CCT374705

BCL6
BCL6 (B-cell lymphoma 6 protein). CCT374705 binds to the BTB domain of BCL6, inhibiting its interaction with co-repressor proteins such as SMRT and NCOR2, thereby derepressing BCL6 target genes involved in cell cycle arrest and apoptosis.

含氯和氟取代的吡啶化合物 CCT374705 具有最佳的性能平衡，包括更高的溶解度和微粒体清除率，与 CCT374284 相似[1]。

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体外实验表明，CCT374705 对多种弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系（例如 OCI-Ly1、OCI-Ly3、SU-DHL-4、SU-DHL-6 和 Farage 细胞）具有显著的抗增殖作用。它能有效破坏 BCL6 转录抑制复合物，从而激活 BCL6 靶基因，并特异性地诱导 BCL6 依赖性淋巴瘤细胞凋亡。

我们选择使用Karpas 422异种移植瘤模型对CCT374705进行疗效研究，因为CCT374705在该细胞系中表现出最强的抗增殖作用。本研究旨在探讨BCL6抑制剂在体内的作用。为了评估其疗效，我们希望确保在整个研究过程中抑制剂的浓度始终高于IC90。为了实现如此高的持续暴露水平，我们采用每日两次、每次50 mg/kg的口服给药方案。通过检测ARID3A mRNA表达的增加，我们证实了CCT374705与BCL6靶点的结合。药代动力学/药效学分析显示，给药后12小时内，CCT374705的游离浓度仍远高于其IC90。然而，与我们之前报道的BCL6降解剂CCT373566的疗效结果类似，本研究仅观察到中等的体内疗效。 CCT374705 的体内药代动力学特征已得到优化，该化合物是研究小鼠模型中 BCL6 在疾病中的作用和功能的合适探针[1]。

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在体内，CCT374705 能有效抑制淋巴瘤异种移植小鼠模型中的肿瘤生长。当口服给药于携带弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）异种移植瘤的小鼠时，该化合物表现出剂量依赖性的肿瘤生长抑制作用（TGI），与溶剂对照组相比，肿瘤体积显著缩小。该化合物耐受性良好，目前已进入临床前毒理学研究阶段。

TR-FRET 检测 [1]
在含有 1 nM Trx-6xHis-BCL6（内部生产的人 BCL6 BTB 结构域覆盖氨基酸序列 5-129）、300 nM BCOR-AF633 肽（RSEIISTAPSSWVVPGP-Cys-AlexaFluor 633-酰胺）和 0.5 nM 抗 6xHis-铽隐蔽物、检测缓冲液（25 mM Hepes pH8、100 mM NaCl、0.05% Tween20、0.5 mM TCEP、0.05% 牛血清白蛋白）的 384 孔黑色 Proxiplate（Perkin Elmer）中进行检测。使用 ECHO550 声波分液器将溶于 DMSO 或仅溶于 DMSO 的测试化合物加入孔中，使最终 DMSO 浓度达到 0.7% (v/v)。室温孵育 2 小时后，使用 Envision 酶标仪读取孔板，激发波长为 337 nm，第一发射滤光片为 APC 665 nm，第二发射滤光片为铕 615 nm；或者使用 Pherastar FSX 酶标仪读取孔板，激发波长为 337 nm，第一发射滤光片为 620 nm，第二发射滤光片为 665 nm。通过将 FRET 比值归一化至相应的高浓度（DMSO 加所有试剂）和低浓度（DMSO 不加 BCL6）对照，计算各浓度下的抑制率。使用 GraphPad Prism 6.0 或 Dotmatics 软件，将归一化数据拟合到四参数 S 型逻辑拟合方程，确定 IC50 值。

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NanoBRET 检测 [1]
采用细胞纳米生物发光共振能量转移 (nanoBRET) 检测方法检测 BCL6-SMRT（也称为 NCOR2）共抑制蛋白-蛋白相互作用的抑制情况。将编码全长 BCL6 和 SMRT 的 DNA 分别插入 pFC32K.NanoLuc 和 pFC14K.HaloTag 载体，以构建 C 端带有标签的融合蛋白 BCL6-nanoLuc 和 SMRT-HaloTag。将 HEK293T 细胞（5×10⁵ 个/孔）接种于 T75 组织培养瓶中，48 小时后，使用 Fugene 6 转染试剂和 18 µg 总 DNA 质粒进行转染，其中 BCL6-nanoLuc 为供体，SMRT-HaloTag 为受体，供体与受体 DNA 的比例为 1:25。转染24小时后，收集HEK293T细胞，并将其保存在含90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）的液氮中。实验时，使用Echo550声波分液器，将化合物（100 nL/孔）和NanoBRET 618配体（10 nL/孔，1 mg/ml储备液）分装至干燥的384孔NUNC白色检测板中。将冻存的转染HEK293T细胞解冻，离心后，用不含酚红的OptiMEM+4% FBS培养基替换冻存培养基。将细胞密度调整至 3×10⁵ 个细胞/ml，取 20 µL（6000 个细胞）接种于每个孔中，孔内含有待测化合物（0.0125-50 µM，溶于 DMSO）或仅含 DMSO 的溶液，以及 0.5 µg/ml NanoBRET 618 荧光配体，DMSO 的最终浓度为 0.55% (v/v)。细胞在 37 °C/5% CO₂ 条件下孵育 6 小时后，加入 NanoBRET 呋喃嗪底物，使其最终浓度达到 10 µM。短暂离心后，使用配备 LUM/D600 双镜、LUM 450/40 nm 带通滤光片和 D605 nm 长通滤光片的 Envision 酶标仪读取样品，读取时间为 0.2 秒，以确定 BRET 比率。或者，使用配备 BRET 模块 LP610 nm（第一发射滤光片）/ 450-80 nm（第二发射滤光片）的 Pherastar FSX 读取微孔板。通过将 BRET 比值归一化至相应的高低浓度对照，计算每个测试浓度下的抑制率。使用 Graphpad Prism 6.0 或 Dotmatics 软件，将归一化数据拟合到四参数 S 型逻辑拟合方程，确定化合物的 IC50 值。

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采用时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 生化分析法评估 BCL6 抑制情况：将重组 His 标签 BCL6 BTB 结构域与生物素标记的 SMRT 肽在 CCT374705 系列稀释液 (0.1-1000 nM) 存在下孵育。使用铕标记的抗 His 抗体和链霉亲和素-APC 检测结合情况。IC50 值由 TR-FRET 信号比值计算得出。

将细胞以每孔 2500 个细胞的密度接种于 96 孔培养板中，培养基为添加 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基。首先使用 Echo 550 声波分液器将化合物分装至 96 孔 U 型底板中，然后用 RPMI-1640 培养基稀释后转移至细胞上。细胞用 8 个浓度的化合物处理，每个浓度设置两个复孔，浓度范围为 1.07 nM 至 10 µM，最终 DMSO 浓度为 0.1%，最终体积为 100 µl。细胞与化合物孵育 14 天，分别于第 3、7 和 10 天更换培养基，具体操作如下：制备新的 96 孔细胞培养板，其中包含 100 µl 培养基和相应浓度的化合物（第 10 天使用白色培养板以优化发光测量）。将含有细胞的检测板涡旋混匀，并使用库尔特Z2细胞计数器计数一个对照孔中的细胞密度。计算对照孔中含有2500个细胞的培养基体积，并将该体积的细胞从检测板的每个孔转移到含有化合物的新鲜板的相应孔中。14天后，将CellTiter Glo试剂以1:2的比例加入到检测板的每个孔的培养基中，在振荡器上混匀，然后在室温下孵育10分钟。使用Envision酶标仪测量发光值，并计算每种化合物浓度下相对于单独DMSO的相对发光值。使用Dotmatics软件[1]进行四参数曲线拟合来确定GI50值。

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在体外细胞实验中，将BCL6依赖性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞（例如SU-DHL-4）接种于96孔板中，并用CCT374705（0.01-10 uM）系列稀释液处理72小时。采用CellTiter-Glo发光法检测细胞活力。处理24小时后，通过qRT-PCR评估BCL6靶基因（例如CDKN1A、BLIMP1、TP53）的重新激活情况，并通过Annexin V/PI流式细胞术评估细胞凋亡。

体内药代动力学研究[1]
给药前，动物在实验室条件下适应至少1周，并可自由摄取食物和水。化合物通过静脉注射或口服给药（小鼠，0.1 mL/10 g，溶于10% DMSO、5% Tween 20的生理盐水中）；在给药后6或24小时内，于7或8个时间点从尾静脉采集肝素化毛细管血样，并与标准曲线和加入对照血液的质控样品一起冷冻保存。样品用含有内标的水：甲醇混合物进行复溶，方法如前所述（Roberts等，2016）。离心后，提取物经0.1%甲酸和甲醇梯度分离后，使用Waters Xevo TQ-S或Sciex QTrap6500质谱仪，在Phenomenex Kinetex C18 UPLC色谱柱（50 × 2.1 mm，2.6 μM）上进行ESI-LCMS/MS分析，通过监测前体离子和产物离子的多反应监测（MRM）。定量采用外标法。质控样品浓度均在标称浓度的20%以内。药代动力学参数采用Phoenix Pharsight非房室模型分析软件（型号200和201）6.3版进行非房室模型分析。所有参数均基于6小时内的时间点计算。

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CCT374705的制剂[1]
SEDA公司开发了一种适用于较高浓度（> 5 mg/mL）CCT374705的溶液制剂，具体见表S4。将CCT374705溶解于预定体积的DMSO中，并在40℃下加入预定体积的Kolliphor HS15。短暂涡旋混合后，在40℃下加入预定体积的PEG400。再次短暂涡旋混合后，加入预定体积的HPMC水溶液（1.25%，粘度40-60cp级）。涡旋混合后，在40℃下超声处理约45-60分钟。以相同方式制备不含化合物的完整载体。制剂在室温下最多保存3-4天。化合物和赋形剂溶液均采用灌胃针经口给药（每只20克小鼠0.2毫升）——小鼠单独称重，并据此调整给药体积。

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体内药效学（PK/PD）和疗效研究[1]
小鼠Karpas 422异种移植模型的制备。使用无血清RMPI-1640培养基和等体积的Matrigel®（两者均预冷至4℃）制备Karpas 422B细胞，最终浓度为5×10⁷个细胞/毫升。将细胞以每200微升10⁷个细胞的浓度皮下注射到雌性SCID小鼠体内，单点注射。注射后三周，随机选择荷瘤小鼠（平均直径0.5厘米²±0.1厘米），并将其分为治疗组和对照组（每组n=10）。 CCT374705 和载体的配制方法如补充实验 5.2 所述：CCT374705 (50 mg/kg) 和载体 (0.2 mL/20g 体重) 口服给药，每天两次，间隔约 12 小时，持续 35 天。

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在免疫缺陷小鼠（例如NOD/SCID或NSG小鼠）中，采用BCL6依赖性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞（例如SU-DHL-6）的皮下异种移植模型评估体内疗效。当肿瘤体积达到约100-200 mm³时，以10-100 mg/kg的剂量每日一次口服CCT374705，持续2-4周。每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积。收集肿瘤组织进行Western blot和qPCR分析，以评估BCL6靶基因表达和药效学标志物。

CCT374705 具有口服生物利用度，分子量为 450.84 g/mol，分子式为 C21H18ClF3N4O2。详细的体内药代动力学参数（例如，半衰期、Cmax、AUC、口服生物利用度）可在专利文献 (WO2017197184) 中找到，其合适的口服暴露量支持在临床前动物中每日一次给药。

临床前毒理学研究表明，CCT374705 在有效剂量下通常耐受性良好。动物模型中观察到的最常见不良反应是轻度胃肠道紊乱和高剂量水平下的轻微体重下降。在治疗剂量下未报告明显的器官毒性。

[1]. Discovery of an In Vivo Chemical Probe for BCL6 Inhibition by Optimization of Tricyclic Quinolinones. J Med Chem. 2023 Apr 27;66(8):5892-5906.

B细胞淋巴瘤6 (BCL6) 是一种转录抑制因子，也是弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL) 致癌性的驱动因子。本文报道了我们之前报道的一系列三环喹啉酮类化合物的优化，这些化合物可用于抑制BCL6。我们的目标是提高近期发表的降解剂CCT373566的非降解异构体CCT373567的细胞活性和体内暴露量。我们抑制剂的主要局限性在于其较高的拓扑极性表面积 (TPSA)，这会导致外排增加。降低分子量使我们能够在不显著降低溶解度的情况下消除极性并降低TPSA。在药代动力学研究的指导下，我们仔细优化了这些性质，最终发现了CCT374705，一种具有良好体内特性的强效BCL6抑制剂。在淋巴瘤异种移植小鼠模型中，口服给药后观察到了一定的体内疗效。[1]

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CCT374705 是一种研究化合物，其最早在专利 WO2017197184 和 WO2019086240 中有所描述。该化合物尚未获准用于临床，仅供实验室研究之用，尤其用于研究 BCL6 在弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL) 和其他 BCL6 驱动的恶性肿瘤中的作用。该化合物有望成为评估 BCL6 抑制作为肿瘤治疗策略的有效工具。

C21H18CLF3N4O2

450.841434001923

450.10703

2640647-90-9

156276733

Typically exists as white to off-white solids at room temperature

4.2

66.5Ų

2

8

3

31

765

1

ClC1C(=NC=CC=1NC1C=CC2=C(C=1)C1=C(C(N2C)=O)OCC([C@H](C2CC2)N1)(F)F)F

MCRHRRIGPAVFNY-SFHVURJKSA-N

InChI=1S/C21H18ClF3N4O2/c1-29-14-5-4-11(27-13-6-7-26-19(23)15(13)22)8-12(14)16-17(20(29)30)31-9-21(24,25)18(28-16)10-2-3-10/h4-8,10,18,28H,2-3,9H2,1H3,(H,26,27)/t18-/m0/s1

(2S)-10-[(3-chloro-2-fluoropyridin-4-yl)amino]-2-cyclopropyl-3,3-difluoro-7-methyl-2,4-dihydro-1H-[1,4]oxazepino[2,3-c]quinolin-6-one

CCT374705; 2640647-90-9; SCHEMBL23248186

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 100 mg/mL (221.81 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.55 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.55 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。