Purmorphamine   中文名称: 9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺

Smoothened ( IC50 = 1.5 μM )
Purmorphamine targets the Smoothened (SMO) receptor, a key mediator of the Hedgehog (Hh) signaling pathway (EC50 = 1.0 μM for Hh pathway activation in NIH3T3 cells; Ki = 0.6 μM for SMO binding) [3][5]
Purmorphamine shows no significant binding to other GPCRs or kinases (IC50 > 50 μM for 200+ tested targets) [3]

Purmorphamine 通过直接结合并激活 Smoothened 来激活 Hedgehog 通路，与 Smo 拮抗剂环巴明竞争，IC50 约为 1.5 μM。 Purmorphamine 是多能 C3H10T1/2 细胞中骨生成的有效诱导剂。在 C3H10T1/2 细胞中，Purmorphamine 的 EC50（基于 ALP 表达）为 1 μM。 Purmorphamine (1 μM) 和 BMP-4 (100 ng/mL) 一起使 3T3-L1 细胞中的 ALP 活性提高 90 倍以上。与 BMP-4 不同，Purmorphamine 通过激活多能间充质祖细胞中的 Hedgehog 信号传导来诱导成骨。激酶测定：Smo 结合测定使用 BODIPY-环杷明和 Smo 过表达细胞进行，如前所述 4,5，使用基于 CMV 启动子、包含 SV40 起点的 Smo-Myc3 表达构建体，Smo-Myc3 是缺失突变体 SmoCRD（氨基酸缺失）氨基酸 68 至 182）和 SmoCT（删除氨基酸 556 至 793）。 HEK 293T 细胞在 12 孔板中经聚 D-赖氨酸处理的玻璃盖玻片上生长直至 70% 汇合，然后根据制造商的方案使用 FuGene 6 用适当的表达构建体（0.5 µg/孔）转染。转染两天后，将 HEK 293T 细胞与含有 0.5% 小牛血清、5 nM BODIPY-环杷明和不同浓度的嘌吗啡胺（0、1.5 或 5 μM）（1 mL/孔）的 DMEM 一起孵育 1 小时在37℃。然后用 1 × PBS 缓冲液（1 mL/孔）洗涤 Smo 过表达细胞，用含有 DAPI 的培养基封片，并使用 Leica DM4500B 荧光显微镜观察。对于使用固定细胞的结合测定，将 Smo 过表达 HEK 293T 细胞用 1 × PBS 缓冲液中的 3% 多聚甲醛在室温下固定 10 分钟（1 mL/孔），并用含有 10 mM 甘氨酸和 0.2% 的 1 × PBS 处理叠氮化钠 5 分钟（1 mL/孔），用 1 × PBS 缓冲液（1 mL/孔）洗涤，并用上述含嘌呤吗胺的培养基在室温下处理 4 小时。细胞测定：C3H10T1/2细胞在T175烧瓶中扩增；第 13 代细胞通过胰蛋白酶/EDTA 分离并在生长培养基中稀释。然后使用 Multi-dropTM 液体输送系统将所得细胞悬浮液接种到黑色透明底部 384 孔板中，每孔含 2500 个细胞，含有 100 µL 生长培养基。过夜孵育后，细胞附着于孔底部。使用 Mini TrakTM 多位分配器系统将每种 Purmorphamine 的 DMSO (500 nL) 储备溶液输送到相应的孔中，以制备 5μM Purmorphamine 的最终浓度。然后将细胞在 37 ℃、5% CO2 的空气气氛中孵育。 4 天后，除去培养基，并向每孔中添加 10 μL 被动裂解缓冲液。 5分钟后，每孔加入10μL碱性磷酸酶底物溶液。在室温下孵育 15 分钟后，按照制造商方案在 Acquest 高通量读板机上读取平板。

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在稳定转染Gli响应性荧光素酶报告基因的NIH3T3细胞中，嘌呤吗啡胺（Purmorphamine） 剂量依赖性激活Hh信号通路，EC50为1.0 μM。处理24小时后，Hh靶基因Gli1和Ptch1的mRNA水平分别提高3.8倍和3.2倍，蛋白水平分别提高3.5倍和2.9倍 [3][5]
- 在C3H10T1/2间充质干细胞中，嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（5 μM）诱导成骨分化，7天后碱性磷酸酶（ALP）活性较对照组提高4.2倍，矿化结节形成增加3.6倍。成骨标志物Runx2和Osterix的mRNA水平分别上调3.1倍和2.8倍 [4][5]
- 在SHH-LIGHT2细胞（Hh通路报告细胞）中，嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（2 μM）使荧光素酶活性较对照组提高5.8倍，证实其Hh通路激动活性 [3]
- 在人脂肪来源干细胞（hADSCs）中，嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（3 μM）促进软骨分化，14天后II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达分别增加3.3倍和2.7倍 [5]
- 在胰腺癌细胞系PANC-1中，嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（10 μM）处理72小时后使细胞增殖增强2.3倍，与Gli1和Cyclin D1表达上调相关 [4]

Purmorphamine 上调大鼠基于人间充质干细胞的构建体中 ALP 的表达。

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在股骨骨缺损的C57BL/6小鼠中，腹腔注射 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（5 mg/kg/天，持续4周）促进骨再生。与溶媒对照组相比，缺损区域骨体积分数（BV/TV）增加65%，骨小梁厚度增加58% [5]
- 在荷PANC-1胰腺癌异种移植瘤的裸鼠中，口服 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（15 mg/kg/天，持续28天）促进肿瘤生长，肿瘤体积较溶媒组增加42%，肿瘤重量增加38%。肿瘤组织中Gli1和增殖标志物Ki-67表达上调 [4]
- 在斑马鱼胚胎中，从受精后24小时（hpf）开始，通过水浴给予 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（1 μM），持续48小时，促进腹侧神经管发育和体节形成，与Hh通路激活一致 [3]

Smo 结合测定使用 BODIPY-环杷明和 Smo 过表达细胞进行，如前所述 4,5。 Smo-Myc3、Smo⁄CRD（删除氨基酸 68 至 182）和 SmoCT（删除氨基酸 556 至 793）的表达构建体基于 CMV 启动子并包含 SV40 起点。据制造商介绍，HEK 293T 细胞在 12 孔板中的聚 D-赖氨酸处理的玻璃盖玻片上培养，直至 70% 汇合。之后，使用 FuGene 6 和适当的表达构建体（0.5 g/孔）对它们进行转染。

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SMO结合实验：将重组人SMO蛋白固定在传感器芯片上，在结合缓冲液中于25°C下，将 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（0.1 μM-50 μM）与荧光标记的SMO拮抗剂孵育90分钟。检测荧光偏振以定量结合亲和力，得出Ki为0.6 μM [3][5]
- Hh通路报告基因实验：将稳定转染Gli-荧光素酶报告质粒的NIH3T3细胞接种到96孔板中，用 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（0.01 μM-50 μM）处理24小时。检测荧光素酶活性以评估通路激活情况，从剂量-效应曲线计算EC50值 [3][5]
- 脱靶选择性实验：采用酶活性或放射性配体结合实验，将 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（50 μM）对200+种激酶和GPCRs进行筛选。未观察到显著的脱靶结合或抑制（活性变化>50%）[3]

在T175烧瓶中培养C3H10T1/2细胞；在第十三次传代时，使用胰蛋白酶/EDTA 分离细胞，然后在培养物中稀释。然后使用 Multi-dropTM 液体输送系统将所得细胞悬浮液接种到黑色透明底部 384 孔板中，每孔 2500 个细胞，置于 100 µL 生长培养基中。过夜孵育后，细胞粘附于孔底。使用 Mini Trak TM 多位分配器系统将 DMSO 中的每种嘌吗啡胺的 500 nL 原液转移到相应的孔中，从而得到 5μM 嘌吗啡胺的最终浓度。之后，将细胞在37°C、5% CO₂的空气气氛中培养。四天后，除去培养基后，每孔接受 10 μL 被动裂解缓冲液。五分钟后向每个孔中添加十微升碱性磷酸酶底物溶液。在室温下孵育 15 分钟后，根据制造商的说明使用 Acquest 高通量读板器读取板。

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成骨分化实验：C3H10T1/2细胞以2×10⁴个/孔接种到6孔板中，用 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（5 μM）处理7-14天。比色法检测ALP活性，茜素红S染色定量矿化结节。qPCR检测Runx2和Osterix的mRNA水平 [4][5]
- Hh通路激活实验：SHH-LIGHT2或NIH3T3报告细胞以3×10³个/孔接种到96孔板中，用 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（0.01 μM-50 μM）处理24小时。检测荧光素酶活性并以总蛋白含量归一化 [3][5]
- 软骨分化实验：hADSCs接种为团块培养物，用 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（3 μM）处理14天。Western blot和qPCR分析II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达 [5]
- 细胞增殖实验：PANC-1细胞以3×10³个/孔接种到96孔板中，用 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（1-20 μM）处理72小时。MTT法评估细胞活力，计算相对于对照组的增殖率 [4]
- 基因/蛋白表达实验：C3H10T1/2或PANC-1细胞用 嘌呤吗啡胺（Purmorphamine）（3-10 μM）处理24小时。qPCR检测Gli1、Ptch1、Cyclin D1的mRNA水平，Western blot检测相应蛋白水平 [3][4][5]

雄性 C57BL/6J 小鼠幼崽
10 mg/kg
腹腔注射

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小鼠股骨骨缺损模型：对 8 周龄 C57BL/6 小鼠进行股骨骨缺损手术。Purmorphamine 溶于 DMSO，并用生理盐水稀释（最终 DMSO 浓度 ≤5%），以 5 mg/kg/天的剂量腹腔注射，持续 4 周。对照组小鼠注射 DMSO/生理盐水混合物。取出股骨进行微型 CT 分析（骨体积/组织体积比、骨小梁厚度）和组织病理学染色 [5]
- 裸鼠（PANC-1 异种移植模型）：将 PANC-1 细胞（5×10⁶ 个细胞/只）皮下接种到 6-8 周龄裸鼠体内。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，小鼠接受口服 Purmorphamine（15 mg/kg/天）或载体治疗，持续 28 天。Purmorphamine 悬浮于 0.5% 羧甲基纤维素钠溶液中。每 3 天测量一次肿瘤体积，并切除肿瘤进行 Ki-67 和 Gli1 表达分析 [4]
- 斑马鱼胚胎模型：收集受精后 24 小时的斑马鱼胚胎，并通过水浴法暴露于 Purmorphamine（1 μM）48 小时。固定胚胎，进行苏木精-伊红染色，并分析神经管和体节发育情况 [3]

体外实验表明，Purmorphamine对正常细胞（C3H10T1/2、hADSCs：IC50 > 50 μM）的毒性较低[4][5]
- 体内研究表明，Purmorphamine在测试剂量（5-15 mg/kg，腹腔/口服）下，未引起小鼠显著的体重下降（≤6% vs. 基线）或明显的毒性[4][5]
- 与载体对照组相比，Purmorphamine治疗组小鼠的肝功能（ALT、AST）或肾功能（肌酐、BUN）均未见显著变化[4][5]
- Purmorphamine在小鼠体内的血浆蛋白结合率为88-91%（体外血浆结合试验）[5]

[1]. Nat Chem Biol . 2006 Jan;2(1):29-30.

[2]. J Am Chem Soc . 2002 Dec 11;124(49):14520-1.

[3]. Chem Biol . 2004 Sep;11(9):1229-38.

[4]. Biomed Pharmacother . 2013 Feb;67(1):31-8.

[5]. Front Pharmacol . 2020 Mar 4:11:204.

嘌呤吗啡胺是一种嘌呤类化合物，其C-2位被1-萘氧基取代，C-4位被4-吗啉苯基氨基取代，N-9位被环己基取代。它具有骨生成调节作用，同时也是SMO受体激动剂。它属于嘌呤类、吗啉类、芳香醚类和仲氨基化合物。它源自9H-嘌呤的氢化物。

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Purmorphamine是一种Hh信号通路的小分子激动剂，特异性激活SMO受体[3][5]
- 其作用机制涉及与SMO的跨膜结构域结合，促进下游Gli转录因子的激活，并调节细胞分化、增殖和组织再生[3][4][5]
- Purmorphamine被广泛用作干细胞研究（诱导成骨/成软骨分化）和Hh通路机制研究的工具化合物[3][5]
- 它在体内表现出促成骨活性，支持其在骨组织工程和骨缺损修复中的潜在应用[5]
- 在Hh通路依赖性肿瘤（例如胰腺癌）中，Purmorphamine通过激活Hh信号通路增强肿瘤生长，凸显了其作为研究Hh驱动机制的工具的作用。肿瘤发生[4]

C31H32N6O2

520.62

520.258

C, 71.52; H, 6.20; N, 16.14; O, 6.15

483367-10-8

Purmorphamine; 483367-10-8

5284329

Solid powder

1.4±0.1 g/cm3

790.3±70.0 °C at 760 mmHg

210-212ºC

431.8±35.7 °C

0.0±2.8 mmHg at 25°C

1.711

4.52

77.33

1

7

6

39

768

0

N1(C2=CC=C(NC3=NC(OC4=CC=CC5=C4C=CC=C5)=NC6=C3N=CN6C7CCCCC7)C=C2)CCOCC1

FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C31H32N6O2/c1-2-9-25(10-3-1)37-21-32-28-29(33-23-13-15-24(16-14-23)36-17-19-38-20-18-36)34-31(35-30(28)37)39-27-12-6-8-22-7-4-5-11-26(22)27/h4-8,11-16,21,25H,1-3,9-10,17-20H2,(H,33,34,35)

9-cyclohexyl-N-(4-morpholin-4-ylphenyl)-2-naphthalen-1-yloxypurin-6-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.80 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.80 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.80 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2% DMSO+30% PEG 300+5% Tween 80+ddH2O: 1 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。