用。该化合物通过抑制GPX4，可能诱导肿瘤或其他组织发生铁死亡。该化合物的点击化学特性也可用于体内标记和成像研究。然而，关于其有效性和安全性的详细体内研究仍然有限。

GPX4活性测定。[1]
基于质谱的GPX4酶活性测定方法参考了先前报道的方法⁴。将LOX-IMVI细胞用指定化合物（10 μM）或DMSO在37 °C下处理1小时。用PBS洗涤细胞，并在GPX4反应缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、1 mM EDTA、0.1 mM DFO；pH 7.4）中通过冻融法（×3）裂解细胞。裂解液经离心（10分钟，20000 × g，4 °C）澄清，并将总蛋白浓度调整至1.67 mg/mL。典型的酶活性测定混合物制备如下：200 μL 裂解液（GPX4 反应缓冲液中浓度为 1.67 mg/mL），2 μL PCOOH 的甲醇溶液，以及 20 μL GSH 溶液（100 mM；终浓度约为 5 mM）。反应体系短暂涡旋混匀后，于 37 °C 孵育 15 分钟。然后用 250 μL 2:1 氯仿/甲醇 (v/v) 溶液萃取反应混合物。萃取液在氮气流下干燥，并用甲醇复溶后进行分析。
采用与 Xevo G2XS QToF 质谱仪联用的 Acquity RP UPLC 系统进行 LC-MS 分析。复溶后的萃取液在 Waters Acquity RP UPLC BEH-C18 色谱柱（2.1 × 50 mm；1.7 μm 粒径；45 °C）上进行分离。流动相由10 mM乙酸铵水溶液（溶剂A）和95:5乙腈/10 mM乙酸铵混合溶液（溶剂B）组成。总运行时间为8分钟。UPLC洗脱液通过正离子模式电喷雾电离导入质谱仪。离子源设置如下：锥孔温度120 °C，锥电压50 V，毛细管电压1 kV，脱溶剂温度500 °C，脱溶剂气流速1100 L/h。质谱实验在灵敏度模式下进行，分辨率为20,000，质量精度<1 ppm。锁定质量（Leu-Enk，m/z 556.2771）以5 μL/min的流速连续注入，每15秒取样一次。使用 MassLynx 和 TargetLynx 软件进行质谱分析、PCOOH 鉴定和化学式确认分析。

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细胞热位移分析 (CETSA)[1]
对于完整细胞 CETSA 实验，细胞预先用 10 μM 化合物或 DMSO 对照 (0.1%, v/v) 在 37 °C 下处理 1 小时。然后吸出培养基，并用 PBS (pH 7.4) 洗涤细胞。用胰蛋白酶-EDTA 将贴壁细胞从培养瓶中消化下来，并通过离心 (500 × g，5 分钟) 收集细胞沉淀。将细胞分装到 PCR 管中（50 μL 体积，每个条件约 100 万个细胞），在 PCR 仪中于不同温度（通常为 40–67 °C，以 3 °C 为增量）加热 3 分钟。样品冷却至室温后再放置 3 分钟。细胞裂解方法有两种：一是液氮中经三次冻融循环；二是加入 Triton X-100 溶液（终浓度 1%，PBS，pH 7.4），冰上孵育 20 分钟，期间偶尔涡旋振荡。裂解后，细胞经离心（20,000 rcf，4 °C，20 分钟）去除不溶性物质。小心分离可溶性部分，并用 6× SDS 上样缓冲液稀释，用于 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析。
对于裂解液 CETSA 实验，按照完整细胞 CETSA 方案制备未处理细胞的裂解液，并用 PBS（pH 7.4）稀释至总蛋白浓度为 1 mg/mL。样品用 10 μM 化合物（或 0.1% v/v DMSO 对照）在 37 °C 下处理 1.5 小时。化合物处理后，将样品分装（每份 50 μL）至 PCR 管中，并按照上述完整细胞 CETSA 实验的方法进行处理。

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细胞内 GPX4 质谱结合分析。[1]
将 HEK293-6E 细胞接种于 24 孔板中，并用 GPX4_WT_FLAG-pTT5/SPB2-pTT5 进行转染。接种 72 小时后收集细胞，并在细胞收集前 1、4 或 24 小时加入化合物。每个时间点，化合物的添加浓度分别为：1、10 或 20 μM。监测转染和化合物处理后细胞的活力。通过离心收集细胞，并在裂解缓冲液（pH 7.4 的 50 mM 磷酸钠、300 mM NaCl 和 0.1% NP-40 溶液，并添加 Roche Complete 蛋白酶抑制剂混合物）中裂解。 GPX4 的纯化采用反 FLAG 色谱法，具体方法与大规模制备 FLAG-GPX4WT 的方法相同。纯化的 GPX4 样品经变性质谱分析，使用连接至 nanoAcquity UPLC 系统（Waters 公司）的 SYNAPT G2-S 四极杆飞行时间质谱仪进行。样品上样至 2.1 × 5 mm Mass Prep C4 保护柱，并以 100 μL/min 的流速，用乙腈浓度递增的短梯度（3 min）进行脱盐。使用 MassLynx v4.1 软件分析光谱，并用 MaxEnt1 算法进行反卷积。

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纯化 GPX4 的 GPX4 质谱结合实验。[1]
将重组 FLAG-GPX4WT 蛋白（10 μM，溶于 pH 7.4 的缓冲液，含 50 mM 磷酸钠和 300 mM NaCl）与 100 μM 化合物（最终 DMSO 浓度为 1% v/v）在室温下孵育 2 小时。向 15 μL 反应体系中加入 1 μL 5% v/v TFA 终止反应，并按照细胞内 GPX4 质谱结合实验所述方法进行 LC-MS 分析。GPX4U46C allCys(−) 的结合实验按先前所述方法进行。

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ML162-yne 的体外实验包括测定其对 GPX4 的抑制活性。 GPX4活性通常采用偶联酶法测定，或通过监测谷胱甘肽的消耗或脂质氢过氧化物的还原来测定。将该化合物与GPX4及其底物孵育，并定量分析酶活性的抑制情况。炔基可使该化合物与含叠氮基团的探针偶联，用于蛋白质标记和靶标鉴定研究。

GPX4 pull-down 和 ABPP 实验的细胞处理方法。
将 LOX-IMVI 细胞接种于含 10% FBS 的 RPMI 培养基的 6 孔板中。向细胞中加入炔烃亲和探针，并在 37 °C 下孵育 1 小时（10 mM DMSO 储备液，最终炔烃浓度为 10 μM）。移除培养基，并用冰冷的 PBS（pH 7.4）洗涤细胞一次。然后将细胞在含有 1% Triton X-100 和蛋白酶抑制剂（Roche Complete）的 PBS 中于冰上裂解 20 分钟。通过离心（20,000 × g，4 °C）去除细胞碎片。使用 Pierce Coomassie Plus Bradford 蛋白定量试剂盒测定裂解液的总蛋白含量，并调整至 2 mg/mL。
对于裂解液下拉实验，LOX-IMVI 细胞裂解液的制备方法如上所述，使用未经处理的细胞，并将总蛋白浓度调整至 2 mg/mL。裂解液在室温下用指定的炔烃探针（10 μM，1 小时）或 DMSO 处理，然后立即用于后续的点击化学反应。

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GPX4 下拉实验的样品处理。
将裂解液置于铜催化叠氮-炔环加成 (CuAAC) 条件下，与叠氮-PEG3-生物素缀合物反应。典型的反应在 120 μL 的最终体积中进行，该体积包含 100 μL 裂解液（2 mg/mL；最终浓度 = 1.67 mg/mL）、2.4 μL SDS（10%；最终浓度 = 0.2%）、2.4 μL 叠氮-PEG3-生物素缀合物（5 mM DMSO；最终浓度 = 100 μM）和 15.2 μL 催化剂混合物（最终浓度 = 1.3 mM Cu2SO4、1.3 mM TCEP 和 75 μM TBTA）。将3份三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA；1 mM，溶于1:4 DMSO/叔丁醇混合溶液）、1份50 mM硫酸铜水溶液和1份三(2-羧乙基)膦（TCEP；50 mM，溶于水，pH 7.0）混合制备催化剂混合液。加入所有组分后，涡旋振荡CuAAC反应体系，并在室温下反应1小时，然后用120 μL 0.2% SDS PBS溶液稀释。取40 μL反应液，加入6× SDS上样缓冲液终止反应，作为输入对照。向剩余样品中加入Pierce高容量链霉亲和素琼脂糖珠，并在4 °C下旋转过夜。随后通过离心分离磁珠，并依次用 1% SDS (3 × 1 mL) 和 PBS (2 × 1 mL) 洗涤。将磁珠置于 75 μL 2× SDS 上样缓冲液中煮沸 10 分钟以洗脱蛋白质，并通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹法进行分析。

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ML162-yne 的细胞实验通常使用细胞系来研究铁死亡。用该化合物处理细胞，并使用 MTT 或 CellTiter-Glo 等标准方法检测细胞活力。通过检测脂质过氧化、谷胱甘肽消耗和线粒体功能障碍来确认铁死亡的诱导。还可以评估该化合物对细胞信号通路和蛋白质表达的影响。

小鼠药代动力学 (PK) 研究。[1]
为了确定 JKE-1674 口服给药后在 SCID 小鼠体内的药代动力学特性，分别于单次口服 50 mg/kg JKE-1674（溶于 PEG400/乙醇 (90/10, v/v) 中）后 1、3、6 和 24 小时，从每组 3 只小鼠采集血样进行血浆分析。血液收集于含肝素锂的试管中，离心分离血浆，用乙腈 (1/5, v/v) 沉淀，并采用 LC-MS/MS 进行分析。

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小鼠毒性评估。[1]
在进行药代动力学测量之前，评估了 JKE-1674 的耐受性。在连续 7 天的给药期间，接受 50 mg/kg 活性化合物的小鼠的平均体重减轻不超过 10%。在本实验条件下，高于 50 mg/kg 的剂量无法耐受。

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ML162-yne 的体内动物研究通常包括将该化合物给药于荷瘤啮齿动物模型。治疗后，评估肿瘤生长、铁死亡标志物和生存情况。评估该化合物诱导肿瘤细胞铁死亡的能力及其作为抗癌药物的潜力。ML162-yne 的点击化学特性也可用于体内成像研究。

作为一种小分子化合物，ML162-yne 的药代动力学性质取决于其理化特性。该化合物的分子量为 501.42 g/mol。关于该产品稳定性，尤其是在溶液中的稳定性，鲜有报道。详细的 ADME 参数，例如半衰期、生物利用度和组织分布，目前尚无公开数据。

现有文献中未报道ML162-yne的具体毒性数据。作为一种研究用化学品，该化合物仅供实验室使用，并应按照标准安全预防措施进行操作。如果该化合物拟进一步开发用于治疗用途，则需要进行毒性研究。

[1]. Selective covalent targeting of GPX4 using masked nitrile-oxide electrophiles. Nat Chem Biol. 2020 May;16(5):497-506.

GPX4是一种硒蛋白，在通过将脂质过氧化物还原为相应的脂质醇来保护细胞免受脂质过氧化和铁死亡的关键作用。GPX4具有还原复杂脂质过氧化物的独特能力，是迄今已知的唯一能够执行这一关键功能的哺乳动物蛋白。GPX4的广泛底物范围可能源于其单体结构以及其活性位点中催化硒半胱氨酸残基附近相对平坦的表面。[1]然而，这些结构特征也使得GPX4成为开发小分子抑制剂的挑战性靶点。由于缺乏药物样结合口袋，并且酶活性依赖于亲核性硒半胱氨酸残基，抑制细胞内GPX4可能需要共价抑制剂。事实上，所有已知的直接和细胞活性GPX4抑制剂都是烷基化剂，通过活化的烷基氯与硒半胱氨酸残基共价结合（图1a和补充图1）。这些抑制剂选择性低且药代动力学特性差。这限制了它们作为体外工具化合物的应用，阻碍了它们在体内的应用，并使其成为开发药物样GPX4抑制剂时不理想的起始化合物。此外，值得注意的是，细胞和生化筛选尚未识别其他常见的电亲核试剂，如丙烯酰胺，作为选择性GPX4靶向的活性基团。同样，用反应性较低的电亲核试剂替代氯乙酰胺基团会产生不再抑制GPX4的类似物[1]。我们通过机制研究发现的GPX4抑制剂工具包代表了GPX4靶向化学的前所未有的丰富性和多样性（硝基异噁唑、α-硝基酮肟和亚硝酸盐）。这些化合物有望克服GPX4生物学中的一个主要缺陷，目前的生物实验和结果解释主要依赖于单一的非特异性化学（氯乙酰胺）。因此，我们鼓励研究GPX4和铁死亡生物学的科学家将这些化学多样的GPX4抑制剂纳入他们的实验设计中。这种方法有望减轻化学类型特异性的脱靶效应，并促进需要高度选择性铁死亡诱导的生物发现，例如通过掩蔽的腈氧化物GPX4抑制剂诱导铁死亡[1]。最后，我们期望我们提供的众多工具化合物、机制见解、细胞靶向结合分析和生化数据能够使学术界和制药界开发出更有效的GPX4抑制小分子。

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ML162-yne（CAS#: 2883115-46-4）是一种强效的GPX4抑制剂亲和探针。它是一种点击化学试剂，含有一个炔基，可以与含有叠氮基团的化合物发生铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAc）。该化合物的分子式为C25H22Cl2N2O3S，分子量为501.42。ML162-yne适用于蛋白质标记和相关研究。

C25H22CL2N2O3S

501.424783229828

500.072

C, 59.88; H, 4.42; Cl, 14.14; N, 5.59; O, 9.57; S, 6.39

2883115-46-4

145865959

White to off-white solid powder

5.3

86.9

1

4

10

33

694

0

C#CCOC1=C(C=C(C=C1)N(C(C2=CC=CS2)C(=O)NCCC3=CC=CC=C3)C(=O)CCl)Cl

AFUOBFISLHQJJJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H22Cl2N2O3S/c1-2-14-32-21-11-10-19(16-20(21)27)29(23(30)17-26)24(22-9-6-15-33-22)25(31)28-13-12-18-7-4-3-5-8-18/h1,3-11,15-16,24H,12-14,17H2,(H,28,31)

2-(3-chloro-N-(2-chloroacetyl)-4-prop-2-ynoxyanilino)-N-(2-phenylethyl)-2-thiophen-2-ylacetamide

ML162-yne; 2883115-46-4; 2-Chloro-N-(3-chloro-4-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl)-N-(2-oxo-2-(phenethylamino)-1-(thiophen-2-yl)ethyl)acetamide; 2-{2-chloro-N-[3-chloro-4-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl]acetamido}-N-(2-phenylethyl)-2-(thiophen-2-yl)acetamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 100 mg/mL (199.43 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。