Purmorphamine   中文名称: 9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺

Smoothened ( IC50 = 1.5 μM )

体外活性：Purmorphamine 通过直接结合并激活 Smoothened 来激活 Hedgehog 通路，与 Smo 拮抗剂环巴明竞争，IC50 约为 1.5 μM。 Purmorphamine 是多能 C3H10T1/2 细胞中骨生成的有效诱导剂。在 C3H10T1/2 细胞中，Purmorphamine 的 EC50（基于 ALP 表达）为 1 μM。 Purmorphamine (1 μM) 和 BMP-4 (100 ng/mL) 一起使 3T3-L1 细胞中的 ALP 活性提高 90 倍以上。与 BMP-4 不同，Purmorphamine 通过激活多能间充质祖细胞中的 Hedgehog 信号传导来诱导成骨。激酶测定：Smo 结合测定使用 BODIPY-环杷明和 Smo 过表达细胞进行，如前所述 4,5，使用基于 CMV 启动子、包含 SV40 起点的 Smo-Myc3 表达构建体，Smo-Myc3 是缺失突变体 SmoCRD（氨基酸缺失）氨基酸 68 至 182）和 SmoCT（删除氨基酸 556 至 793）。 HEK 293T 细胞在 12 孔板中经聚 D-赖氨酸处理的玻璃盖玻片上生长直至 70% 汇合，然后根据制造商的方案使用 FuGene 6 用适当的表达构建体（0.5 µg/孔）转染。转染两天后，将 HEK 293T 细胞与含有 0.5% 小牛血清、5 nM BODIPY-环杷明和不同浓度的嘌吗啡胺（0、1.5 或 5 μM）（1 mL/孔）的 DMEM 一起孵育 1 小时在37℃。然后用 1 × PBS 缓冲液（1 mL/孔）洗涤 Smo 过表达细胞，用含有 DAPI 的培养基封片，并使用 Leica DM4500B 荧光显微镜观察。对于使用固定细胞的结合测定，将 Smo 过表达 HEK 293T 细胞用 1 × PBS 缓冲液中的 3% 多聚甲醛在室温下固定 10 分钟（1 mL/孔），并用含有 10 mM 甘氨酸和 0.2% 的 1 × PBS 处理叠氮化钠 5 分钟（1 mL/孔），用 1 × PBS 缓冲液（1 mL/孔）洗涤，并用上述含嘌呤吗胺的培养基在室温下处理 4 小时。细胞测定：C3H10T1/2细胞在T175烧瓶中扩增；第 13 代细胞通过胰蛋白酶/EDTA 分离并在生长培养基中稀释。然后使用 Multi-dropTM 液体输送系统将所得细胞悬浮液接种到黑色透明底部 384 孔板中，每孔含 2500 个细胞，含有 100 µL 生长培养基。过夜孵育后，细胞附着于孔底部。使用 Mini TrakTM 多位分配器系统将每种 Purmorphamine 的 DMSO (500 nL) 储备溶液输送到相应的孔中，以制备 5μM Purmorphamine 的最终浓度。然后将细胞在 37 ℃、5% CO2 的空气气氛中孵育。 4 天后，除去培养基，并向每孔中添加 10 μL 被动裂解缓冲液。 5分钟后，每孔加入10μL碱性磷酸酶底物溶液。在室温下孵育 15 分钟后，按照制造商方案在 Acquest 高通量读板机上读取平板。

Purmorphamine 上调大鼠基于人间充质干细胞的构建体中 ALP 的表达。

Smo 结合测定使用 BODIPY-环杷明和 Smo 过表达细胞进行，如前所述 4,5。 Smo-Myc3、Smo⁄CRD（删除氨基酸 68 至 182）和 SmoCT（删除氨基酸 556 至 793）的表达构建体基于 CMV 启动子并包含 SV40 起点。据制造商介绍，HEK 293T 细胞在 12 孔板中的聚 D-赖氨酸处理的玻璃盖玻片上培养，直至 70% 汇合。之后，使用 FuGene 6 和适当的表达构建体（0.5 g/孔）对它们进行转染。

在T175烧瓶中培养C3H10T1/2细胞；在第十三次传代时，使用胰蛋白酶/EDTA 分离细胞，然后在培养物中稀释。然后使用 Multi-dropTM 液体输送系统将所得细胞悬浮液接种到黑色透明底部 384 孔板中，每孔 2500 个细胞，置于 100 µL 生长培养基中。过夜孵育后，细胞粘附于孔底。使用 Mini Trak^TM 多位分配器系统将 DMSO 中的每种嘌吗啡胺的 500 nL 原液转移到相应的孔中，从而得到 5μM 嘌吗啡胺的最终浓度。之后，将细胞在37°C、5% CO₂的空气气氛中培养。四天后，除去培养基后，每孔接受 10 μL 被动裂解缓冲液。五分钟后向每个孔中添加十微升碱性磷酸酶底物溶液。在室温下孵育 15 分钟后，根据制造商的说明使用 Acquest 高通量读板器读取板。

Male C57BL/6J mouse pups
10 mg/kg
i.p.

[1]. Nat Chem Biol . 2006 Jan;2(1):29-30.

[2]. J Am Chem Soc . 2002 Dec 11;124(49):14520-1.

[3]. Chem Biol . 2004 Sep;11(9):1229-38.

[4]. Biomed Pharmacother . 2013 Feb;67(1):31-8.

[5]. Front Pharmacol . 2020 Mar 4:11:204.

C31H32N6O2

520.62

520.26

C, 71.52; H, 6.20; N, 16.14; O, 6.15

483367-10-8

Purmorphamine; 483367-10-8

Solid powder

C1CCC(CC1)N2C=NC3=C(N=C(N=C32)OC4=CC=CC5=CC=CC=C54)NC6=CC=C(C=C6)N7CCOCC7

FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C31H32N6O2/c1-2-9-25(10-3-1)37-21-32-28-29(33-23-13-15-24(16-14-23)36-17-19-38-20-18-36)34-31(35-30(28)37)39-27-12-6-8-22-7-4-5-11-26(22)27/h4-8,11-16,21,25H,1-3,9-10,17-20H2,(H,33,34,35)

9-cyclohexyl-N-(4-morpholin-4-ylphenyl)-2-naphthalen-1-yloxypurin-6-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Solubility in Formulation 1: ≥ 2.5 mg/mL (4.80 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 400 μL PEG300 and mix evenly; then add 50 μL Tween-80 to the above solution and mix evenly; then add 450 μL normal saline to adjust the volume to 1 mL.
Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH₂ O to obtain a clear solution.

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Solubility in Formulation 2: ≥ 2.5 mg/mL (4.80 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 900 μL of 20% SBE-β-CD physiological saline solution and mix evenly.
Preparation of 20% SBE-β-CD in Saline (4°C，1 week): Dissolve 2 g SBE-β-CD in 10 mL saline to obtain a clear solution.

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Solubility in Formulation 3: ≥ 2.5 mg/mL (4.80 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 900 μL of corn oil and mix evenly.

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Solubility in Formulation 4: 2% DMSO+30% PEG 300+5% Tween 80+ddH2O: 1 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。