3-IN-PP1

PKD1 108 nM (IC50) Cellular PKD2 94 nM (IC50) PKD3 108 nM (IC50)
3-IN-PP1 targets protein kinase D (PKD) family members PKD1, PKD2, and PKD3. PKD kinases are serine/threonine kinases that play important roles in various cellular processes including signal transduction, cell proliferation, migration, and survival. By potently inhibiting all three PKD isoforms with IC₅₀ values of 108 nM (PKD1), 94 nM (PKD2), and 108 nM (PKD3), 3-IN-PP1 effectively blocks PKD-mediated signaling pathways in cancer cells.

3-IN-PP1 对 PKD1、PKD2 和 PKD3 均表现出强效的泛 PKD 抑制活性，IC50 值分别为 108、94 和 108 nM[1]。3-IN-PP1（5 μM，0-114 h）对 PANC-1 细胞具有显著的抗增殖作用[1]。3-IN-PP1（20 μM，1 h）可有效抑制 PANC-1 细胞中 PKD 依赖的皮质肌动蛋白磷酸化[1]。 3-IN-PP1 可抑制多种肿瘤细胞的生长，其 IC50 值范围为 1.6 至 39.2 μM[1]。体外实验表明，3-IN-PP1 对 PKD1、PKD2 和 PKD3 具有强效且广谱的抑制活性，其 IC₅₀ 值分别为 108 nM、94 nM 和 108 nM。该化合物是一种广谱抗癌剂，可抑制多种肿瘤细胞的生长。3-IN-PP1 可用于癌症研究，其设计旨在特异性靶向参与细胞信号通路的蛋白激酶。

3-IN-PP1 的体内活性数据有限。基于其强大的体外泛 PKD 抑制活性和广谱抗癌作用，该化合物有望在多种癌症动物模型中展现抗肿瘤疗效。典型的 PKD 抑制剂体内研究包括给荷瘤小鼠模型给药，并评估肿瘤生长抑制情况和 PKD 信号通路生物标志物。

PKD 筛选试验 [1]
采用体外发光法（Promega 公司的 ADP-Glo™）测定 PKD 磷酸化活性。以 Syntide-2 为底物，在浓度为 1 μM 的各种化合物存在下进行初步筛选，并在浓度范围为 10 μM 至 1 nM 的化合物存在下进行 IC50 测定。反应在白色 96 孔平底板（NUNC）中进行，反应体系为 10 μL，包含 50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、10 mM MgCl2、8 nM PDBu 刺激的 FLAG PKD、250 μM Syntide-2 和 10 μM ATP。在 30 °C 下孵育 15 分钟后，终止反应，并按照制造商的方案，加入 ADP-Glo 试剂 I 和 II（比例为 1:1:2，即反应体积：试剂 1：试剂 2）。随后，使用 PerkinElmer Victor X4 多功能酶标仪以每秒计数 (CPS) 为单位测量发光值。PKD 抑制率相对于 DMSO 对照（0.1% DMSO）进行测定。使用 GraphPad Prism 7 软件绘制图表并确定 IC50 值。

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使用磷酸化皮质肌动蛋白作为 PKD 抑制指标的细胞筛选实验 [1]
将 PANC-1 细胞以每组 0.3 × 10⁶ 个细胞的密度接种于 6 孔板中，并使其贴壁。 24小时后，将0.5 μg的pcDNA-FLAG-PRKD1或pcDNA-FLAG-PRKD2以及0.5 μg的pcDNA3-Myc-CTTN以1:3 (m/m)的质粒/PEI比用PEI转染至细胞中。24小时后，用终浓度为20 μM的指定化合物（图3）或DMSO对照处理细胞1小时，随后用250 nM的佛波醇-12,13-二丁酸酯（PDBu）刺激或不刺激15分钟。裂解液为50 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、15 mM EDTA、1% NP-40，并添加了磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。蛋白质定量采用BCA法测定。接下来，将等量的细胞裂解液（10 μg）进行SDS-PAGE电泳分离，然后转移至硝酸纤维素膜上。用5% BSA或5%脱脂奶粉封闭抗体非特异性结合位点。膜上依次用抗Cortactin pSer-298抗体（自制）、抗Myc 9E10抗体和抗FLAG M2抗体进行孵育。最后，膜上依次与相应的HRP标记二抗（山羊抗兔或马抗鼠）孵育。使用Image Studio Lite软件对条带强度进行定量分析。丽春红染色用作上样对照。使用Image Studio Lite软件中锐化工具的默认设置来提高丽春红图像的清晰度。所有实验均重复三次（n = 3）。统计分析采用平均值和标准误（SEM）。采用单因素方差分析（ANOVA）确定与对照组（DMSO）的统计学显著性。使用 GraphPad Prism 7 软件进行统计分析。

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CAMKIIα 和 PKCδ 活性测定 [1]
采用体外放射性测定法测定不同化合物在指定浓度下对 CAMKIIα 和 PKCδ 的抑制作用。反应体系为 40 μL，包含 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、10 mM MgCl2、2 mM CaCl2、30 μg/μL 钙调蛋白、50 ng CAMKIIα、2 μg Syntide-2、25 μM ATP 和 2 μCi [γ-32P] ATP（用于 CAMKIIα 活性测定）。 PKCδ 活性测定在 40 μL 反应体系中进行，该体系包含 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、10 mM MgCl₂、4 μL 磷脂酰丝氨酸 (PS)/PDBu 囊泡储备液、50 ng PKCδ、5 μg MARCKS 肽（实验室合成）、25 μM ATP 和 2 μCi [γ-³²P] ATP。10 分钟后，取 30 μL 反应液点样于 Whatman P81 滤纸上终止激酶反应。滤纸先用 0.5% 磷酸水溶液洗涤三次，再用 100% 丙酮洗涤一次。随后，滤纸风干，并使用 Tri-Carb 2810 TR 液体闪烁计数器进行计数。抑制率的测定以未添加抑制剂的条件（0.1% DMSO）为基准。图表使用 GraphPad Prism 7 软件绘制。PS/PDBu 囊泡的制备方法如下：将 PDBu 和 PS 混合，最终浓度分别为 100 μg/mL PS 和 250 nM PDBu，并使用 Savant Speedvac 浓缩仪干燥。将干燥的脂质重悬于 50 mM Tris pH 7.4 缓冲液中，并超声处理 3 次，每次 10 分钟，直至溶液澄清。

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对于非细胞体外酶活性测定，评估 3-IN-PP1 对纯化的 PKD1、PKD2 和 PKD3 的抑制活性。将该化合物与每种 PKD 同工酶、ATP 和底物肽在激酶缓冲液中孵育。使用放射性标记、荧光或抗体检测方法测定底物的磷酸化水平。 IC₅₀ 值由剂量反应曲线确定。

细胞增殖测定[1]
细胞类型： PANC-1 细胞
测试浓度： 5 μM
孵育时间： 0-114 小时
实验结果： 孵育 96 和 144 小时后，PANC-1 细胞增殖受到显著抑制。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： PANC-1 细胞
测试浓度： 20 μM
孵育时间： 1 小时
实验结果： PANC-1 细胞中皮质肌动蛋白磷酸化水平降低。

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增殖实验[1]
将 PANC-1 细胞以 2000 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，并使其贴壁 4 小时。随后，分别加入各化合物至终浓度为 5 μM，或加入终浓度为 0.25% 的 DMSO（溶剂）作为阴性对照。细胞培养 0、48、96 和 144 小时后，加入终浓度为 0.5 mg/mL 的 MTT（噻唑蓝四唑溴化物）。细胞孵育3小时后，用DMSO裂解。以550 nm处的吸光度作为细胞增殖的指标。增殖实验重复四次（n = 4）。统计指标为平均值和标准误（SEM）。采用双因素方差分析（ANOVA）结合Dunnett多重比较检验来确定与对照组（DMSO）的统计学显著性。统计分析使用GraphPad Prism 7软件进行。

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抗肿瘤试验[1]
所有细胞系均按照供应商推荐的方法进行培养。培养基购自Gibco Life Technologies，并添加10%胎牛血清。将贴壁细胞系LN-229、HCT-116、NCI-H460和Capan-1细胞以每孔400至1250个细胞的密度接种于384孔黑色壁透明底组织培养板中。细胞经一夜孵育后，用浓度范围为 100 至 6.4 × 10⁻³ μM 的七种不同浓度的测试化合物处理细胞。将悬浮细胞系 HL-60、K-562、Z-138 和 DND-41 以每孔 2500 至 5000 个细胞的密度接种于含有相同浓度测试化合物的 384 孔黑色壁透明底组织培养板中。将培养板置于 IncuCyte 实时成像系统，在 37 °C 下孵育 72 小时。每 3 小时拍摄一次图像，每个孔拍摄一个视野，放大倍数为 10 倍。所有化合物均进行重复实验，并取平均值。在体外细胞实验中，对 3-IN-PP1 在多种癌细胞系中进行了测试，以评估其抗增殖作用。将细胞用化合物进行系列稀释后处理，并使用标准方法检测细胞活力和增殖情况。通过蛋白质印迹法检测PKD底物的磷酸化水平，评估化合物对PKD信号通路的影响。细胞凋亡和细胞周期分析可通过流式细胞术进行。

在体内动物研究中，通常会使用各种癌症的异种移植小鼠模型来评估 3-IN-PP1。将已建立肿瘤的小鼠通过腹腔注射或口服途径给予不同剂量的化合物治疗。定期测量肿瘤体积，并计算肿瘤生长抑制率。在研究终点，检测肿瘤组织中的 PKD 信号通路生物标志物。监测小鼠的体重和总体健康状况以评估其耐受性。

3-IN-PP1 的药代动力学数据有限。作为一种分子量为 306.37 的小分子激酶抑制剂，预计其具有良好的口服生物利用度和组织分布。该化合物可溶于 DMSO，可用于体内给药制剂。需要进一步的药代动力学研究来确定其吸收、分布、代谢和排泄情况。该化合物仅供研究使用，不得用于人体。

3-IN-PP1 的毒理学数据有限。作为一种泛多囊肾病 (PKD) 抑制剂，该化合物可能对正常组织中的 PKD 功能产生靶向毒性。治疗开发需要进行全面的毒理学研究，包括急性毒性、重复给药毒性、遗传毒性和器官特异性毒性评估。该化合物仅供研究使用，不得用于人体。

[1]. Design, synthesis and biological evaluation of pyrazolo[3,4-d]pyrimidine-based protein kinase D inhibitors. Eur J Med Chem.

蛋白激酶D（PKD）在各种癌症特征中发挥着多方面的作用，这一事实已被多次报道。因此，寻找新型PKD抑制剂及其作为抗肿瘤药物的潜力引起了相当大的关注。在本研究中，合成了一系列基于吡唑并[3,4-d]嘧啶的新型全PKD抑制剂，展现出在1位的结构多样性，并评估了它们的生物活性。从已知的PKD抑制剂3-IN-PP1（IC50值为94-108 nM）开始，筛选出化合物17m，显示出显著增强的生化抑制活性（IC50值为17-35 nM）。后续的细胞实验表明，3-IN-PP1和17m均抑制了PKD依赖的皮质肌动蛋白磷酸化。此外，3-IN-PP1对PANC-1细胞表现出显著的抗增殖活性。最后，在不同癌细胞系上的筛选表明，3-IN-PP1是一种高效且多功能的抗肿瘤药物。[1]

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基于我们之前发现的PKD抑制剂3-IN-PP1，我们合成了一系列新型的吡唑并[3,4-d]嘧啶化合物。通过对该主链第一位置的系统结构修饰，我们发现了化合物17m，这是迄今为止报道的最有效的吡唑[3,4-d]嘧啶类全PKD抑制剂，对PKD1、2和3的IC50值分别为35、35和17 nM。尽管化合物17m在生化PKD测定中表现出比3-IN-PP1高出3到5倍的活性，但在细胞环境中的活性较低。另一方面，3-IN-PP1能够非常有效地抑制细胞中的PKD活性，并阻止PANC-1胰腺癌细胞的增殖。此外，广泛的抗肿瘤筛选显示，3-IN-PP1对8种癌细胞系中的7种具有低微摩尔的抗增殖活性。总之，这些数据表明，在迄今开发的吡唑[3,4-d]嘧啶类PKD抑制剂中，3-IN-PP1无疑是最有效的抗增殖剂。[1]\n3-IN-PP1是一种强效的蛋白激酶D（PKD）抑制剂，表现出全PKD抑制活性，对PKD1的IC₅₀值为108 nM，对PKD2为94 nM，对PKD3为108 nM。该化合物是一种广谱抗癌剂，对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用。3-IN-PP1可用于癌症研究，分子量为306.37，分子式为C₁₇H₁₆N₆。

C17H18N6

306.365022182465

306.159

2227110-54-3

162663243

Off-white to light yellow solid powder

2.5

85.4

2

4

2

23

435

0

C1=NC(N)=C2C(C3C4=C(NC=3)C=CC=C4)=NN(C(C)(C)C)C2=N1

RBZLXANOQRQGTN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H18N6/c1-17(2,3)23-16-13(15(18)20-9-21-16)14(22-23)11-8-19-12-7-5-4-6-10(11)12/h4-9,19H,1-3H3,(H2,18,20,21)

1-tert-butyl-3-(1H-indol-3-yl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine

3-IN-PP1; 2227110-54-3; CHEMBL4779081; BDBM50565687; PD195878;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 100 mg/mL (326.40 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.16 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.16 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.16 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。