Protosappanin B   中文名称: 原苏木素 B

原皂苷B（12.5、25、50、100和200 µg/mL，48小时）呈剂量依赖性地抑制肿瘤细胞；SW-480和HCT细胞的IC50值分别为21.32 µg/mL、26.73 µg/mL和76.53 µg/mL。SW-480-116和BTT细胞的抑制作用依次增强[1]。

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- 原皂苷B（2 mg/mL）呈时间依赖性地降低人膀胱癌T24细胞和鼠膀胱癌BTT细胞的活力，台盼蓝排除法检测结果显示。100分钟后，T24细胞的死亡率为79.58% ± 4.13%，BTT细胞的死亡率为81.12% ± 6.11%（P < 0.05）。 [1] - 原皂苷B在48小时处理后，以浓度依赖的方式显著抑制人结肠癌HCT-116、SW-480细胞和鼠膀胱癌BTT细胞的生长，MTT法测定结果显示其抑制作用。IC₅₀值：SW-480 = 21.32 μg/mL；HCT-116 = 26.73 μg/mL；BTT = 76.53 μg/mL。作为比较，巴西苏木素的IC₅₀值分别为：SW-480 = 7.79 μg/mL；HCT-116 = 12.35 μg/mL；BTT = 8.76 μg/mL。 [1] - 原皂苷B（12.5–200 μg/mL，48 h）对T24、5637和SV-HUC-1细胞的生长表现出浓度依赖性的抑制作用。200 μg/mL浓度下的生长抑制率分别为：T24 = 92.13%，5637 = 75.86%，SV-HUC-1 = 56.54% (P < 0.05)。IC₅₀值分别为：T24 = 82.78 μg/mL；5637 = 113.79 μg/mL。 [2]
- 在光镜下观察到，用原皂苷B（200 μg/mL，24 h）处理T24和5637细胞后，细胞形态发生改变（细胞收缩、变圆、细胞膜异常、细胞黏附力降低和细胞碎片）。[2]
- 通过Annexin-V/PI流式细胞术检测发现，原皂苷B（100–300 μg/mL，24 h）可浓度依赖性地诱导T24和5637细胞凋亡。T24细胞中总凋亡细胞比例：从对照组（约5%）增加到300 μg/mL处理组的约55%。5637细胞中：从对照组（约6%）增加到300 μg/mL处理组的约50%（P < 0.05）。 [2]
- Western blot 分析显示，原皂苷 B（100–300 μg/mL，48 h）以浓度依赖的方式降低 T24 和 5637 细胞中 Bcl-2 蛋白的表达，并增加 Bax 蛋白的表达。[2]
- 流式细胞术细胞周期分析显示，原皂苷 B（100–300 μg/mL，48 h）导致 T24 和 5637 细胞发生 G₁ 期阻滞。在 T24 细胞中，G₁ 期细胞比例从 62.96%（对照组）增加到 300 μg/mL 处理组的 82.74%，而增殖指数从 37.04% 下降到 17.26%（P < 0.05）。在 5637 个细胞中，G₁ 期细胞比例从 37.43% 增加到 64.59%，增殖指数从 62.57% 下降到 35.41% (P < 0.05)。[2]
- 对用原皂苷 B (48 小时) 处理的 T24 细胞进行蛋白质组学分析，鉴定出 4914 种蛋白质，其中 3494 种进行了定量。差异表达蛋白被聚类，KEGG 通路分析表明细胞周期相关蛋白受到显著影响，这支持了细胞周期阻滞参与了原皂苷 B 诱导的细胞凋亡。[2]

将H22小鼠肝癌细胞用原皂苷B（终浓度分别为6.25、3.12或1.56 mg/mL）预处理10、20或40分钟，然后接种到KM小鼠体内（每组n=5）。对照组分别注射生理盐水或丝裂霉素（0.66 mg/mL）。观察肿瘤形成和生存情况60天。高剂量原皂苷B（6.25 mg/mL）在所有处理时间组中均完全抑制了肿瘤形成（肿瘤形成率为0%），平均生存时间为60.00 ± 0.00天，与对照组相比，生存期分别延长了297.35%（10分钟）、226.09%（20分钟）和166.67%（40分钟）（P < 0.05）。中等剂量（3.12 mg/mL）组的肿瘤形成率分别为：10分钟时100%，20分钟时80%，40分钟时60%，平均生存时间分别为20.40 ± 8.27天、32.10 ± 16.34天和41.30 ± 19.73天。低剂量（1.56 mg/mL）组所有组的肿瘤形成率均为100%，平均生存时间分别为：10分钟时21.60 ± 2.97天，20分钟时24.20 ± 12.6天，40分钟时35.50 ± 14.11天。丝裂霉素（0.66 mg/mL）组的肿瘤形成率为0-20%，大多数组的生存期为60天。 [1]
- 携带 BTT 肿瘤的 T739 小鼠（每组 n=10）在腹腔接种 BTT 细胞（5×10⁶ 个细胞/只）24 小时后，连续 6 天接受腹腔注射原皂苷 B（100、200 或 300 mg/kg/天）、丝裂霉素（1 mg/kg/天）或生理盐水（对照组）。观察小鼠存活 60 天。平均存活时间：对照组 = 19.28 ± 4.94 天；低剂量原皂苷 B（100 mg/kg）组 = 22.64 ± 5.49 天（延长 17.43%，P < 0.05）。中剂量组（200 mg/kg）= 43.81 ± 10.21 天（延长 127.23%，P < 0.05）；高剂量组（300 mg/kg）= 51.38 ± 11.31 天（延长 166.49%，P < 0.05）；丝裂霉素组（1 mg/kg）= 52.44 ± 8.83 天（延长 177.99%，P < 0.05）。[1]

细胞活力检测[1]
细胞类型： CT-116、SW-480 和 BTT 细胞
测试浓度： 12.5、25、50、100、200 µg/mL
孵育时间： 48 小时
实验结果： 处理 48 小时后，肿瘤细胞呈剂量依赖性抑制。

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- 台盼蓝排除法：将 T24 和 BTT 细胞用生理盐水调整至 2×10⁶/mL。取 500 μL 细胞悬液与 500 μL 原皂苷 B（终浓度 2 mg/mL）或生理盐水（对照）混合。在37°C、5% CO₂条件下孵育后，分别于0、20、40、60和100分钟取样。取100 μL细胞悬液与等体积的台盼蓝混合。在血细胞计数板的4个大网格中，使用光学显微镜（100倍放大）计数死细胞（蓝色染色）和活细胞（未染色）。死亡率 =（死细胞计数 /（死细胞计数 + 活细胞计数））× 100%。[1]
- HCT-116、SW-480和BTT细胞的MTT检测：将细胞接种于96孔板（4×10³个细胞/孔），每孔加入100 μL培养基，孵育24小时。将培养基替换为 200 μL 含有原皂苷 B 或巴西木素的新鲜培养基，其终浓度分别为 12.5、25、50、100 或 200 μg/mL。对照孔加入等体积的培养基。48 小时后，向每个孔中加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），孵育 4 小时。移除培养基，加入 150 μL DMSO，振荡 10 分钟。在 570 nm 波长处测量光密度值。生长抑制率 (%) = (1 – 处理组平均光密度值 / 对照组平均光密度值) × 100%。IC₅₀ 的计算公式为：lgIC₅₀ = Xm – I(P – (3 – Pm – Pn)/4)。 [1]
- T24、5637 和 SV-HUC-1 细胞的 MTT 检测：将细胞接种于 96 孔板中（T24 和 SV-HUC-1：4×10³ 个细胞/孔；5637：9×10³ 个细胞/孔），每孔加入 100 μL 培养基，培养 24 小时。更换培养基，加入 200 μL 含有原皂苷 B（12.5、25、50、100 或 200 μg/mL）的培养基。48 小时后，加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），孵育 4 小时，然后移除培养基，加入 150 μL DMSO，振荡 10 分钟。在 570 nm 波长处测定吸光度值 (OD)。生长抑制率和 IC₅₀ 的计算方法如上所述。 [2]
- 细胞形态观察：将T24细胞（4×10⁵个细胞/孔）或5637细胞（5×10⁵个细胞/孔）接种于6孔板中。加入原皂苷B（200 μg/mL）或等体积培养基（对照）。孵育24小时后，在倒置显微镜下（100倍放大）观察细胞并拍照。[2]
- 细胞凋亡检测（Annexin-V/PI）：将T24细胞（4×10⁵个细胞/孔）或5637细胞（5×10⁵个细胞/孔）培养于6孔板中24小时。更换培养基，加入含有原皂苷B（100、150、200或300 μg/mL）或对照的培养基。 24 小时后，消化细胞，收集细胞，离心（1000 rpm，5 分钟），重悬于 PBS 缓冲液中，过滤，再次离心。将细胞重悬于结合缓冲液中，加入 5 μL Annexin-V-FITC 和 PI，室温避光孵育 15 分钟。采用流式细胞术检测细胞凋亡。总凋亡率 = 早期凋亡率 + 晚期凋亡率。[2] - Western blot：将 T24 和 5637 细胞用 原皂苷 B（0、100、200 或 300 μg/mL）处理 48 小时。用 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞。采用 Bradford 法测定蛋白浓度。每泳道上样 20 μg 蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并将蛋白转移至 PVDF 膜上。将膜与Bax（1:200）和Bcl-2（1:200）的一抗于4℃孵育过夜，然后与HRP标记的二抗孵育2小时。使用ECL试剂显色，并用Image J软件进行分析。[2]
- 细胞周期分析：将T24细胞（8×10⁵个细胞/孔）或5637细胞（1×10⁶个细胞/孔）接种于6孔板中培养24小时。更换培养基，加入含有原皂苷B（100、150、200、250或300 μg/mL）或对照的培养基。48小时后，消化细胞，收集细胞，离心（1000 rpm，5分钟），用PBS洗涤，并在4℃下用70%冰乙醇固定过夜。随后对细胞进行洗涤、过滤、离心，并使用流式细胞仪和细胞周期检测试剂盒检测DNA含量。每个样品均进行三次重复分析。增殖指数 = (S + G₂) / (G₁ + S + G₂) × 100%。[2]
- 蛋白质组学分析：收集用原皂苷B或载体处理48小时的T24细胞。使用裂解缓冲液（8M尿素，1%蛋白酶抑制剂混合物）超声提取蛋白质，离心（12,000×g，10分钟，4℃），并用BCA法定量。蛋白质用 5 mM 二硫苏糖醇还原（56°C，30 分钟），用 11 mM 碘乙酰胺烷基化（避光，室温，15 分钟），用 100 mM NH₄HCO₃ 稀释至 2 M 尿素，并用胰蛋白酶消化（质量比 1:50 过夜，然后 1:100 消化 4 小时）。胰蛋白酶消化肽段经高 pH 反相高效液相色谱 (HPLC) 分离，使用 C18 色谱柱，以 8-32% 乙腈 (pH 9.0) 的梯度洗脱，60 分钟内收集 60 个馏分，然后合并为 4 个馏分。LC-MS/MS 分析在 Q Exactive Plus 仪器上进行，该仪器与 EASY-nLC 1000 UPLC 联用。将肽段上样至反相分析柱，以 400 nL/min 的流速，在 34 分钟内用 6%～35% 的溶剂 B（0.1% 甲酸的 98% 乙腈溶液）梯度进行洗脱。采用数据依赖模式采集质谱数据。进行层次聚类分析时，首先进行通路富集分析，然后使用 Genesis 软件对 P 值进行转换和 z 分数校正，以进行聚类分析。[2]

KM小鼠H22肿瘤细胞侵袭实验：将冷冻的H22细胞解冻后，以2.5×10⁶/mL的浓度（0.2 mL）接种到KM小鼠腹腔内。于第7天无菌采集腹水。用生理盐水将细胞密度调整至2.5×10⁷/mL。加入原皂苷B（终浓度分别为6.25、3.12或1.56 mg/mL）、丝裂霉素（终浓度为0.66 mg/mL）或生理盐水（对照组）（比例为1:9）。将细胞在37℃下孵育，分别于10、20或40分钟时洗涤以去除药物，然后重悬于等体积的生理盐水中。取0.2 mL细胞悬液接种到KM小鼠腹腔内（每组n=5）。每天观察小鼠两次，持续60天；每3天测量一次体重。计算肿瘤形成率、平均生存时间和延长生存率。对于早上发现死亡的动物，生存时间记录为1天；下午发现死亡的动物，生存时间记录为1.5天。进行尸检。[1]
- 荷瘤T739小鼠的生存情况：将处于对数生长期的BTT细胞（10⁷/mL）皮下注射（0.1 mL）至T739小鼠的右侧腋窝。当肿瘤直径达到1.5-2 cm时，处死小鼠，浸入75%乙醇中2分钟，无菌收集肿瘤组织。将肿瘤组织匀浆以获得单细胞悬液，用生理盐水洗涤两次，并重悬于5×10⁶/mL的浓度。取0.2 mL该悬液接种至T739小鼠的腹腔内。 24小时后，将小鼠随机分为5组（n=10）：对照组、丝裂霉素组（1 mg/kg）和原皂苷B组（100、200或300 mg/kg）。连续6天，每天腹腔注射药物或生理盐水（0.2 mL）。观察60天（以60天为最长观察期）并记录生存时间。计算延长生存率。[1]

[1]. Antitumor Effects of Purified Protosappanin B Extracted From Lignum Sappan. Integr Cancer Ther. 2016 Mar;15(1):87-95.

[2]. Protosappanin B promotes apoptosis and causes G1 cell cycle arrest in human bladder cancer cells. Sci Rep. 2019 Jan 31;9(1):1048.

原苏木素B是一种多酚类化合物，分子式为C₁₆H₁₆O₆，分子量为304.09。它与巴西苏木素并列为苏木素的两大主要成分之一，并被列入《中国药典》作为苏木素制剂的质量指标。[1][2] 原苏木素B在膀胱癌细胞中的抗肿瘤机制涉及诱导细胞凋亡（通过降低Bcl-2表达和增加Bax表达）以及G₁期细胞周期阻滞，从而阻止细胞从G₁期向S期转变。蛋白质组学分析证实，细胞周期相关蛋白的表达受到显著影响。 [2]
- 原皂苷B已被证实具有抗炎、抗菌、抗氧化和神经保护（保护PC12细胞免受氧糖剥夺诱导的细胞凋亡）特性。[2]
- 该化合物的临床应用剂量为0.5 mg/kg。[2]
- 体内研究表明，在测试剂量（100-300 mg/kg/天，持续6天）下，原皂苷B治疗安全，未见明显毒性。[1]

C16H16O6

304.29

304.094

102036-29-3

13846689

Light yellow to orange solid powder

1.5±0.1 g/cm3

655.5±55.0 °C at 760 mmHg

350.2±31.5 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.700

1.13

110.38

5

6

1

22

391

0

QRTYTQTVJQUCEP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H16O6/c17-7-16(21)6-9-3-13(19)14(20)5-12(9)11-2-1-10(18)4-15(11)22-8-16/h1-5,17-21H,6-8H2

10-(hydroxymethyl)-8-oxatricyclo[10.4.0.02,7]hexadeca-1(16),2(7),3,5,12,14-hexaene-5,10,14,15-tetrol

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~164.32 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.84 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.84 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.84 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。