Sigma 1/2 Receptor; vesicular acetylcholine transport

阻断乙酰胆碱转运至突触小泡以及随后乙酰胆碱的量子释放被认为是(±)-Vesamicol HCl的药理作用[1]。

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为了讨论的目的，将Vesamicol的结构分为三个主要片段：  A、 B和C（图1）。尽管已经合成了许多维生素C醇类似物，以扩大我们对与囊泡乙酰胆碱转运蛋白结合的结构-活性关系的理解，但绝大多数含有未修饰的B片段，其余仅含有该片段的单点修饰。因此，人们对分子的这一区域与囊泡乙酰胆碱转运蛋白之间的相互作用知之甚少。在之前的研究中， 我们和其他人利用构象限制策略（在片段a和/或C中）为囊泡乙酰胆碱转运蛋白开发了选择性高亲和力配体。为了测试这种策略的局限性，我们选择将我们的研究扩展到片段B。[1]

在我们的第一次尝试中，我们用托帕尼基部分替换了哌啶基片段B。从形式上讲，托烷可以被视为2,6-乙哌啶。由于乙烯桥阻止了哌啶构象的相互转化，因此托烷酰基片段可以被视为构象受限的哌啶基残基。在一项平行的工作中，我们还合成了1-甲基螺[1H-吲哚啉-3,4'-哌啶]（7）的几种衍生物，作为构象受限的Vesamicol类似物。后一项研究是我们之前对3−5等肺活量类似物的研究的延伸。测试了目标化合物与鱼雷突触小泡的囊泡乙酰胆碱转运蛋白的结合。还评估了与σ受体的结合，因为Vesamicol及其一些类似物对这些位点显示出中度至高度的亲和力。11还测试了这些化合物与单胺转运体的结合情况，因为在许多单胺再摄取抑制剂中都发现了3β-苯基托烷酰部分。最后，由于啮齿动物的行为效应，评估了这些化合物对多巴胺D2受体的亲和力（数据未显示）。由于参考配体[125I]NCQ298不能区分多巴胺D2和D3受体，因此用这种放射性配体获得的数据反映了与两种多巴胺受体亚型的结合。[1]

尽管许多托烷类似物对囊泡乙酰胆碱转运蛋白显示出适度的亲和力，但没有一种新化合物比Vesamicol更有效。事实上，与相应的哌啶基类似物相比，大多数新化合物的表现相当差。因此，虽然化合物10a的亲和力比Vesamicol低4倍，但10b−d的效力分别比苯并Vesamicol（2）、25和26低至少2个数量级（表1）。即使环己基部分被羟乙基取代，这些差异仍然存在（27 vs 10f-k），但当N-烷基取代基变得更加灵活时，这些差异消失了（28 vs 10e）。综上所述，上述内容表明，双碳桥（将哌啶基转化为托烷酰片段）对配体-受体相互作用极为不利。随着双碳桥增加片段B的空间体积，对该桥不利影响的一个合理解释可能是片段B适合结合位点内的一个狭窄口袋。[1]

尽管3−5等螺酰胺醇对囊泡乙酰胆碱转运蛋白的亲和力与Vesamicol相当或更高，但7的所有类似物的效力都明显低于Vesamicol。此外，新化合物的效力通常比相应的碳类似物低1-2个数量级（比较18a与4，19a与19b，20a与20b，21a与21b）。虽然这两个系列化合物之间的差异被环己基的缺失所掩盖（比较22a与22b和23a与23b），但很明显，7不是Vesamicol中a-B片段的合适替代品。

1.通过检查神经刺激、（-）-Vesamicol（乙酰胆碱转运到突触小泡的抑制剂）和曲氧吡咯啉（高亲和力、钠依赖性胆碱摄取系统的抑制剂）对切割的大鼠半膈制备物中运动终板记录的终板电流（EPC）和微型终板电流的影响，研究了控制突触小泡释放和再循环的突触前机制。2.在对照实验中，5分钟的10Hz神经刺激对MEPC振幅的平均值或分布没有影响。3.在（-）-维沙莫醇（25 nM-10 microM）存在下的神经刺激显示，MEPC群体不受该化合物的影响，MEPC人群的平均振幅被该化合物选择性降低。4.在屈氧吡咯啉（20微M）存在的情况下，神经刺激使所有MEPC的振幅均匀降低，而MEPC振幅的方差系数没有变化。5.（-）-Vesamicol对诱发EPCs振幅的浓度依赖性作用与化合物对MEPC振幅的浓度依存性作用平行。6.这一结果与以下假设一致，即循环和执行的突触小泡都是从大鼠运动神经末梢异质释放的，并且（-）-维生素C选择性地作用于循环小泡。此外，还描述了一种血管负荷模型，该模型解释了在（-）-Vesamicol和troxypyrrolium存在的情况下，神经刺激对MEPC振幅的不同影响[3]。

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(±)-盐酸Vesamicol（3 mg/kg；腹腔注射；一次；雄性 Wistar 大鼠）治疗可增加除纹状体外区域外所有区域的脑内胞质乙酰胆碱 (ACh) 水平，并降低脑内水泡 ACh 水平 [2] 。

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Vesamicol已知在体外抑制乙酰胆碱（ACh）向突触小泡的转运，但在体内对其在大脑中的作用知之甚少。为了评估韦沙醇在体内的作用，我们检查了胆碱能参数，如ACh的亚细胞分布、酶的活性、胆碱的摄取以及大鼠纹状体、海马和大脑皮层中的毒蕈碱受体结合，这些参数是在腹腔注射韦沙醇（3 mg/kg）或韦沙醇联合DDVP（5 mg/kg）30和60分钟后测定的，这些参数在韦沙醇前10分钟给药。注射维生素C后，脑所有区域的细胞质ACh水平都升高，而除纹状体外，所有区域的囊泡ACh水平均降低。注射维生素C后，DDVP诱导的纹状体细胞外ACh和细胞质ACh水平的增加通常会增强，而先前注射DDVP时，Vesamicol并未降低囊泡ACh的水平。Vesamicol没有诱导三个区域的酶活性、胆碱摄取或[6H]苯并咪唑奎核环酯与毒蕈碱ACh受体的结合发生任何显著变化。DDVP与维沙唑的联合给药不能逆转DDVP引起的胆碱能参数的变化。目前的研究结果表明，韦沙醇可以在体内抑制ACh向脑组织突触小泡的转运，尽管它不能逆转在韦沙醇之前注射的敌敌畏的作用。[2]

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亚细胞乙酰胆碱水平[2]
如图1所示，注射后30分钟和60分钟，Vesamicol没有引起大脑三个区域细胞外ACh水平的显著变化。注射Vesamicol后30和/或60分钟，纹状体、海马和皮质中的细胞质ACh水平升高。相比之下，注射Vesamicol后30分钟和60分钟，海马和皮质中的囊泡ACh水平降低，但纹状体中的水平没有降低。在纹状体中，注射维沙莫醇30和60分钟后，囊泡ACh水平没有明显变化（图1）。

在40和70分钟时，DDVP的给药增加了纹状体中细胞外ACh、纹状体和海马中细胞质ACh以及纹状体中囊泡ACh的水平（图1）。注射敌敌畏后，大脑任何区域的囊泡ACh水平都没有变化，尽管注射敌敌敌畏40分钟后纹状体和海马的囊泡AC水平没有显著增加。 如图1所示，与对照组和DDVP治疗的大鼠相比，联合施用Vesamicol和DDVP导致纹状体细胞外ACh和细胞质ACh水平显著升高。在注射DDVP后40或70分钟，对照组大鼠和注射DDVP和韦沙莫醇的大鼠在大脑的三个区域的囊泡ACh水平没有显著差异。 3.2.乙酰胆碱酯酶和胆碱乙酰转移酶的活性、胆碱的高亲和力摄取（HACU）和毒蕈碱受体的结合[2]
图2显示了注射Vesamicol、DDVP或DDVP加Vesamicol的大鼠大脑三个区域的AChE活性。注射后30或60分钟，单独使用Vesamicol不会导致任何大脑区域的活动发生任何变化。注射敌敌畏后，在40和70分钟时，大脑三个区域的AChE活性显著降低。服用维沙莫醇对之前注射过敌敌畏的大鼠脑三个区域AChE活动的降低没有任何影响。

如图4所示，注射Vesamicol后30或60分钟，对照组和大鼠大脑三个区域的HACU Km（图4A）和Vmax（图4B）值没有显著变化。然而，注射后40分钟和70分钟，DDVP导致大脑三个区域HACU的两个参数都增加。同时接受DDVP和维沙莫醇的大鼠大脑各区域的HACU与单独注射DDVP的大鼠大致相同。

图5显示了注射生理盐水（对照组）、Vesamicol、DDVP或DDVP加Vesamicol的大鼠大脑三个区域中[3H]QNB与mAChRs的结合。对照组和单独注射韦沙醇30和60分钟后检查的大鼠在所有区域的Kd（图5A）和Bmax（图5B）值没有显著差异。注射敌敌畏通常会降低Kd和Bmax值。接受DDVP加Vesamicol的大鼠大脑各区域的这些参数值与单独注射DDVP的大鼠的值大致相同。

囊泡乙酰胆碱转运蛋白结合。[1]
通过Rogers等人的方法，在22°C下孵育24小时后，通过与[3H]Vesamicol与电器官突触小泡的结合竞争来确定新化合物的解离常数。6 σ受体结合。根据已发表的程序，在豚鼠脑膜中用σ1-选择性放射性配体[3H]-（+）-戊佐辛标记σ1结合位点。在（+）-戊佐辛（100 nM）存在下，用[3H]DTG在大鼠肝膜中测定了33,34σ-2位点，这是这些位点的丰富来源。

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膜制备。[1]
从冷冻的豚鼠脑中减去小脑制备粗P2膜部分。在均质化之前，让大脑在冰上慢慢解冻。还从雄性Sprague−Dawley大鼠（175−225 g）的肝脏制备了粗P2膜组分。动物被斩首处死，肝脏被取出并切碎，然后进行均质化。 在4°C下，使用Porter Elvehjem组织研磨机在10 mL/g组织重量的10 mM Tris-HCl/0.32 M蔗糖（pH 7.4）中进行组织均质化。将粗匀浆在1000g下离心10分钟，将上清液保存在冰上。通过涡旋将沉淀物重新悬浮在2 mL/g组织重量冰冷的10 mM Tris-HCl/0.32 M蔗糖（pH 7.4）中。在1000g下离心10分钟后，丢弃沉淀物，合并上清液，在31000g下离心15分钟。通过涡旋将沉淀物重新悬浮在3 mL/g 10 mM Tris-HCl（pH 7.4）中，并使悬浮液在25°C下孵育15分钟。在31000g上离心15分钟后，将沉淀物轻轻均质至1.53 mL/g，再悬浮在10 mM Tris-HaCl（pH 7.3）中，等分试样储存在-80°C下直至使用。悬浮液的蛋白质浓度通过Bradford的方法测定，通常在6-11mg蛋白质/mL的范围内。

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σ1结合试验。[1]
将豚鼠膜（100μg蛋白质）与3 nM[3H]-（+）-戊佐辛（31.6 Ci/mmol）在pH 8.0的50 mM Tris-HCl中在25°C下孵育120或240分钟。将测试化合物溶解在乙醇中，然后在缓冲液中稀释，使总孵育体积为0.5 mL。通过加入冰冷的10 mM Tris-HHCl（pH 8.0）终止测定，然后使用Brandel收割机通过Whatman GF/B玻璃过滤器（预浸在0.5%聚乙烯亚胺中）快速过滤。用5mL冰冷的缓冲液洗涤过滤器两次。在10μM（+）-戊佐辛存在下测定非特异性结合。使用Beckman LS 6000IC光谱仪在Ecolite（+）中进行液体闪烁计数，计数效率为50%。典型的计数为总结合70 dpm/μg蛋白质，非特异性结合6 dpm/µg，特异性结合64 dpm/微克。

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σ2结合试验。[1]
在100 nM（+）-戊佐辛的存在下，用3 nM[3H]DTG（38.3 Ci/mmol）孵育大鼠肝膜（35μg蛋白质）或豚鼠脑膜（360μg），以掩盖σ1位点。在25°C下，在pH 8.0的50 mM Tris-HCl中孵育120分钟，总孵育体积为0.5 mL。通过加入冰冷的10 mM Tris-HHCl（pH 8.0）终止测定，然后使用Brandel收割机通过Whatman GF/B玻璃过滤器（预浸在0.5%聚乙烯亚胺中）快速过滤。然后用0.5mL冰冷的缓冲液洗涤过滤器两次。在5μM DTG存在下测定非特异性结合。使用Beckman LS 6000IC光谱仪在Ecolite（+）中进行液体闪烁计数，计数效率为50%。大鼠肝脏的典型计数为总结合297 dpm/μg蛋白质，非特异性结合11 dpm/µg蛋白质，特异性结合286 dpm/微克蛋白质。豚鼠脑的典型计数为总结合16dpm/μg蛋白质，非特异性结合2dpm/μg，特异性结合14dpm/µg。 数据分析。σ位点的IC50值通过使用JMP的非线性回归分析分三次测定，每种乙酰胆碱化合物的浓度为5-10。Ki值使用Cheng-Prusoff方程35计算，表示平均值±SEM。除非另有说明，否则所有测定均一式三份。对于放射性配体，采用了以下之前报道的33,34 Kd值：  [3H]DTG，17.9 nM（大鼠肝脏）；[3H]-（+）-戊佐辛，4.8 nM（豚鼠脑）。豚鼠脑中[3H]DTG的Kd值通过Scatchard分析确定为21.6 nM。

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多巴胺D2/D3受体结合试验。[1]
Perry Molinoff博士提供了表达大鼠多巴胺D2受体的草地贪夜蛾（Sf9）昆虫细胞的冷冻膜制剂。如前所述制备大鼠纹状体匀浆。如前所述，使用0.2 nM[125I]NCQ298（用于Sf9/D2受体）或0.05 nM[127I]NCQ2 98（用于纹状体匀浆中的D2/D3受体）作为放射性配体，在这些细胞膜中进行了36次竞争实验，并使用8−10浓度（10-10−10-5 M）的竞争药物（在含有0.1%BSA的Tris-HCl缓冲液中连续稀释）。37非特异性结合用1μM spiperone定义。在37°C下孵育30分钟。通过用1%聚乙烯亚胺预浸的玻璃纤维过滤器过滤，将结合的放射性配体与游离的放射性配体分离，从而终止反应。然后用3mL冰冷的20mM Tris缓冲液洗涤过滤器三次，并在γ计数器中以70%的效率计数。使用迭代非线性最小二乘曲线拟合程序LIGAND对竞争实验进行了分析。

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多巴胺和血清素转运体结合试验。[1]
如前所述，[125I]IPT分别在大鼠纹状体和皮质匀浆中与多巴胺和血清素转运体结合。39竞争实验在含有50 mM Tris-HCl、pH 7.4和120 mM NaCl的缓冲液中进行，缓冲液中含有0.2 M[125I]IPT（用于纹状体匀浆）或0.5 M[125I]IPT，以及8−10浓度（10-10−10-5 M）的竞争药物。非特异性结合是在40μM（−）可卡因存在的情况下定义的。使用迭代非线性最小二乘曲线拟合程序LIGAND对竞争实验进行了分析。

动物/疾病模型：雄性Wistar大鼠（120-300 g）[2]
剂量：3 mg/kg
给药途径：腹腔注射（ip）；单次
实验结果：脑内所有区域的胞质乙酰胆碱（ACh）水平均升高，而除纹状体外，所有区域的囊泡乙酰胆碱水平均降低。

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在本实验中，我们测定了单独使用维沙米考（Vesamicol）或与对乙酰氨基酚（DDVP）联合治疗的大鼠脑内各区域的胆碱能参数。大鼠单次腹腔注射维沙米考（Vesamicol）（3 mg/5 ml生理盐水/kg），[(±)-维沙米考盐酸盐]，并在30或60分钟后处死。对照组大鼠注射5 ml/kg生理盐水，30分钟后处死。部分动物在注射维沙米考或生理盐水前10分钟皮下注射对乙酰氨基酚（DDVP，5 mg/kg；Kobayashi等），40或70分钟后处死。选择3 mg/kg剂量的维沙米考是因为更高剂量（5 mg/kg）导致5只受试大鼠中有2只死亡，且据报道该药物（腹腔注射）在小鼠中的LD50为4.2 mg/kg [2]。

代谢/代谢物
铜主要通过胃肠道吸收，但也可通过吸入和皮肤吸收。它穿过基底外侧膜，可能通过调节性铜转运蛋白，并与血清白蛋白结合，被运送到肝脏和肾脏。肝脏是维持铜稳态的关键器官。在肝脏和其他组织中，铜以与金属硫蛋白、氨基酸结合以及与铜依赖性酶结合的形式储存，然后通过胆汁排出体外或整合到细胞内和细胞外蛋白质中。铜通过血浆与血清白蛋白、铜蓝蛋白或低分子量复合物结合，运输到外周组织。铜可能诱导金属硫蛋白和铜蓝蛋白的生成。膜结合的铜转运腺苷三磷酸酶（Cu-ATPase）将铜离子转运进出细胞。人体内的铜生理正常水平是通过调节铜的吸收速率和吸收量、体内分布以及排泄来维持的。(L277, L279)

毒性概述
过量的铜会被隔离在肝细胞溶酶体中，并与金属硫蛋白形成复合物。当溶酶体饱和，铜在细胞核内积聚，导致核损伤时，就会发生铜肝毒性。这种损伤可能是氧化损伤的结果，包括脂质过氧化。铜会抑制巯基酶，例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、谷胱甘肽还原酶和对氧磷酶，这些酶可以保护细胞免受自由基的损伤。铜还会影响基因表达，并且是细胞色素C氧化酶和赖氨酰氧化酶等氧化酶的辅助因子。此外，铜诱导的氧化应激被认为会激活酸性鞘磷脂酶，从而导致神经酰胺（一种凋亡信号）的产生，并引起溶血性贫血。铜诱发呕吐是由于迷走神经受到刺激所致。(L277, T49, A174, L280)

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212231 小鼠口服 LD50 48931 ug/kg 周围神经和感觉：无需麻醉即可引起弛缓性麻痹（通常为神经肌肉阻滞） 欧洲药理学杂志，8(93)，1969 [PMID:4243404]
212231 小鼠静脉注射 LD50 5874 ug/kg 周围神经和感觉：无需麻醉即可引起弛缓性麻痹（通常为神经肌肉阻滞） 欧洲药理学杂志，8(93)，1969 [PMID:4243404]

[1]. N-hydroxyalkyl derivatives of 3 beta-phenyltropane and 1-methylspiro[1H-indoline-3,4'-piperidine]: vesamicol analogues with affinity for monoamine transporters. J Med Chem. 1997 Nov 21;40(24):3905-14.

[2]. Effects of systemic administration of 2-(4-phenyl-piperidino)-cyclohexanol (vesamicol) and an organophosphate DDVP on the cholinergic system in brain regions of rats. Brain Res Bull. 1997;43(1):17-23.

[3].Acetylcholine recycling and release at rat motor nerve terminals studied using (-)-vesamicol and troxpyrrolium. J Physiol. 1991;444:99-116.

(1R,2R)-2-(4-苯基-1-哌啶基)-1-环己醇是哌啶类化合物。
氢氧化铜(II)硫酸盐是铜的化合物。铜是一种化学元素，符号为Cu，原子序数为29。铜是动植物必需的元素，因为它是30多种酶正常运作所必需的。它天然存在于岩石、土壤、水和空气等环境中。 (L277, L278)

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作为我们正在进行的囊泡乙酰胆碱转运体配体2-(4-苯基哌啶基)环己醇（维沙米醇，1）构效关系研究的一部分，我们合成了22种3β-苯基托烷（6）和1-甲基螺[1H-吲哚啉-3,4'-哌啶]（7）的N-羟基(苯基)烷基衍生物，并进行了体外结合试验。虽然少数化合物对囊泡乙酰胆碱转运体表现出中等偏高的亲和力，但没有化合物的效力超过典型的囊泡乙酰胆碱转运体配体维沙米醇。然而，6的几个衍生物对多巴胺转运体的亲和力高于可卡因。我们得出结论，对化合物 1 的哌啶基片段进行修饰并不会得到更有效的囊泡乙酰胆碱转运体配体。[1]

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总之，维沙米醇的 3β-苯基托烷基衍生物对囊泡乙酰胆碱转运体的亲和力低于其母体化合物。因此，在维沙米醇哌啶基部分的 C2 和 C6 位引入双碳桥并非提高其对囊泡乙酰胆碱转运体亲和力或相对于 σ 受体的选择性的合适策略。出于类似的原因，在维沙米醇的 C 片段中引入氨甲基桥（得到化合物 7 的类似物）也不合适。由于使用托烷类化合物获得的结果表明片段 B 与结合位点内的一个狭窄口袋结合，我们建议对该片段的进一步修饰应仅限于单点取代。[1]

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注射维沙米醇后 30 分钟和 60 分钟，QNB 与 mAChR 的结合未受影响，这表明该药物无法修饰对 ACh 具有高亲和力的 mAChR。动力学模型表明，ACh 对囊泡 ACh 转运蛋白具有高亲和力，ACh 通过该转运蛋白进行转运，而维沙米醇则在其变构位点结合，该位点被称为维沙米醇受体。Kd 和 Bmax 分别表示配体 ACh 的亲和力和 mAChR 的密度。在本实验中，给予 DDVP 导致 Kd 增加和 Bmax 降低，表明 ACh 可能在 mAChR 周围积累。维沙米醇未能逆转对敌敌畏对喹诺酮与毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR）结合能力的影响。
总之，本研究对大鼠脑三个区域的胆碱能参数进行了分析，结果表明，维沙米醇（一种体外和体内均能抑制乙酰胆碱转运至突触小泡的抑制剂）在全身给药后，可导致体内突触小泡内乙酰胆碱水平降低，胞质内乙酰胆碱水平升高。因此，维沙米醇似乎能抑制体内胞质内乙酰胆碱向突触小泡的转运。其他参数，例如HACU、胆碱乙酰转移酶（ChAT）活性和毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR）水平，在本实验条件下似乎与维沙米醇的作用没有直接关系。[2]

C17H25NO

259.39

259.194

C, 78.72; H, 9.71; N, 5.40; O, 6.17

112709-59-8

22232-64-0; 120447-62-3; 112709-59-8; 23965-53-9

659840

White to off-white solid powder

1.086g/cm3

393.5ºC at 760mmHg

97ºC

6.73E-07mmHg at 25°C

1.57

3.909

23.47

1

2

2

19

266

2

O[C@@H]1CCCC[C@H]1N1CCC(C2C=CC=CC=2)CC1

YSSBJODGIYRAMI-IAGOWNOFSA-N

InChI=1S/C17H25NO/c19-17-9-5-4-8-16(17)18-12-10-15(11-13-18)14-6-2-1-3-7-14/h1-3,6-7,15-17,19H,4-5,8-13H2/t16-,17-/m1/s1

(1R,2R)-2-(4-phenylpiperidin-1-yl)cyclohexan-1-ol

(-)-Vesamicol; vesamicol; 112709-59-8; L-(-)-Vesamicol hydrochloride; (1R,2R)-2-(4-phenylpiperidin-1-yl)cyclohexan-1-ol; Vesamicol, (+/-)-; 115362-28-2; CHEMBL20730;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO :~100 mg/mL (~385.52 mM; with sonication (<80°C))

配方 1 中的溶解度: 5 mg/mL (19.28 mM) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加),澄清溶液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，您可以添加 100 μL 50.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液，并将其添加到 900 μL 玉米油中并充分混合。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。