FAPI-34   中文名称: FAPI-34

FAP/Fibroblast activation protein

附加亲水性氨基酸对肝脏蓄积和肝胆排泄的抑制作用[2]
为了改善体内特性，用Asn、Glu和Gla （γ-羧谷氨酸）修饰了螯合部分。此外，在哌嗪基和喹啉基之间合成了一种以三甘醇为间隔剂的前体，以增加FAPI-29的亲水性，而无需在螯合部分进行进一步修饰。与最初合成的99mTc-FAPI-19相比，衍生物99mTc-FAPI-33和-34在HT-1080-FAP细胞上的摄取率分别高达45.8%±1.3%和41.86%±1.07%（图2A）。此外，内部化率在95%以上(图2A；补充表2)和对FAP的高亲和力，观察到FAPI-33的IC50值为10.9 nM， FAPI-34的IC50值为6.9 nM（图1），通过竞争实验评估（图2B）。相比之下，99mTc-FAPI-27（≤12.94%±0.77%）、99mTc-FAPI-28（≤37.52%±1.62%）、99mTc-FAPI-29（≤39.34%±1.01%）和99mTc-FAPI-43（≤28.83%±0.88%）暴露于HT-1080-FAP细胞4小时后的结合率较低（图2A）。此外，竞争实验显示这些衍生物对FAP的亲和力略有降低，FAPI-29的IC50值为12.0 nM， FAPI-28的IC50值为12.7 nM（图1）。

99mtc标记的FAPI衍生物的体内靶向特性和药代动力学[2]
为了比较FAPI-28、-29、-33、-34和-43与FAPI-19的体内靶向特性和药代动力学，我们在ht -1080- fap异种移植小鼠体内进行了生物分布实验。扫描图像显示FAPI衍生物的药代动力学有所改善。与FAPI-19比较(图3A；补充图3A)，在注射化合物后60分钟观察到肿瘤病变中的放射性积累和肝胆排泄比例的减少，并持续到至少120分钟（图3A）。99mTc-FAPI-34在小鼠的肝脏、胆管和肠道中摄取最低，在肿瘤病变中摄取显著(图3A；补充图3B)，通过同时注射未标记的类似物来防止这种情况，并证实了该化合物的靶特异性（图3B）。 [2]
根据这些结果，99mTc-FAPI-34的生物分布实验显示，在注射示踪剂后1和4小时，肿瘤摄取分别为5.4±2.05和4.3±1.95% ID/g，肝脏摄取分别为0.91±0.25和0.73±0.18% ID/g（图4A）。除肾脏外，在异种移植物的血液和器官中检测到的FAPI-34活性低于1% ID/g，占肿瘤与组织的比例大于1（图4B）。相比之下，我们在注射示踪剂后1和4小时测得99mTc-FAPI-29（2.79±1.19和1.43±1.13 %ID/g）和99mTc-FAPI-43（2.41±0.34和2.57±0.32% ID/g）的肿瘤摄取较低（补充图4）。然而，这些衍生物的肝脏摄取分别在1和4小时后从0.63±0.06增加到1.73±1.33 %ID/g （FAPI-29）或从1.74±0.28略微下降到1.56±0.03 %ID/g （FAPI-43）。综上所述，99mTc-FAPI-34在异种移植物中提供了最佳的药代动力学，因此可用于临床显像和SPECT。

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FAPI-34在人肿瘤中的积累[2]
2例转移性卵巢癌和胰腺癌患者接受了68Ga-FAPI-46的PET和90Y-FAPI-46作为最后一线治疗，99mTc-FAPI-34的显像或SPECT。转移性卵巢癌患者于2018年7月7日行68Ga-FAPI-46 PET/CT检查，并于2018年7月25日行6gbq 90Y-FAPI-46治疗。2018年9月19日使用99mTc-FAPI-34进行治疗随访，病情稳定。该胰腺癌患者于2018年6月接受了FAPI治疗。99mTc-FAPI-34荧光显像进行随访。扫描后1天，用6 GBq 90Y-FAPI-46进行另一次治疗。治疗是用90Y进行的，因为当时没有188Re。6周后，随访FAPI-46 PET/CT成像。在这两种情况下，都可以看到肿瘤病变(图5和6；补充图5和图6)。虽然在动物实验中发现了胆道分泌物进入肠道的证据，但在这些患者中没有发现这种情况。

细胞培养[2]
用稳定转染人FAP基因（HT-1080-FAP）的HT-1080细胞，以及转染小鼠FAP基因（HEK-muFAP）和人CD26 （HEKCD26）的人胚胎肾细胞来评价99mtc标记的FAPI衍生物的结合特性。细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco修饰Eagle培养基中培养，温度37℃，二氧化碳5%。[2]
放射性配体结合研究如前所述进行。简而言之，将重组细胞接种于6孔板中，培养48 h，最终汇合率约为80%-90%（每孔1.2-2 × 106个细胞）。用1 mL不含胎牛血清的新鲜培养基代替培养基。将放射性标记的化合物加入细胞培养中，孵育10至240分钟不等。竞争实验通过同时暴露于未标记（10−5-10 M）和放射性标记的化合物60分钟进行。在所有实验中，细胞用1ml pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，随后用1.4 mL裂解缓冲液（0.3 M NaOH， 0.2%十二烷基硫酸钠）裂解。[2]
在内化实验中，细胞与放射性标记的化合物在37℃下孵育60和240 min。从细胞中去除培养基，用1ml磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，终止细胞摄取。随后，将细胞与1ml甘氨酸-盐酸（1m, pH 2.2）在室温下孵育10分钟，以收获表面结合的肽（甘氨酸部分）。之后，用2ml的冷冻磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，并按（4,5,11）所述进行裂解，以确定内化（裂解）部分。在Wizard γ-计数器 中测定放射性，归一化为1 × 106个细胞，并以施加剂量的百分比计算。每个实验进行3次，每个独立实验进行3次重复。[2]

动物实验[2]
在体内实验中，将5 × 10⁶个HT-1080-FAP细胞皮下接种到8周龄BALB/c裸鼠右侧躯干。当肿瘤体积达到约1 cm³时，经尾静脉注射放射性标记化合物（小动物成像使用2–5 MBq溶于100 μL 0.9%生理盐水，器官分布实验使用1 MBq溶于100 μL 0.9%生理盐水）。对于器官分布实验，分别在示踪剂注射后1小时和4小时或不同时间点（30分钟至24小时）处死动物（每个时间点n = 6或3）。使用γ计数器（Cobra Autogamma；Packard）测量所有解剖器官和血液中的放射性分布。结果以每克组织注射剂量百分比（%ID/g）表示。使用γ相机（γ成像仪）获取闪烁显像图像，每幅图像的记录时间为10分钟。在体内阻断实验中，于注射前将30 nmol未标记的FAPI直接加入放射性标记化合物中。[2]
所有动物实验均符合德国动物保护法（许可号35-91185.81/G-158/15）。

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闪烁显像和SPECT/CT成像[2]
患者根据德国药品法第13(2b)条的规定，签署了书面知情同意书，同意接受FAPI PET/CT、FAPI治疗和FAPI闪烁显像。所有患者均由其肿瘤科医生转诊进行实验性诊断，这些肿瘤科医生面临着无法通过标准诊断手段充分解决的未解决的诊断难题。数据经当地伦理委员会批准（批准号S016/2018）后进行回顾性分析。 [2]
99mTc-FAP-34 通过静脉导管以推注方式给药，剂量为 660 MBq，并经过无菌过滤系统。分别于给药后 10 分钟、1 小时、4 小时和 20 小时进行全身平面闪烁显像，并在给药后 4 小时进行双床位 SPECT/CT 检查。[2]
闪烁显像采用低能高分辨率准直系统，采集时间为每 15 cm 身高 1 分钟，矩阵大小为 1025 × 256。SPECT 扫描在 Infinia 扫描仪系统上进行，矩阵大小为 128 × 128，放大倍数为 1，步进扫描，每步 30 秒，在 128 × 128 矩阵中以 3° 角切割采集 120 幅图像。对于 FAPI-34 成像，进行 4 层低剂量 CT 扫描（作为 SPECT/CT 的一部分）以进行衰减校正和 FAPI 阳性病灶的大致定位。[2]
PET/CT 成像在 Biograph mCT Flow 扫描仪上进行。在进行非增强低剂量 CT 扫描（130 keV，30 mAs，CareDose；使用软组织重建核重建至 5 mm 层厚）后，使用 FlowMotion 软件以三维模式（矩阵，200 × 200）采集 PET 图像。发射数据经过随机散射、散射和衰减校正。重建采用有序子集期望最大化算法，迭代 2 次，子集数为 21，并进行高斯滤波，横轴分辨率为 5 mm（半高全宽）。衰减校正使用非增强低剂量 CT 数据进行。 FAPI-46 的合成和标记方法如前所述。68Ga-FAPI-46 (11) 检查的注射剂量为 260 MBq，PET 扫描于注射后 1 小时开始。在示踪剂注射前 15 分钟至注射后 30 分钟，向患者输注 500 mL 含 20 mg 呋塞米的生理盐水。检查结束后 30 分钟，要求患者自行报告任何副作用。

[1]. Fap inhibitor. WO2019154886A1.

肿瘤的生长和扩散不仅取决于癌细胞，还取决于恶性病变中的非恶性成分，这些成分统称为间质。在伴有促纤维增生反应的肿瘤（例如乳腺癌、结肠癌和胰腺癌）中，间质可能占肿瘤体积的90%以上。特别是，一种称为癌相关成纤维细胞（CAFs）的成纤维细胞亚群，已知参与肿瘤的生长、迁移和进展。因此，这些细胞是诊断和抗肿瘤治疗的理想靶点。CAFs的一个显著特征是表达丝氨酸蛋白酶或成纤维细胞活化蛋白α（FAP-α），它是一种II型膜结合糖蛋白，属于二肽基肽酶4（DPP4）家族。FAP-α同时具有二肽基肽酶活性和内肽酶活性。内肽酶活性使FAP-α区别于DPP4家族的其他成员。目前已知的内肽酶活性底物包括变性I型胶原、α1-抗胰蛋白酶和多种神经肽。FAP-α在胚胎发生和组织重塑等正常发育过程中发挥作用。它在成人正常组织中表达量极低或几乎不表达。然而，在伤口愈合、关节炎、动脉粥样硬化斑块、纤维化以及超过90%的上皮癌中，FAP-α均高表达。FAP-α在许多上皮肿瘤的癌相关成纤维细胞（CAFs）中出现，且其过表达与癌症患者预后不良相关，这些都促使人们提出假设：FAP-α活性参与癌症的发生发展以及癌细胞的迁移和扩散。因此，以该酶为靶点进行成像和内放射治疗可被视为一种检测和治疗恶性肿瘤的有效策略。本发明人开发了一种基于FAP-a特异性抑制剂的小分子，并在动物模型和肿瘤患者中均证实了其对肿瘤的特异性摄取、快速内化和成功成像。与常用的放射性示踪剂18F-氟代脱氧葡萄糖（18F-FDG）相比，该新型FAP-a配体在局部晚期肺腺癌患者中表现出明显的优势。因此，本发明尤其能够：（i）检测更小的原发肿瘤，从而实现早期诊断；（ii）检测更小的转移灶，从而更准确地评估肿瘤分期；（iii）提供精确的术中引导，有助于完整切除肿瘤组织；（iv）更好地区分炎症组织和肿瘤组织；（v）更精确地对肿瘤患者进行分期；（vi）更好地随访抗肿瘤治疗后的肿瘤病灶；（vii）将该分子用作诊疗一体化试剂，用于诊断和治疗。此外，这些分子还可用于诊断和治疗慢性炎症、动脉粥样硬化、纤维化、组织重塑和瘢痕疙瘩等非恶性疾病。[1]

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大多数上皮肿瘤会募集成纤维细胞和其他非恶性细胞，并将其激活为癌相关成纤维细胞。这通常会导致膜丝氨酸蛋白酶成纤维细胞激活蛋白 (FAP) 的过度表达。已有研究表明，含 DOTA 的 FAP 抑制剂 (FAPI) 可在 PET/CT 扫描中生成高对比度图像。由于 SPECT 是 PET 的一种成本更低、应用更广泛的替代方案，因此 99mTc 标记的 FAPI 有望成为更多患者成像应用的理想示踪剂。此外，化学同源核素 188Re 可从发生器中获得，这使得 FAP 靶向内放射治疗成为可能。方法：为制备99mTc-三羰基配合物，我们选择了一种螯合剂，其羧酸基团易于转化为最终产物中的多种衍生物，从而实现基于原始示踪剂的平台策略。我们通过在FAP转染的HT-1080细胞（HT-1080-FAP）或表达小鼠FAP（HEK-muFAP）和CD26（HEKCD26）的HEK细胞上进行结合和竞争实验，对所得99mTc配合物进行了体外研究，并通过平面闪烁显像和荷瘤小鼠的器官分布研究对其进行了表征。此外，我们还分别在两名卵巢癌和胰腺癌患者中进行了首次人体应用。结果：99mTc-FAPI-19对重组FAP表达细胞表现出高亲和力的特异性结合。遗憾的是，在HT-1080-FAP异种移植小鼠的平面闪烁显像中未观察到肝脏蓄积、胆汁排泄，也未观察到肿瘤摄取。为了改善其药代动力学性质，研究人员将亲水性氨基酸连接到化合物的螯合剂部分。所得的99mTc标记的FAPI示踪剂在生物分布研究中显示出优异的结合特性（结合率≤45%；内化率>95%）、高亲和力（半数抑制浓度为6.4–12.7 nM）和显著的肿瘤摄取（每克组织≤5.4%的注射剂量）。先导候选药物99mTc-FAPI-34被应用于转移性卵巢癌和胰腺癌患者的诊断性闪烁显像和SPECT检查，用于90Y-FAPI-46治疗后的随访。 99mTc-FAPI-34 在肿瘤病灶中积聚，这在使用 68Ga-FAPI-46 进行的 PET/CT 成像中也得到了证实。结论：99mTc-FAPI-34 是一种强效的诊断性闪烁显像示踪剂，尤其适用于 PET 成像不可用的情况。此外，该化合物中使用的螯合剂可用于标记治疗性核素 188Re，这在不久的将来有望实现。[2]

C50H57F2N13O18

1166.06

1165.391

2374782-07-5

156060696

White to light yellow solid powder

-6.5

440

9

26

30

83

2330

3

N1(CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C(=O)O)C(=O)O)C(CN(CC(=O)N2CCN(CCCOC3=CC=C4C(=C3)C(C(=O)NCC(=O)N3CC(F)(C[C@H]3C#N)F)=CC=N4)CC2)CC2N(CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C(=O)O)C(=O)O)C=CN=2)=NC=C1

FPOZMWSPTRNDPQ-UVXHQIPUSA-N

InChI=1S/C50H57F2N13O18/c51-50(52)19-28(20-53)65(27-50)41(68)21-57-43(70)30-4-5-54-34-3-2-29(16-31(30)34)83-15-1-8-60-11-13-62(14-12-60)42(69)26-61(22-37-55-6-9-63(37)24-39(66)58-35(48(79)80)17-32(44(71)72)45(73)74)23-38-56-7-10-64(38)25-40(67)59-36(49(81)82)18-33(46(75)76)47(77)78/h2-7,9-10,16,28,32-33,35-36H,1,8,11-15,17-19,21-27H2,(H,57,70)(H,58,66)(H,59,67)(H,71,72)(H,73,74)(H,75,76)(H,77,78)(H,79,80)(H,81,82)/t28-,35-,36-/m0/s1

(3S)-3-[[2-[2-[[[2-[4-[3-[4-[[2-[(2S)-2-cyano-4,4-difluoropyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]carbamoyl]quinolin-6-yl]oxypropyl]piperazin-1-yl]-2-oxoethyl]-[[1-[2-oxo-2-[[(1S)-1,3,3-tricarboxypropyl]amino]ethyl]imidazol-2-yl]methyl]amino]methyl]imidazol-1-yl]acetyl]amino]propane-1,1,3-tricarboxylic acid

FAPI-34; 2374782-07-5; SCHEMBL22966423;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 50 mg/mL (42.88 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (4.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (4.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。