ML162-yne

GPX4[1]

研究人员最近描述了谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是通过脱铁作用杀死具有耐药性的癌症细胞的一个有前途的靶点。多种类型的治疗引起的治疗耐药性导致稳定的细胞状态，其特征是高水平的多不饱和脂质和对GPX4的获得性依赖。不幸的是，所有现有的GPX4抑制剂都是通过反应性烷基氯部分共价作用的，这导致了较差的选择性和药代动力学特性。在这里，我们报告了我们的发现，以前未被探索为共价细胞探针的掩蔽氧化腈亲电试剂在细胞中发生了显著的化学转化，并为选择性靶向GPX4提供了一种有效的策略。我们描述的新的GPX4抑制化合物表现出意想不到的蛋白质组范围的选择性，在某些情况下，与现有的基于氯乙酰胺的GPX4抑制剂相比，其理化和药代动力学特性得到了极大的改善。这些特征使它们成为铁下垂生物询问的优越工具化合物，并构成了开发改进的GPX4抑制剂的起点[1]。

不幸的是，所有现有的GPX4抑制剂都是通过反应性烷基氯部分共价作用的，这导致了较差的选择性和药代动力学特性。在这里，我们报告了我们的发现，以前未被探索为共价细胞探针的掩蔽氧化腈亲电试剂在细胞中发生了显著的化学转化，并为选择性靶向GPX4提供了一种有效的策略。我们描述的新型GPX4抑制化合物表现出意想不到的蛋白质组范围选择性，在某些情况下，与现有的基于氯乙酰胺的GPX4抑制剂相比，其理化和药代动力学特性得到了极大的改善。这些特征使它们成为铁下垂生物询问的优越工具化合物，并构成了开发改进的GPX4抑制剂的起点[1]。

GPX4活性测定。[1]
基于质谱的GPX4酶活性测定改编自之前描述的程序4。LOX-IMVI细胞在37°C下用指定化合物（10μM）或DMSO处理1小时。用PBS洗涤细胞，并在GPX4反应缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、1 mM EDTA、0.1 mM DFO；pH 7.4）中通过冻融法（x3）裂解细胞。通过离心（10分钟，20000×g，4°C）清除裂解物，并将总蛋白浓度调节至1.67mg/mL。典型的酶活性测定混合物制备如下：200μL裂解物（在GPX4反应缓冲液中为1.67mg/mL），2μL甲醇中的PCOOH，以及20μL谷胱甘肽溶液（100mM；终浓度约5mM）。将反应物短暂涡旋，并在37°C下孵育15分钟。然后使用250μL 2:1氯仿/甲醇（v/v）溶液提取反应混合物。提取物在氮气流下干燥，并在分析前在甲醇中复溶。
使用Acquity RP UPLC系统与Xevo G2XS QToF质谱仪进行LC-MS分析。在Waters Acquity RP UPLC BEH-C18柱（2.1×50 mm；1.7μm粒径；45°C）上分离重构提取物。流动相由10mM乙酸铵水溶液（溶剂A）和95:5乙腈/10mM乙酸铵（溶剂B）组成。总运行时间为8分钟。通过正模式电喷雾电离将UPLC洗脱液引入质谱仪。源设置为120°C、50 V锥电压、1 kV毛细管电压、500°C脱溶剂温度和1100 L/h脱溶剂气体流量。质谱实验在灵敏度模式下进行，分辨率为20000，质量精度<1ppm。以5μL/分钟的速度连续输注锁块（Leu-Enk，m/z 556.2771），每15秒取样一次。MassLynx和TargetLynx软件用于质谱分析、PCOOH鉴定和化学式确认分析。

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细胞热位移测定（CETSA）。[1]
对于完整细胞CETSA实验，细胞在37°C下用10μM化合物或DMSO对照（0.1%，v/v）预处理1小时。然后抽吸培养基，用PBS（pH 7.4）洗涤细胞。用胰蛋白酶-EDTA将粘附细胞从烧瓶中分离出来，并通过离心（500×g，5分钟）制成颗粒。将细胞等分到PCR管（50μL体积，约100万个细胞/条件）中，在热循环仪中以不同温度（通常为40-67°C，增量为3°C）加热3分钟。让样品再冷却至室温3分钟。细胞在液氮中通过三次冻融循环或加入Triton X-100溶液（1%最终TX-100体积，PBS pH 7.4）进行裂解，随后在冰上孵育20分钟，偶尔涡旋。裂解后，将细胞离心（在20000 rcf、4°C下离心20分钟）以去除不溶性物质。仔细分离可溶性部分，并用6x SDS负载缓冲液稀释，用于SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。
对于裂解物CETSA实验，按照完整细胞CETSA方案所述制备未处理细胞的裂解物，并用PBS（pH 7.4）稀释至总蛋白浓度为1 mg/mL。样品在37°C下用10μM化合物（或0.1%v/v DMSO对照）处理1.5小时。化合物处理后，将样品等分（每个样品50μL）放入如上所述处理的PCR管中，用于完整细胞CETSA实验。

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细胞内GPX4质谱结合分析。[1]
在24孔平板中用GPX4_WT_FLAG-pTT5/SPB2-pTT5转染HEK293-6E细胞。接种后72小时收获细胞，在细胞收获前1、4或24小时加入化合物。对于每个时间点，以以下浓度添加化合物：1、10或20μM。监测转染和化合物处理细胞的存活率。通过离心收获细胞，并在裂解缓冲液（pH 7.4的50 mM磷酸钠、300 mM NaCl和0.1%NP-40溶液，补充有罗氏完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中裂解。GPX4通过抗FLAG色谱纯化，如大规模制备FLAG-GPX4WT所述。使用连接到nanoAcquity UPLC系统（Waters）的SYNAPT G2-S四极杆飞行时间质谱仪对纯化的GPX4样品进行变性MS分析。将样品装载在2.1×5 mm的质量制备C4保护柱上，以100μL/min的流速用乙腈浓度递增的短梯度（3分钟）脱盐。使用MassLynx v4.1软件分析光谱，并用MaxEnt1算法解卷积。

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纯化GPX4的GPX4质谱结合分析。[1]
将重组FLAG-GPX4WT蛋白（10μM，在pH 7.4的缓冲液中，含有50 mM磷酸钠和300 mM NaCl）与100μM化合物（终DMSO浓度为1%v/v）在室温下孵育2小时。通过向15μL反应体积中加入1μL 5%v/v TFA来淬灭反应，并按照细胞内GPX4 MS结合测定所述进行LC-MS分析。如前所述，进行了GPX4U46C allCys（−）的结合实验。

GPX4下拉和ABPP实验的细胞处理
将LOX-IMVI细胞接种在补充有10%FBS的RPMI培养基的6孔板中。将炔烃亲和探针加入细胞中，在37°C下孵育1小时（DMSO中的10 mM储备，最终炔烃浓度=10μM）。移除培养基，用冰冷的PBS（pH 7.4）洗涤细胞一次。然后将细胞在含有1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂（Roche Complete）的PBS中在冰上裂解20分钟。通过离心（20000×g，4°C）清除样品。用Pierce Coomassie Plus Bradford检测试剂盒评估裂解物的总蛋白含量，并将其调节至2mg/mL。
对于裂解物下拉实验，如上所述，从未处理的细胞制备LOX-IMVI细胞裂解物，并将其调节至总蛋白浓度为2 mg/mL。裂解物在环境温度下用指定的炔烃探针（10μM，1小时）或DMSO处理，然后立即用于随后的点击化学反应。

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GPX4下拉分析的样品处理
裂解物在铜催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAC）条件下与叠氮-EG3-生物素共轭物进行反应。典型的反应是在120μL的终体积下进行的，由100μL裂解物（2 mg/mL；终浓度=1.67 mg/mL）、2.4μL SDS（10%；终浓度=0.2%）、2.4µL叠氮-EG3-生物素偶联物（5 mM DMSO；终浓度=100μM）和15.2μL催化剂混合物（终浓度=1.3 mM Cu2SO4、1.3 mM TCEP和75μM TBTA）组成。通过混合3份三[（1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基）甲基]-胺（TBTA；1mM在1:4DMSO/tBuOH中）、1份50mM Cu2SO4在水中和1份三（2-羧乙基）膦（TCEP；50mM在水中，pH 7.0）来制备催化剂混合料。加入所有组分后，涡旋CuAAC反应，使其在环境温度下反应1小时，然后用120μL 0.2%SDS的PBS溶液稀释。取出40μL等分试样，用6x SDS样品缓冲液作为输入对照淬灭。将皮尔斯高容量链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠加入剩余样品中，并在4°C下旋转过夜。然后通过离心分离珠粒，并依次用1%SDS（3×1mL）和PBS（2×1ml）洗涤。通过在75μL 2x SDS样品缓冲液中煮沸珠子10分钟来洗脱蛋白质，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析。

小鼠药代动力学 (PK) 研究。[1]
为了确定 JKE-1674 口服给药后在 SCID 小鼠体内的药代动力学特性，分别于单次口服 50 mg/kg JKE-1674（溶于 PEG400/乙醇 (90/10, v/v) 中）后 1、3、6 和 24 小时，从每组 3 只小鼠采集血样进行血浆分析。血液收集于含肝素锂的试管中，离心分离血浆，用乙腈 (1/5, v/v) 沉淀，并采用 LC-MS/MS 进行分析。

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小鼠毒性评估。[1]
在进行药代动力学测量之前，评估了 JKE-1674 的耐受性。在连续 7 天的给药期间，接受 50 mg/kg 活性化合物的小鼠的平均体重减轻不超过 10%。在本实验条件下，剂量高于 50 mg/kg 时无法耐受。

[1]. Selective covalent targeting of GPX4 using masked nitrile-oxide electrophiles. Nat Chem Biol. 2020 May;16(5):497-506.

GPX4 是一种硒蛋白，它通过将脂质氢过氧化物还原为相应的脂质醇，在保护细胞免受脂质过氧化和铁死亡方面发挥着关键作用。GPX4 具有独特的还原复杂脂质氢过氧化物的能力，是迄今为止已知唯一能够执行此关键功能的哺乳动物蛋白^5,6。GPX4 广泛的底物范围可能源于其单体结构以及活性位点中催化硒代半胱氨酸残基附近相对平坦的表面^[1]。
然而，正是这些结构特征也使得 GPX4 成为开发小分子抑制剂的挑战性靶点。由于缺乏类似药物的结合口袋，且酶活性依赖于亲核硒代半胱氨酸残基，因此抑制细胞内 GPX4 可能需要共价抑制剂。事实上，所有已知的直接且具有细胞活性的GPX4抑制剂均为烷基化剂，它们通过活化的烷基氯与硒代半胱氨酸残基共价结合（图1a和补充图1）。这类抑制剂选择性低，药代动力学性质差。这限制了它们作为体外工具化合物的应用，阻碍了它们在体内的应用，也使它们成为开发类药GPX4抑制剂的不理想起始化合物。此外值得注意的是，细胞和生化筛选尚未发现其他常见的亲电试剂，例如丙烯酰胺，可以作为选择性GPX4靶向的活性基团。同样，用反应活性较低的亲电试剂取代氯乙酰胺基团，可以得到不再抑制GPX4的类似物[1]。
我们通过机制研究发现的GPX4抑制剂工具包，代表了前所未有的丰富多样的GPX4靶向化学类型（硝基异噁唑、α-硝基酮肟和亚硝酸）。这些化合物有望克服GPX4生物学领域的一个主要缺陷，即目前生物学实验和结果解读主要依赖于单一的非特异性化学类型（氯乙酰胺）。因此，我们鼓励研究GPX4和铁死亡生物学的科学家们将我们发现的这些化学结构多样的GPX4抑制剂纳入他们的实验设计中。这种方法有望减轻化学类型特异性脱靶效应，并促进需要高度选择性铁死亡诱导的生物学发现，例如通过掩蔽的腈氧化物 GPX4 抑制剂[1]实现的铁死亡诱导。
最后，我们期望我们提供的众多工具化合物、机制见解、细胞靶点结合分析和生化数据能够促进学术界和制药界开发更有效的 GPX4 抑制小分子。

C25H22CL2N2O3S

501.424783229828

500.072

C, 59.88; H, 4.42; Cl, 14.14; N, 5.59; O, 9.57; S, 6.39

2883115-46-4

145865959

White to off-white solid powder

5.3

86.9

1

4

10

33

694

0

AFUOBFISLHQJJJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H22Cl2N2O3S/c1-2-14-32-21-11-10-19(16-20(21)27)29(23(30)17-26)24(22-9-6-15-33-22)25(31)28-13-12-18-7-4-3-5-8-18/h1,3-11,15-16,24H,12-14,17H2,(H,28,31)

2-(3-chloro-N-(2-chloroacetyl)-4-prop-2-ynoxyanilino)-N-(2-phenylethyl)-2-thiophen-2-ylacetamide

ML162-yne; 2883115-46-4; 2-Chloro-N-(3-chloro-4-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl)-N-(2-oxo-2-(phenethylamino)-1-(thiophen-2-yl)ethyl)acetamide; 2-{2-chloro-N-[3-chloro-4-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl]acetamido}-N-(2-phenylethyl)-2-(thiophen-2-yl)acetamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 100 mg/mL (199.43 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。