PX-478 2HCl   中文名称: PX-478盐酸盐

HIF-1α

在含氧量正常的条件下，将 PX-478 应用于表达 HIF-1α 蛋白的 PC3 和 DU 145 细胞 20 小时。 PX-478 对 PC3 细胞的影响大于 DU 145 细胞。根据光密度分析，常氧条件下PC3细胞抑制HIF-1α的IC50为20-25μM，而DU抑制HIF-1α的IC50为40-50μM。在常氧或低氧条件下将不同浓度的 PX-478（10、20、30、40、50 和 60 μM）应用于 PC3 和 DU 145 细胞，持续 18 至 20 小时。在常氧条件下，PC3 细胞比 DU 145 细胞对 PX-478 更敏感。 PC3 细胞 (n=3) 和 DU 145 细胞的克隆形成活力，IC50 值分别为 17 μM 和 35 μM。当细胞在缺氧环境下处理 18 小时时，该药物对 PC3 细胞的半衰期 (IC50) 为 16 μM，对 DU 145 细胞的半衰期为 22 μM。因此，在缺氧环境中，DU 145 细胞更容易受到 PX-478 的影响 [1]。

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缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在人类肿瘤中的过表达与不良预后和放射治疗不良结果有关。抑制HIF-1α被认为是癌症治疗中一种有前景的方法。本研究旨在测试一种新型HIF-1α抑制剂PX-478在常氧和缺氧条件下作为放射增敏剂的体外疗效。用PX-478处理PC3和DU 145前列腺癌细胞20小时，在常氧和缺氧条件下测定HIF-1α蛋白水平和克隆细胞存活率。评估了PX-478对细胞周期分布和H2AX组蛋白磷酸化的影响PX-478降低了PC3和DU 145细胞中的HIF-1α蛋白PX-478在两种细胞系中都产生了细胞毒性，在缺氧条件下对DU-145的毒性增强PX-478（20μmol/L）分别以增强因子（EF）1.4和1.56增强常氧和缺氧条件下照射的PC3细胞的放射敏感性。与EF 1.13（常氧）和1.25（缺氧）的PC3细胞相比，该药物在50 mumol/L浓度下抑制HIF-1α和增强DU 145细胞的放射敏感性方面效果较差PX-478在PC3中诱导S/G2M阻滞，但在DU 145细胞中没有。用药物处理PC3和DU 145细胞导致H2AX组蛋白磷酸化，并延长受照射细胞中γH2AX的表达。PX-478目前正在进行口服药物的I期临床试验。尽管增强辐射敏感性的确切机制仍有待确定，但本研究表明PX-478作为临床辐射增强剂具有潜在作用[1]。

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研究人员测试了Hif1α抑制可以预防HO的假设。为此，使用了药物PX-478，该药物已被证明可以抑制Hif1α的转录和翻译。损伤后3周（3WLST）对肌腱切开部位来源的细胞进行体外处理，并在缺氧条件下培养，结果显示，用PX-478处理后，Hif1α转录物和软骨生成基因转录物Sox9和Acan（聚集蛋白聚糖）的水平降低（图4A）。此外，PX-478和雷帕霉素（一种之前描述的Hif1α抑制剂）均显著降低了从肌腱分离的间充质细胞产生的Hif1 a，再次证实这些药物会影响未来HO位点局部细胞中的Hif1β水平[2]。

出生后两周，患有先天性心脏病的 (Nfatc1-Cre/caACVR1fl/fl) 小鼠每隔一天接受 PX-478 治疗。与接受载体治疗的突变小鼠相比，治疗小鼠踝关节的异位骨量显着减少（6.8 mm3 vs. 2.2 mm3，P<0.01）[2]。

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研究人员接下来测试了用PX-478治疗是否会降低体内Hif1α的表达和软骨形成，从而抑制HO的整体发展。小鼠接受烧伤/肌腱切开术，随后用PX-478治疗；3周后的组织学评估证实，软骨原基显著减少，通常在3周后出现（图4B）。此外，他们发现损伤后3周Hif1α表达减少（图4C）。与这些数据一致，在PX-478治疗组中，Sox9的表达显著降低（图4C）。此外，用PX-478治疗的烧伤/肌腱切开术小鼠在损伤后5周（4.3 mm3对1.5 mm3，P<0.05）和9周（5.8 mm3对2.3 mm3，P>0.05）的总HO体积显著减少（图4D和E）。最后，如二元分析（是/否：χ2=9.5，P<0.01）和定量比较（0.90 mm3 vs.0.00 mm3，P=0.05）所示，9周后，PX-478治疗完全抑制了“软组织”HO——骨外骨，HO在近端横断肌腱和远端腓肠肌内形成，但远离跟骨。[2]

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Hif1α的药理学抑制限制了ACVR1组成活性引起的HO。[2]
研究人员接下来在由caACVR1（ACVR1 Q207D）突变表达引起的组成型ACVR1活性模型中证实了这些发现。注射心脏毒素和Ad.cre的caACVR1fl/fl小鼠产生了强大的HO，该模型已被用于研究ACVR1信号传导的抑制剂。用PX-478处理的caACVR1fl/fl小鼠在Ad.cre/cardiotoxin诱导后，根据五色染色显示软骨或骨几乎消除（图5A）。同样，基于免疫染色，Hif1α和Sox9被消除（图5B）。最后，根据二元分析（是/否；χ2=13.6，P<0.001）和定量比较（18.1 mm3对0.01 mm3，P=0.01），微CT分析证实PX-478治疗组完全不存在HO（图5C和D）
最后，从出生起每隔一天给患有先天性HO（Nfatc1 cre/caACVR1fl/fl）的小鼠注射PX-478，持续2周。与用赋形剂治疗的突变小鼠相比，治疗小鼠的踝关节异位骨明显减少（6.8 mm3对2.2 mm3，P<0.01）。

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在HO模型中，Hif1α的缺失可防止间充质冷凝的形成。[2]
与Hif1α敲除类似，PX-478和雷帕霉素治疗大大减少了间充质祖细胞的存在和间充质凝结的形成，如H&E染色以及PDGFRα和Sox9免疫染色所示（图8）。

常氧条件下的克隆细胞存活试验[1]
为了确定PX-478与辐射联合使用的效果，在常氧条件下用药物处理细胞24小时，1小时后照射并铺板。12天后用结晶紫染色菌落，计数>50个细胞的菌落。对于联合治疗，通过校正单独使用PX-478的毒性来计算净存活率。增强因子（EF）是通过将单独用辐射处理细胞时将镀层效率降低到10%所需的辐射剂量除以用PX-478和辐射处理细胞后将镀层效率降至10%所需辐射剂量来计算的。

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缺氧治疗[1]
细胞被放置在70-cm2的玻璃烧瓶（用于蛋白质印迹）或小玻璃烧瓶中（用于克隆试验）。第二天，取出培养基，向烧瓶中加入含有或不含有PX-478的新鲜培养基。在常氧条件下与药物孵育18-20小时后，用橡胶塞紧紧密封烧瓶。将两根19号针插入橡胶塞中，以引入缺氧气体混合物并将烧瓶相互连接。在温暖的房间里，用95%氮气和5%二氧化碳的混合物给烧瓶充气1小时，诱导缺氧。1小时充气结束后，取下15,29根针，将橡胶塞密封的烧瓶孵育所需的时间。之前用Thermox探头进行的测量表明，烧瓶中的氧分压<10ppm（0.02%），导致放射性缺氧。
在充气1小时后，通过刮取细胞进行蛋白质印迹分析或胰蛋白酶处理并铺板进行克隆存活分析。对于联合治疗，细胞在常氧下用药物预处理20小时，并如上所述进行1小时充气。在1小时缺氧结束时，在缺氧条件下照射充气细胞，并在1小时内进行克隆形成试验。为了研究缺氧期间用PX-478长期治疗的效果，在一些实验中，在缺氧充气前将PX-478添加到细胞中，并用药物将细胞在低氧条件下维持18小时。对于克隆形成试验，将细胞置于无药物培养基中。

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细胞周期分析[1]
用药物处理细胞24小时后，通过碘化丙啶染色，通过流式细胞术分析PX-478对细胞周期分布的影响。对于BrdU染色，将细胞与10μmol/L BrdU一起孵育最后1小时，并按照所述进行处理。31简言之，将细胞胰蛋白酶化，用PBS洗涤，并在70%乙醇中固定过夜。将细胞制成丸粒，通过胃蛋白酶/HCl消化分离细胞核，然后用10mmol/L硼酸盐（pH 8.6）处理以中和酸。然后，如制造商方案所述，用抗BrdU抗体孵育细胞，然后用FITC标记的抗鼠IgG和PI染色孵育。在BD FACSCalibur流式细胞仪上收集细胞周期数据，并使用CellQuest/MOD Fit软件进行分析。

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γH2AX免疫荧光染色[1]
将PC3细胞铺在4孔室载玻片（20000个细胞/ml/孔）中，并用PX-478处理。在所需的时间间隔内，通过抽吸药物培养基去除PX-478，然后照射细胞并在无药物培养基中进一步孵育。在6小时和24小时磷酸化组蛋白时，通过免疫荧光染色分析H2AX（γH2AX）病灶，如上所述。32简而言之，细胞用4%多聚甲醛固定，用0.1%NP-40渗透，用5%山羊血清在1%BSA中封闭。细胞用抗磷酸组蛋白H2AX一抗（1:2000）覆盖，在4°C下孵育过夜。用1%BSA洗涤后，用FITC山羊抗兔二抗（1:100）处理细胞1小时，然后在黑暗中进行30分钟DAPI（1μg/mL）染色。盖玻片上涂有防磨溶液。在Leica DMRXA荧光显微镜上检查载玻片。图像由光度计Sensys CCD相机捕获，并导入在Macintosh G3计算机上运行的IP Labs图像分析软件包。对于每种情况，分析了2到3个单独实验中的约70-100个细胞，以确定每个细胞的γH2AX病灶数量。

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间充质干细胞的分离与培养。[2]
在野生型小鼠中，从跟骨到腓骨和胫骨汇合处的肌腱横断部位收获小鼠间充质干细胞。将所有组织机械切碎，用胶原酶A和dispase消化，然后铺板。为了测试药物治疗对Hif1α表达的影响，将细胞在含0.5%氧气的缺氧室中培养。在缺氧处理前24小时开始用PX-478（10μM）或雷帕霉素（5μM）进行细胞处理，并在缺氧条件下重新处理24小时。收集蛋白质，用Western blot分析Hif1α和α-微管蛋白。为了测试PX-478处理对软骨生成的影响，将从肌腱分离的细胞在软骨生成分化培养基（PT-3925和PT-4121；龙沙）中培养。所有体外实验均以生物和技术一式三份进行。

携带 MCF-7 人乳腺癌、HT-29 结肠癌、PC-3 前列腺癌、DU-145 前列腺癌、OvCar-3 卵巢癌、A-549 非小细胞肺癌、SHP-77 小细胞肺癌、Caki-1 肾癌、Panc-1、MiaPaCa 或 BxPC-3 胰腺癌异种移植瘤的小鼠。

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骨外骨模型。[2]
烧伤/肌腱切断小鼠在剃毛后的背部接受 30% 体表面积 (TBSA) 的部分厚度烧伤，随后切断左后肢跟腱。使用在水浴中加热至 60°C 的金属块连续烧伤背部 18 秒。肌腱切断部位仅用一根 5-0 薇乔缝线缝合皮肤。
caAcvr1fl:fl 小鼠在出生后第 24 天接受后肢心脏毒素和 Ad.cre 注射。随后，小鼠分别在 22 天（PX-478）或 15 天（雷帕霉素）后处死。每种药物处理均设置单独的对照组，以消除处死日期差异的影响。
Nfatc1-Cre/caAcvr1fl:wt 小鼠是通过将 Nfatc1-Cre+ 小鼠与 caAcvr1fl:wt 小鼠杂交而获得的。所得突变体在出生后第 4-5 天出现骨外骨。

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药物处理。[2]
烧伤/腱切开或混合型 HO 小鼠通过腹腔注射给予溶于 PBS 溶液的 PX-478（100 mg/kg）或雷帕霉素（5 mg/kg）。在整个研究期间，小鼠每隔一天注射一次。每隔一天给 Nfatc1-Cre/caACVR1fl:wt 小鼠注射 PX-478 (100 mg/kg)，共注射 2 周。

[1]. PX-478, an inhibitor of hypoxia-inducible factor-1alpha, enhances radiosensitivity of prostate carcinoma cells. Int J Cancer. 2008 Nov 15;123(10):2430-2437.

[2]. Inhibition of Hif1α prevents both trauma-induced and genetic heterotopic ossification. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Jan 19;113(3):E338-47.

PX-478 是一种小分子缺氧诱导因子 (HIF)-1α 抑制剂，目前正在进行针对晚期转移性癌症和淋巴瘤患者的临床试验。PX-478 在表达 HIF-1α 的非小细胞肺癌和小细胞肺癌模型中均显示出疗效。
HIF-1α 抑制剂 PX-478 是一种口服有效的小分子药物，具有潜在的抗肿瘤活性。尽管其作用机制尚未完全阐明，但 HIF1α 抑制剂 PX-478 似乎能够抑制缺氧诱导因子 1α (HIF1A) 的表达，这可能导致对肿瘤生长和存活至关重要的 HIF1A 下游靶基因表达降低，从而减少肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡。该药物的抑制作用与肿瘤抑制基因VHL和p53无关，可能与葡萄糖转运蛋白-1 (Glut-1) 的抑制导致的葡萄糖摄取和代谢紊乱有关。

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药物适应症
已研究用于治疗癌症/肿瘤（未具体说明）。

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作用机制
PX-478是一种新型小分子化合物，可抑制缺氧诱导因子 (HIF)-1α的活性。HIF-1α是一种转录因子，控制着许多对癌细胞生长和存活至关重要的基因的表达。HIF-1α调控的基因参与多种功能，包括新血管生成、葡萄糖供能和抵抗细胞凋亡（程序性细胞死亡）。临床前数据表明，PX-478 可诱导实验性肿瘤模型中的细胞凋亡，并下调血管生成调控因子，例如血管内皮生长因子 (VEGF)。实体瘤通常包含异质性缺氧区域。除了距离血管 100-150 mm 的细胞中存在的扩散限制性慢性缺氧外，一些肿瘤细胞也可能由于异常肿瘤血管导致的间歇性血液供应而经历灌注限制性间歇性缺氧。我们的数据显示，新型 HIF-1α 抑制剂 PX-478 可降低常氧和缺氧条件下前列腺癌细胞的存活率，并增强其放射敏感性。此外，在常氧条件下用PX-478处理细胞，然后在缺氧1小时后进行照射，结果显示细胞的放射敏感性增加，这表明经历间歇性缺氧的细胞如果预先暴露于PX-478，也能对辐射产生反应。除了抑制HIF-1α外，PX-478还能改变细胞周期进程，并延长照射细胞中γH2AX的表达。我们的数据表明，在常氧和缺氧条件下照射的细胞的放射敏感性均增强，这提示PX-478是一种有前景的辐射调节剂。PX-478诱导的组蛋白H2AX磷酸化表明该药物可能造成DNA损伤，提示其具有药物毒性。一项临床前研究描述了，对非免疫缺陷的C57BL/6小鼠每日给予PX-478，连续5天，其主要急性毒性为中性粒细胞减少症。¹³ 该药物目前正处于I期临床试验阶段（PX-478-001 NCT00522652，http://clinicaltrials.gov），使其成为放射治疗中用于治疗乏氧细胞的潜在新药。[1]

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病理性骨外骨形成，或异位骨化（HO），发生于机械创伤、烧伤、骨科手术后，以及I型骨形态发生蛋白受体ACVR1（激活素1型受体）过度激活突变的患者中。骨外骨的形成是通过软骨内成骨过程，并以软骨为中间体，由此引出一个假设：软骨形成过程中存在的缺氧信号驱动异位骨化（HO）的发生，并且HO前体细胞来源于由配对相关同源框1（Prx）定义的间充质谱系。本文证明，缺氧诱导因子-1α（Hif1α）——细胞适应缺氧的关键介质——在三种不同的HO小鼠模型中均高表达且具有活性：创伤诱导型、遗传型以及遗传和创伤诱导型混合模型。在所有这些模型中，Hif1α的表达均与软骨主转录因子Sox9（性别决定区Y-box 9）的表达相一致。使用PX-478或雷帕霉素进行Hif1α的药理学抑制可显著减少或抑制骨外骨的形成。重要的是，在接受治疗的小鼠中，新发的软组织HO被消除或显著减少。谱系追踪小鼠实验表明，形成异位骨化的细胞属于Prx谱系。在谱系特异性Hif1α敲除小鼠（Prx-Cre/Hif1α(fl:fl)）中进行烧伤/腱切开术，结果显示异位骨化显著减少，并且再次未观察到新生软组织异位骨化的发生。Prx-cre标记的间充质细胞中Hif1α的基因缺失可阻止间充质凝集的形成，这已通过常规组织学和Sox9及PDGFRα的免疫染色得到证实。Hif1α的药理学抑制对间充质凝集的形成也具有类似的影响。我们的研究结果表明，Hif1α是预防和治疗病理性骨外病变的一个有前景的靶点。[2]

C13H20CL4N2O3

392.0230

392.022

C, 39.62; H, 5.12; Cl, 35.98; N, 7.11; O, 12.18

685898-44-6

685898-44-6 (HCl); 685847-78-3;

11234794

Off-white to yellow solid powder

4.262

92.75

4

4

8

22

304

1

C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)N)[N+](CCCl)(CCCl)[O-].Cl.Cl

GIGCDIVNDFQKRA-LTCKWSDVSA-N

InChI=1S/C13H18Cl2N2O3.2ClH/c14-5-7-17(20,8-6-15)11-3-1-10(2-4-11)9-12(16)13(18)19;;/h1-4,12H,5-9,16H2,(H,18,19);2*1H/t12-;;/m0../s1

4-[(2S)-2-amino-2-carboxyethyl]-N,N-bis(2-chloroethyl)benzeneamine oxide;dihydrochloride

PX478; PX-478; PX 478 dihydrochloride; 685898-44-6; PX-478; PX-478 2HCl; PX478; PX 478; PX-478 HCl; UNII-T23U22X160; (S)-4-(2-amino-2-carboxyethyl)-N,N-bis(2-chloroethyl)aniline oxide dihydrochloride; PX478 HCl;PX478 Hydrochloride;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 78 mg/mL (197.9 mM) Water:78 mg/mL (197.9 mM) Ethanol: N/A

配方 1 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (12.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (12.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (12.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.34 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.34 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.27 mM) (饱和度未知) in 1% DMSO 99% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 7 中的溶解度: 10% DMSO: 40% PEG300: 5% Tween-80: 45% Saline: ≥ 5 mg/mL (12.7 mM)

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配方 8 中的溶解度: 16.67 mg/mL (42.30 mM) in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。