ULK-101

ULK1 (IC50 = 1.6 nM); ULK2 (IC50 = 30 nM)
ULK-101 targets ULK1 and ULK2, which are serine/threonine protein kinases that serve as key regulators of autophagy initiation. ULK1 is the primary kinase responsible for initiating autophagy in response to nutrient deprivation and other cellular stresses. By inhibiting ULK1 with an IC₅₀ of 8.3 nM and ULK2 with an IC₅₀ of 30 nM, ULK-101 effectively suppresses autophagy induction and autophagic flux, leading to disruption of cellular homeostasis and increased sensitivity to stress conditions.

ULK-101 (0-5 μM) 以浓度依赖的方式抑制 U2OS 细胞中 BafA1 诱导的 LC3B-II 积累[1]。

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• 与 SBI-0206965 相比，ULK-101 具有更高的效力和选择性。[1]
• ULK-101 抑制自噬小泡的成核和周转。[1]
• ULK-101 使 KRAS 驱动的肺癌细胞对营养限制更加敏感。[1]
• ULK-101 是研究 ULK1 和自噬功能的重要分子工具。[1]

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体外实验表明，ULK-101 能有效抑制 ULK1（IC₅₀ 为 8.3 nM）和 ULK2（IC₅₀ 为 30 nM）。该化合物可抑制不同刺激诱导的自噬和自噬通量。ULK-101 可增强 KRAS 突变型肺癌细胞对营养胁迫的敏感性，表明自噬抑制可增强癌细胞对代谢胁迫的脆弱性。该化合物对 ULK1 具有选择性，优于其他激酶。

ULK-101的体内活性数据有限。基于其在体外对ULK1/ULK2的强效抑制作用以及增强KRAS突变型肺癌细胞对营养胁迫敏感性的能力，该化合物有望在KRAS突变型癌症动物模型中展现抗肿瘤疗效。ULK1抑制剂的典型体内研究包括对荷瘤小鼠模型进行给药，并评估肿瘤生长抑制情况和自噬标志物。

激酶活性测定和IC50值计算[1]
ULK1和ULK2的IC50数据采用10点IC50Profiler测定法生成，从10 μM（4个重复）和1 μM（4个重复）的最高浓度开始进行半对数稀释，从而在曲线的大多数浓度范围内获得8个数据点。为了进行选择性分析，使用野生型人激酶组进行KinaseProfiler测定，每个浓度重复两次，分别使用500 nM SBI-0206965、40 nM ULK-101或15 nM ULK-100。对于每个激酶反应，均使用ATP的Km浓度。剩余活性百分比和抑制百分比由阴性对照孔计算得出。对于选择性分析，相对抑制率通过将每种激酶的抑制百分比除以ULK1的抑制百分比来计算。使用 GraphPad Prism 7 软件，通过拟合具有可变斜率（四参数）非线性回归模型的曲线来测定 IC50 值，其中上限和下限约束分别为 100% 和 0%。

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对于非细胞体外酶活性测定，评估 ULK-101 对纯化的 ULK1 和 ULK2 激酶的抑制活性。将该化合物与 ULK1 或 ULK2、ATP 和底物肽在激酶缓冲液中孵育。使用放射性标记、荧光或基于抗体的检测方法测量底物的磷酸化水平。根据剂量反应曲线确定 IC₅₀ 值，ULK1 的 IC₅₀ 值为 8.3 nM，ULK2 的 IC₅₀ 值为 30 nM。

免疫印迹[1]
细胞在冰冷的裂解缓冲液[10 mM KPO4、1 mM EDTA、10 mM MgCl2、5 mM EGTA、50 mM 甘油二磷酸、0.5% NP40、0.1% Brij35、0.1% 脱氧胆酸钠、1 mM NaVO4、5 mM NaF、2 mM DTT 和完全蛋白酶抑制剂]中裂解，蛋白质通过 SDS-PAGE 电泳分离。图 1 使用手工灌注的 10% 丙烯酰胺凝胶，所有其他印迹均使用预制 BOLT 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶。蛋白质转移至硝酸纤维素膜（LC3 印迹使用 PVDF 膜），并在 4°C 下与一抗孵育过夜，然后在室温下与二抗孵育 1 小时。蛋白质通过增强化学发光法检测（图 1C），或在 Odyssey Classic 或 Odyssey Clx 成像仪上成像和定量（用于所有其他印迹）。

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荧光显微镜[1]
通过用表达该质粒的逆转录病毒转导细胞并筛选低表达单克隆，构建了单克隆 U2OS-EGFP-DFCP1 细胞系。将细胞以每孔 20,000 个的密度接种于 4 孔 35 mm 1.5 号玻璃底培养皿中，培养 24 小时。更换培养基后，用 5 μM ULK101（或 DMSO 对照）和 100 nM AZD8055（或 DMSO 对照）处理细胞。使用配备笼式培养箱的 Nikon Ti Eclipse 显微镜，在 37°C、5% CO2 湿润条件下，每 30 分钟在 FITC 通道采集一次图像。为了进行定量分析，使用NIS Elements软件对图像进行反卷积、平滑、顶帽变换（“检测峰值”功能）和阈值处理（按强度），以获得每个细胞中DFCP1阳性物体的数量。对于图4C，将稳定表达ptfLC3B的U2OS细胞接种于24孔板中1.5号盖玻片上，培养约48小时。细胞用5 μM ULK-101（或DMSO对照）处理3小时。1.5小时后，培养基中加入100 nM BafA1（或等体积的DMSO）。然后用4%甲醛固定细胞，并用Hoechst-33342对细胞核进行染色。在FITC（绿色）和DAPI（蓝色）通道中对细胞进行成像。为了进行定量分析，使用 NIS Elements 对图像进行反卷积、顶帽变换（“检测峰值”功能）和阈值处理（按强度），以获得每个细胞中 GFP-LC3 阳性物体的数量。

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ATG12 免疫荧光[1]
将 U2OS 细胞用 100 nM AZD8055 或等体积的 DMSO 处理 2.5 小时，处理组加入或不加入 5 μM ULK-101（或 DMSO 对照）。细胞用 4% 甲醛固定，用 0.2% Triton-X100 的 1×DPBS 溶液进行透化，用 3% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 5% 山羊血清的 1×DPBS 溶液封闭，并在 4°C 下用抗 ATG12 抗体（用封闭缓冲液 1:100 稀释）染色过夜。随后，将细胞与AF488标记的二抗（1:1000稀释）在室温下孵育1小时，用Hoechst-33342对细胞核进行复染，并将盖玻片倒置于载玻片上，盖玻片上涂抹了封片剂。使用Nikon Ti Eclipse显微镜，在FITC（绿色）和DAPI（蓝色）通道下，用60倍油镜对细胞进行成像。每个条件下成像30-50个细胞，代表性图像如图3C所示。

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克隆形成存活率测定[1]
将细胞（U2OS或NSCLC）以每孔1000个细胞的密度接种于经组织培养处理的96孔板中，培养基为添加10% FBS的RPMI-1640培养基。 24小时后，吸出培养基，用1×DPBS冲洗孔板，然后更换为完全培养基（FM）或含有不同浓度梯度ULK-101（终浓度分别为100 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM、6.25 μM、3.1 μM、1.6 μM、0.8 μM、0.4 μM或0 μM）的Optistarve培养基（OS）。两天后，吸出培养基（以及ULK-101），用1×DPBS冲洗孔板，并将所有孔板更换为完全培养基（FM）。五天后，按照制造商的说明，使用CellTiter-Glo发光法测定相对ATP水平。

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对于体外细胞实验，ULK-101在多种细胞系中进行了测试，特别是KRAS突变型肺癌细胞。将细胞用化合物进行系列稀释处理，并通过Western blot检测LC3-II和p62的水平来评估自噬。在正常和营养匮乏条件下检测细胞活力，以评估该化合物增强细胞对营养胁迫敏感性的能力。该化合物在DMSO中的溶解度为70-84 mg/mL。

在体内动物研究中，ULK-101 通常会在 KRAS 突变型肺癌的异种移植小鼠模型中进行评估。将已建立肿瘤的小鼠通过腹腔注射或口服途径给予不同剂量的化合物治疗。定期测量肿瘤体积，并在研究终点评估肿瘤组织中的自噬标志物。同时监测小鼠的体重和总体健康状况以评估其耐受性。

ULK-101的药代动力学数据有限。作为一种分子量为460.45的小分子激酶抑制剂，预计其口服生物利用度和组织分布中等。该化合物可溶于DMSO，便于配制成体内给药制剂。粉末可在-20°C下保存长达3年，或在4°C下保存2年；溶剂配制的储备液可在-80°C下保存6个月。需要进一步的药代动力学研究来全面表征其ADME特性。

ULK-101的毒理学数据有限。作为一种抑制自噬的ULK1/ULK2抑制剂，该化合物可能具有靶向毒性，这与自噬在维持细胞稳态中的关键作用有关。开发其治疗用途需要进行全面的毒理学研究。该化合物仅供研究使用，不得用于人体。

[1]. A Potent and Selective ULK1 Inhibitor Suppresses Autophagy and Sensitizes Cancer Cells to Nutrient Stress. iScience. 2018 Oct 26;8:74-84.

癌细胞通过一种称为自噬的细胞周期生成营养物质和能量，以应对压力，从而促进细胞存活和肿瘤进展。因此，抑制自噬已成为一种潜在的癌症治疗策略。针对ULK1（早期自噬的重要调节因子）的抑制剂已展示了通过靶向该激酶抑制自噬的概念；然而，这些抑制剂在效力、选择性和细胞活性方面存在局限性。本研究报告了两种小分子ULK1抑制剂ULK-100和ULK-101，并证明它们的效力和选择性优于一种已知的已发表抑制剂。此外，我们发现ULK-101可以抑制不同刺激诱导的自噬和自噬通量。最后，我们使用ULK-101证明ULK1抑制增强了KRAS突变肺癌细胞对营养压力的敏感性。ULK-101是研究自噬在癌细胞中作用和评估自噬抑制治疗潜力的强大分子工具。[1]

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自噬是一种保守的回收过程，已成为癌基因和肿瘤抑制基因的关键效应因子，以及癌细胞命运的强大调节因子（Liu和Ryan，2012；Rosenfeldt和Ryan，2009）。尽管自噬是通过30多种蛋白的协同作用完成的，但只有少数酶具有明确的药物靶向潜力。ULK1就是其中之一，由于其在自噬途径中的关键早期作用，吸引了很多关注。本文介绍了一种高效且选择性强的ULK1抑制剂ULK-101，并证明其能够抑制人类细胞中的自噬。[1]
ULK-101是自2015年以来报告的至少六种ULK1抑制剂之一。Shokat实验室开发了一系列靶向ULK1的化合物，尽管这些化合物在细胞中的选择性和效力有限，但它们为ULK1的结构提供了有价值的见解（Lazarus等，2015；Lazarus和Shokat，2015）。通过挖掘药物数据以识别对ULK1活性的化合物，发现了另外两种值得注意的抑制剂，类似于我们的方法。SBI-0206965是从FAK抑制剂开发而来的，已被证明能降低细胞中Beclin 1 Ser15的磷酸化水平（Egan等，2015）。该化合物被报道为选择性，主要基于大规模竞争结合实验；然而，我们使用体外激酶活性测定的直接比较显示，ULK-101的选择性显著高于SBI-0206965。MRT68921源自TBK1抑制剂，能有效抑制体外ULK1并强烈抑制自噬；1 μM的MRT68921阻止了营养缺乏的小鼠胚胎成纤维细胞中BafA1诱导的LC3-II积累（Petherick等，2015）。尽管作者筛选了80种其他激酶以测试MRT68921的抑制活性，但很难比较MRT68921和ULK-101的选择性特征。ULK-101筛选了327种激酶。值得注意的是，MRT68921与AMPK交叉反应，这可能由于AMPK信号通路的广泛肿瘤抑制功能而带来治疗风险。有趣的是，尽管体外实验表明ULK-100也抑制AMPK，但ULK-101并未抑制AMPK（表S1）。最后，一项使用计算机筛选和结构-活性关系分析的研究识别了一些有效的吲哚并ULK1抑制剂，但它们在细胞中的选择性和活性仍待确定（Wood等，2017）。[1]
自噬领域一个主要未解决的问题是，在什么遗传和环境背景下自噬促进肿瘤生长并成为治疗靶点。在这里，我们使用ULK-101证明营养压力细胞可能对ULK1抑制特别敏感。同样，SBI-0206965也被发现增加了营养缺乏细胞或通过化学方法抑制mTORC1的细胞的死亡（Egan等，2015）。这些发现与其他研究一致，表明自噬抑制在营养缺乏细胞中尤其有效（Eng等，2016；Guo等，2016）。总之，这表明，由于快速肿瘤生长造成的营养耗竭可能使细胞对自噬抑制特别脆弱。最后，尽管我们发现携带致癌KRAS的几种肺癌细胞系对ULK-101敏感，但仍需进一步研究以全面确定靶向ULK1和自噬的有效性背后的遗传背景。[1]
研究限制：对开发能够调节人类疾病基本机制（包括自噬）的新疗法的兴趣日益增长。尽管取得了令人鼓舞的进展，但在基础研究之外，仅开发了少数针对自噬的化合物。因此，我们的目标是将这些自噬抑制剂推进到临床前开发阶段。ULK-100和ULK-101在体外研究中显示出良好的结果，但这些化合物在进入临床前试验之前需要进一步的体内验证。此外，靶向ULK1的治疗机制可能并不适用于所有遗传或环境背景，因此需要进一步研究以确定在何种条件下该策略最为有效。

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ULK-101是ULK1和ULK2的强效选择性抑制剂，其IC₅₀值分别为8.3 nM和30 nM。该化合物抑制自噬诱导和自噬流在不同刺激下的反应，并使KRAS突变的肺癌细胞对营养压力更加敏感。ULK-101选择性针对ULK1，分子量为460.45，分子式为C₂₂H₁₆F₄N₄OS。

C22H16F4N4OS

460.45

460.098

C, 57.39; H, 3.50; F, 16.50; N, 12.17; O, 3.47; S, 6.96

2443816-45-1

137628686

Light yellow to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.684

3.38

87.5Ų

1

8

5

32

685

1

C1CC1[C@@H](C(F)(F)F)NC(=O)C2=CC(=CS2)C3=C4N=CC(=CN4N=C3)C5=CC=C(C=C5)F

PFZRXJIYAFANHP-IBGZPJMESA-N

InChI=1S/C22H16F4N4OS/c23-16-5-3-12(4-6-16)15-8-27-20-17(9-28-30(20)10-15)14-7-18(32-11-14)21(31)29-19(13-1-2-13)22(24,25)26/h3-11,13,19H,1-2H2,(H,29,31)/t19-/m0/s1

N-[(1S)-1-cyclopropyl-2,2,2-trifluoroethyl]-4-[6-(4-fluorophenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]thiophene-2-carboxamide

ULK-101; 2443816-45-1; (S)-N-(1-cyclopropyl-2,2,2-trifluoroethyl)-4-(6-(4-fluorophenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)thiophene-2-carboxamide; N-[(1S)-1-Cyclopropyl-2,2,2-trifluoroethyl]-4-[6-(4-fluorophenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]thiophene-2-carboxamide; ULK101; CHEMBL4744680; SCHEMBL25395801; EX-A4693;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 83.33 mg/mL (180.98 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。