ULK-101

ULK1 (IC50 = 1.6 nM); ULK2 (IC50 = 30 nM)

ULK-101 (0-5 μM) 以浓度依赖性方式抑制 U2OS 细胞中 BafA1 诱导的 LC3B-II 积累[1]。

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•与SBI-0206965相比，ULK-101具有更高的效价和选择性。[1]
•ULK-101抑制自噬囊泡的成核和周转。[1]
•ULK-101使kras驱动的肺癌细胞对营养限制敏感。[1]
•ULK-101是研究ULK1与自噬功能的重要分子工具。[1]

激酶活性检测和IC50计算[1]
ULK1和ULK2的IC50数据使用10点IC50Profiler分析，在最高浓度为10 μM(4个重复)和1 μM(4个重复)时进行半对数稀释，曲线上大多数浓度为8个数据点。为了进行选择性分析，使用500 nM SBI-0206965、40 nM ULK-101或15 nM ULK-100对KinaseProfiler进行了两份野生型人激酶检测。对于每个激酶反应，使用ATP的Km浓度。从阴性对照井中计算剩余活性百分比和抑制百分比。对于选择性分析，通过将每个激酶的抑制百分比除以ULK1的抑制百分比来计算相对抑制。GraphPad Prism 7采用变斜率(四参数)非线性回归模型拟合曲线，分别采用100%和0%的上限和下限约束进行IC50测定。

免疫印迹[1]
细胞在冷冻裂解缓冲液中裂解[10 mM KPO4, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 50 mM双甘油磷酸，0.5% NP40, 0.1% Brij35, 0.1%脱氧胆酸钠，1 mM NaVO4, 5 mM NaF, 2 mM DTT和完全蛋白酶抑制剂]，并通过SDS-PAGE分解蛋白质。图1使用手工浇注的10%丙烯酰胺凝胶，所有其他印迹使用预铸的BOLT 4-12% Bis-Tris Plus凝胶。将蛋白转移到硝化纤维素膜上(LC3印迹用PVDF膜)，用一抗在4°C下过夜，然后在室温下用二抗检测1小时。通过增强化学发光检测蛋白质(图1C)，或在Odyssey Classic或Odyssey Clx成像仪上成像和定量(所有其他印迹)。

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荧光显微镜[1]
通过逆转录病毒转染表达该质粒的细胞，选择低表达的单克隆，获得了U2OS-EGFP-DFCP1单克隆细胞系。4室35 mm no，每室2万个细胞。1.5玻璃底皿，24小时。补充培养基，并用5 μM ULK101(或DMSO对照)和100 nM AZD8055(或DMSO对照)处理细胞。使用尼康Ti Eclipse显微镜在FITC通道中每隔30分钟采集一次图像，并将其封闭在笼式培养箱中，并在37°C下保持，加湿5% CO2。为了量化，使用NIS Elements对图像进行反卷积、平滑、顶帽变换(“检测峰”函数)和阈值(根据强度)，以获得每个细胞中dfcp1阳性对象的数量。在图4C中，稳定表达ptfLC3B的U2OS细胞在no. 2上接种约48小时。在24孔皿中放置1.5个玻璃片。细胞用5 μM ULK-101(或DMSO对照)处理3小时。1.5小时后，培养基中添加100 nM BafA1(或等量DMSO)。细胞用4%甲醛固定，细胞核用Hoechst-33342染色。细胞在FITC(绿色)和DAPI(蓝色)通道成像。为了定量，使用NIS Elements对图像进行反卷积、顶帽变换(“检测峰”函数)和阈值(按强度)，以获得每个细胞gfp - lc3阳性物体的数量。

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ATG12免疫荧光[1]
用100 nM AZD8055或体积相当的DMSO加或不加5 μM ULK-101(或DMSO对照)处理U2OS细胞2.5小时。细胞用4%甲醛固定，用0.2% tritonx100在1xDPBS中渗透，用3%牛血清白蛋白(BSA)和5%山羊血清在1xDPBS中阻断，用抗atg12抗体(在阻断缓冲液中稀释1:100)在4°C下染色过夜。然后用af488结合的二抗(1:1000)在室温下染色1小时，细胞核用Hoechst-33342反染，盖玻片倒置到凝胶载玻片上。在尼康Ti Eclipse显微镜上，用60倍油物镜在FITC(绿色)和DAPI(蓝色)通道中对细胞进行成像。每种情况下对30-50个细胞进行成像，代表性图像如图3C所示。

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克隆生存试验[1]
将细胞(U2OS或NSCLC)接种于组织培养处理过的96孔板上，每孔1000个细胞，接种于添加10%胎牛血清的rmi -1640培养基上。24小时后，抽吸培养基，用1倍DPBS冲洗孔，并用ULK-101浓度梯度(终浓度为100 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM、6.25 μM、3.1 μM、1.6 μM、0.8 μM、0.4 μM或0 μM)的全培养基(FM)或Optistarve (OS)代替。两天后，抽吸培养基(和ULK-101)，用1倍DPBS冲洗孔，所有孔都用FM代替。五天后，根据制造商的说明，使用发光细胞滴度- glo测定相对ATP水平

[1]. A Potent and Selective ULK1 Inhibitor Suppresses Autophagy and Sensitizes Cancer Cells to Nutrient Stress. iScience. 2018 Oct 26;8:74-84.

癌细胞在应激反应中会通过一种称为自噬的细胞循环过程产生营养物质和能量，从而促进细胞存活和肿瘤进展。因此，抑制自噬已成为一种潜在的癌症治疗策略。靶向ULK1（一种重要的早期自噬调节因子）的抑制剂已证实了靶向该激酶抑制自噬的概念；然而，这些抑制剂在效力、选择性或细胞活性方面均存在局限性。本研究报道了两种小分子ULK1抑制剂ULK-100和ULK-101，并证实其效力和选择性优于一种已发表的知名抑制剂。此外，我们发现ULK-101能够抑制不同刺激诱导的自噬和自噬通量。最后，我们利用ULK-101证明，ULK1抑制能够增强KRAS突变型肺癌细胞对营养应激的敏感性。 ULK-101 是一种强大的分子工具，可用于研究自噬在癌细胞中的作用，并评估自噬抑制的治疗潜力。[1]

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自噬是一种保守的回收过程，已成为癌基因和抑癌基因的关键效应因子，也是癌细胞命运的强效调控因子（Liu 和 Ryan，2012；Rosenfeldt 和 Ryan，2009）。尽管自噬是由 30 多种蛋白质协同作用完成的，但只有少数几种酶具有明确的药物靶向潜力。ULK1 就是其中之一，由于其在自噬通路中发挥着至关重要的早期作用，因此作为小分子靶点备受关注。本文介绍了一种高效且选择性的ULK1抑制剂ULK-101，并证实了其在人类细胞中抑制自噬的能力。[1]
ULK-101是自2015年以来报道的至少六种ULK1抑制剂之一。Shokat实验室开发了一系列靶向ULK1的化合物，尽管这些化合物在细胞中的选择性和效力有限，但它们为ULK1的结构提供了宝贵的见解（Lazarus等人，2015；Lazarus和Shokat，2015）。通过挖掘药物数据寻找对ULK1具有活性的化合物，发现了另外两种值得关注的抑制剂，这与我们的方法类似。SBI-0206965由FAK抑制剂开发而来，并被证明可以降低细胞中Beclin 1 Ser15的磷酸化水平（Egan等人，2015）。据报道，该化合物具有选择性，这主要基于大规模竞争性结合实验；然而，我们利用体外激酶活性测定进行的直接比较发现，ULK-101 的选择性远高于 SBI-0206965。MRT68921 源自 TBK1 抑制剂，在体外能有效抑制 ULK1，并能强烈抑制细胞自噬，1 μM 的 MRT68921 即可阻断营养匮乏的小鼠胚胎成纤维细胞中 BafA1 诱导的 LC3-II 积累（Petherick 等，2015）。尽管作者筛选了 80 种其他激酶以检测 MRT68921 的抑制活性，但很难比较 MRT68921 和 ULK-101 的选择性谱。ULK-101 筛选了 327 种激酶。值得注意的是，MRT68921 与 AMPK 存在交叉反应，考虑到 AMPK 信号通路广泛的肿瘤抑制功能，这可能构成治疗上的隐患。有趣的是，尽管体外实验表明 ULK-100 也能抑制 AMPK，但 ULK-101 却不抑制 AMPK（表 S1）。最后，一项采用计算机筛选和构效关系分析的研究鉴定出一些有效的吲唑类 ULK1 抑制剂，但它们在细胞中的选择性和活性仍有待确定（Wood 等，2017）。[1]
自噬领域一个尚未解决的主要问题是自噬在何种遗传和环境背景下促进肿瘤生长并成为治疗靶点。在此，我们使用 ULK-101 证明，营养胁迫的细胞可能对 ULK1 抑制特别敏感。类似地，SBI-0206965 也被发现能够增加营养匮乏细胞或经化学方法抑制 mTORC1 的细胞的死亡（Egan 等，2015）。这些发现与其他研究结果一致，即自噬抑制在营养匮乏的细胞中尤其有效（Eng et al., 2016; Guo et al., 2016）。综上所述，这表明肿瘤快速生长导致的营养耗竭可能使细胞对自噬抑制产生独特的脆弱性。最后，尽管我们发现几种携带致癌性KRAS的肺癌细胞系对ULK-101敏感，但仍需进一步研究以充分确定靶向ULK1和自噬有效的遗传背景。[1]
研究局限性：人们对开发能够调节人类疾病基本机制（包括自噬）的新型疗法的兴趣日益浓厚。尽管研究进展令人鼓舞，但只有少数靶向自噬的化合物在基础研究之外得到了开发。因此，我们的目标是推进这些自噬抑制剂进入临床前开发阶段。 ULK-100 和 ULK-101 在体外实验中表现良好，但这些化合物需要进一步的体内验证才能进入临床前试验阶段。此外，以 ULK1 为靶点的治疗机制可能并非在所有遗传或环境背景下都有效，因此需要进一步研究以确定该策略在何种情况下最为有效。

C22H16F4N4OS

460.45

460.098

C, 57.39; H, 3.50; F, 16.50; N, 12.17; O, 3.47; S, 6.96

2443816-45-1

137628686

Light yellow to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.684

3.38

87.5Ų

1

8

5

32

685

1

C1CC1[C@@H](C(F)(F)F)NC(=O)C2=CC(=CS2)C3=C4N=CC(=CN4N=C3)C5=CC=C(C=C5)F

PFZRXJIYAFANHP-IBGZPJMESA-N

InChI=1S/C22H16F4N4OS/c23-16-5-3-12(4-6-16)15-8-27-20-17(9-28-30(20)10-15)14-7-18(32-11-14)21(31)29-19(13-1-2-13)22(24,25)26/h3-11,13,19H,1-2H2,(H,29,31)/t19-/m0/s1

N-[(1S)-1-cyclopropyl-2,2,2-trifluoroethyl]-4-[6-(4-fluorophenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]thiophene-2-carboxamide

ULK-101; 2443816-45-1; (S)-N-(1-cyclopropyl-2,2,2-trifluoroethyl)-4-(6-(4-fluorophenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)thiophene-2-carboxamide; N-[(1S)-1-Cyclopropyl-2,2,2-trifluoroethyl]-4-[6-(4-fluorophenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]thiophene-2-carboxamide; ULK101; CHEMBL4744680; SCHEMBL25395801; EX-A4693;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 83.33 mg/mL (180.98 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。