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描述：PYR-41 是一种泛素激活酶抑制剂（UBE1 抑制剂）。PYR-41 可阻断泛素化反应，但矛盾的是，它会导致高分子量泛素化蛋白的积累。PYR-41 还介导特定蛋白激酶（Bcr-Abl、Jak2）的交联，从而抑制其信号传导活性。动物研究表明，PYR-41 具有抗肿瘤活性，其部分选择性的蛋白交联可能代表了一种影响信号转导模块和泛素循环调控蛋白的癌症治疗新策略。(Biochem Pharmacol. 2011 Aug 15;82(4):341-9.)（溶液中的 PYR-41 可能以 E- 和 Z- 异构体的混合物形式存在。根据条件不同，高效液相色谱 (HPLC) 可能显示两个峰。）
| 靶点 |
E1(IC50: < 10 μM)
Ubiquitin-activating enzyme (E1). It is the first reported cell-permeable inhibitor of the ubiquitin E1 enzyme. In vitro, it inhibits ubiquitin loading onto E1 with an IC50 of <10 μM. At 50 μM, it achieves at least 95% inhibition [1]. |
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| 体外研究 (In Vitro) |
PYR-41不仅能抑制泛素化，还能提高细胞内总SUMO化水平。PYR-41可降低细胞因子介导的核因子-κB活化。此外，PYR-41还能阻止下游IκBα的泛素化和蛋白酶的降解。而且，PYR-41还能刺激该肿瘤抑制因子的转录活性，并阻止p53的降解[1]。PYR-41（50 μM）可促进泛素化蛋白的积累。4小时后，Z138细胞中DUB活性呈浓度依赖性下降（10-50 μM），这是由于PYR-41的作用所致。即使在最低浓度（10 μM）下，PYR-41也能有效抑制USP5 DUB活性。 PYR-41 能以强效（10-50 μM）抑制多种去泛素化酶 (DUB) 的活性，这些酶已被鉴定为 USP9x、USP5、USP14、UCH37 和 UCH-L3。当 DTT 和 PYR-41 同时应用于 Z138 细胞时，泛素化蛋白的积累被完全消除[2]。
PYR-41 通过阻断 E1 与泛素之间的硫酯键形成，直接抑制泛素 E1 酶。它不抑制 E2 酶（UbcH5B、Ube2G2）或 caspase。在体外，PYR-41 在几乎完全抑制 E1 的浓度下，对 HECT 结构域 E3 酶（Nedd4、E6-AP）表现出部分抑制作用[1]。 PYR-41 在体外抑制泛素介导的蛋白酶体降解。它能阻断 S100 胞质溶胶中的细胞周期蛋白 E 降解，而添加外源性 E1 可逆转这一作用。它还能抑制兔网织红细胞裂解液中 E6 刺激的 p53 降解 [1]。 PYR-41 能降低细胞中 E1~Ub 硫酯的水平，IC50 值介于 10-25 μM 之间。 PYR-41 可阻断蛋白酶体抑制剂 ALLN 诱导的泛素缀合物积累 [1]。 PYR-41 出乎意料地增加了细胞内的总 SUMO 化水平，这种效应在温度敏感的 E1 突变细胞在限制温度下也观察到，表明抑制 E1 足以增加 SUMO 化水平 [1]。 PYR-41 抑制配体诱导的 EGFR 泛素化，延长 EGFR 磷酸化，并延缓受体下调 [1]。 PYR-41 抑制细胞因子诱导的 NF-κB 激活。它阻断 IL-1α 诱导的 TRAF6 泛素化，延缓 IκBα 磷酸化，并阻止 TNF-α 刺激后 IκBα 的降解 [1]。 PYR-41 增加 p53 蛋白水平和转录活性。在 20 μM 浓度下，PYR-41 诱导的 p53 报告基因活性与阿霉素相当。它还能提高 Hdm2 和 p21 (WAF-1) 的水平 [1]。 PYR-41 能差异性地杀死转化细胞，尤其是表达野生型 p53 的细胞。E1A 转化的 RPE 细胞在 20 小时内以剂量依赖的方式被杀死，而未转化的 RPE 细胞则相对具有抵抗力。与 p53 缺陷型 MEF 细胞 (A9) 相比，表达 p53 的转化 MEF 细胞 (C8) 表现出显著更高的剂量依赖性细胞死亡率 [1]。 |
| 酶活实验 |
将32P-泛素在室温下于1×反应缓冲液（50 mM Tris (pH 7.4)、0.2 mM ATP和0.5 mM MgCl2）中与兔或鼠E1蛋白（约250 ng）孵育15分钟。在某些实验中，孵育和反应前，将His标签的鼠E1蛋白与TALON钴亲和树脂结合。将1×反应缓冲液中的树脂珠与鼠E1蛋白和32P-泛素混合，然后进行与E1反应类似的孵育。将样品在非还原性SDS-PAGE上样缓冲液中加热后，通过SDS-PAGE进行分离。 Storm PhosphoImager 可对含有泛素的硫酯进行可视化。
在 E1 抑制实验中，将兔或鼠 E1（约 250 ng）与 32P-泛素在反应缓冲液 [50 mmol/L Tris (pH 7.4)、0.2 mmol/L ATP、0.5 mmol/L MgCl2] 中于室温孵育 15 分钟。在某些实验中，将 His 标签的鼠 E1 在孵育前固定在 TALON 钴亲和树脂上。将样品在非还原性 SDS-PAGE 上样缓冲液中加热，并通过 SDS-PAGE 电泳分离。使用 Phosphorimager 对含有泛素的硫酯进行可视化。为测试可逆性，将固定化的 E1 用 PYR-41 处理 15 分钟，然后在硫酯测定前彻底洗涤 [1]。 对于 E2 测定，将 GST-UbcH5B（约 900 ng）结合到谷胱甘肽琼脂糖珠上。将小鼠 E1 和 32P-泛素加入反应缓冲液中，并按照 E1 反应的条件进行孵育 [1]。 对于竞争实验，将固定化的 E1（2 pmol）与 PYR-41 和过量的还原型谷胱甘肽 (GSH)（相对于 E1 过量 10⁴-10⁵ 倍）预处理 15 分钟。洗涤磁珠后，评估 Ub~E1 硫酯的形成[1]。 对于体外降解实验，将35S 标记的细胞周期蛋白 E 加入到预先用 DMSO 或PYR-41 (50 μmol/L) 孵育 30 分钟的 S100 胞质溶胶 (50 μg) 中。在 90 分钟内取样，并通过 SDS-PAGE 和放射自显影进行分析。在拯救实验中，于 PYR-41 处理 30 分钟后加入重组 E1（250 ng，终浓度 50 nmol/L）[1]。 对于 p53 降解实验，将 35S 标记的 p53 和 HPV-16 E6 在兔网织红细胞裂解液中孵育，孵育时间最长可达 3 小时，孵育过程中加入或不加入 PYR-41，然后通过 SDS-PAGE 和放射自显影进行分析 [1]。 |
| 细胞实验 |
对于细胞 E1 硫酯分析，将 RPE 细胞用指定化合物（50 μmol/L PYR-41、20 μmol/L HL98C 或 10 mmol/L 碘乙酰胺）处理 30 分钟。用含尿素的缓冲液制备细胞裂解液，在非还原性或还原性样品缓冲液中加热，并用抗 E1 抗体进行免疫印迹分析 [1]。
对于泛素缀合物积累，将 RPE 细胞暴露于 PYR-41 (50 μmol/L) 或 DMSO 30 分钟，然后用或不用 ALLN (50 μmol/L) 处理 90 分钟。裂解物用抗泛素抗体进行免疫印迹分析[1]。 对于SUMO化研究，用强力霉素（2 μg/mL）诱导表达四环素可诱导Myc-SUMO-1的HEK293细胞20小时，然后用PYR-41（0-50 μmol/L）处理4小时。裂解物用抗Myc抗体进行免疫印迹分析[1]。 对于EGFR研究，HeLa细胞用PYR-41（50 μmol/L）预处理15分钟，然后用EGF（100 ng/mL）刺激指定时间。细胞裂解物用抗 EGFR 抗体进行免疫沉淀，然后进行泛素免疫印迹，或直接进行磷酸化 EGFR 和总 EGFR 免疫印迹 [1]。 对于 NF-κB 荧光素酶检测，将转染了 NF-κB 反应元件驱动的荧光素酶报告基因的 HeLa 细胞用 PYR-41 预处理 30 分钟，然后用 IL-1α (1 或 10 ng/mL) 刺激 2 小时。测定了荧光素酶活性[1]。 对于TRAF6泛素化，将HeLa细胞用PYR-41（50 μmol/L）处理15分钟，用IL-1α（10 ng/mL）刺激5分钟，用抗TRAF6抗体进行免疫沉淀，并进行泛素免疫印迹分析[1]。 对于IκBα分析，将HeLa细胞用PYR-41预处理10分钟，用IL-1α（10 ng/mL）刺激指定时间，并对裂解物进行IκBα和磷酸化IκBα的免疫印迹分析。将 2B4 T 细胞用 DMSO、PYR-41 (50 μmol/L) 或 ALLN (50 μmol/L) 预处理 15 分钟，然后用 TNF-α 刺激 [1]。 对于 p53 活性，将 U2OS-pG13 细胞（具有 p53 反应元件驱动的荧光素酶）用 DMSO、阿霉素 (1 μg/mL) 或 PYR-41 (10-50 μmol/L) 处理 20 小时，然后测量荧光素酶活性。 U2OS 细胞用阿霉素 (1 μg/mL)、MG132 (50 μmol/L) 或 PYR-41 (10-50 μmol/L) 处理 6 小时，然后进行 p53、Hdm2 和 p21 的免疫印迹分析 [1]。 细胞活力检测中，RPE 和 RPE-E1A 细胞用 PYR-41 (0-50 μmol/L) 处理 20 小时，并通过台盼蓝排除法评估细胞活力。C8 (p53+/+) 和 A9 (p53-/-) 转化的 MEF 细胞用 PYR-41 (0-50 μmol/L) 处理长达 24 小时，并评估细胞活力 [1]。 |
| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
该化合物表现出差异性细胞毒性，优先杀死转化细胞。在RPE-E1A转化细胞中，PYR-41可在20小时内诱导剂量依赖性细胞死亡。未转化的RPE细胞表现出相对的抵抗力，但在较高浓度（20 μmol/L）下观察到一定的生长抑制。PARP裂解和DNA片段化证实了细胞死亡的凋亡性质。在转化的MEF细胞中，表达p53的细胞（C8）与p53缺陷细胞（A9）相比，对PYR-41诱导的细胞死亡表现出显著更高的敏感性[1]。
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| 参考文献 |
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| 其他信息 |
PYR-41 是一种乙酯，由 4-{4-[(5-硝基呋喃-2-基)亚甲基]-3,5-二氧吡唑-1-基}苯甲酸的羧基与乙醇缩合而成。它是一种不可逆的、可穿过细胞膜的泛素激活酶 E1 抑制剂。它既是 EC 6.2.1.45（E1 泛素激活酶）抑制剂，也是一种抗肿瘤药物。它属于呋喃类、C-硝基化合物、吡唑烷类化合物和苯甲酸酯类乙酯。
PYR-41 是首个被报道的可透过细胞膜的泛素激活酶 (E1) 抑制剂。该化合物最初是通过高通量筛选Hdm2泛素连接酶活性抑制剂而发现的，但后来发现它抑制的是E1。其结构中含有一个硝基取代的呋喃环，该环可能对其活性至关重要。过量游离硫醇（GSH）可猝灭其活性，这提示该化合物可能通过共价修饰E1活性位点的半胱氨酸发挥作用[1]。 抑制E1可阻断泛素化的蛋白酶体和非蛋白酶体功能。该化合物揭示了泛素化和SUMO化之间的相互关系，因为E1抑制剂会导致细胞内SUMO化水平升高——这一发现已在温度敏感的E1突变细胞中得到证实[1]。 PYR-41具有多种潜在的治疗作用：它抑制NF-κB的激活（包括上游TRAF6的K63连接泛素化和下游IκBα的蛋白酶体降解），稳定并激活p53，提高p21水平，并差异性地杀死转化细胞，特别是那些具有野生型p53的转化细胞。这些特性表明，尽管E1抑制剂对多种细胞通路具有广泛的影响[1]，但它们可能具有癌症治疗的潜力。 |
| 分子式 |
C17H13N3O7
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|---|---|
| 分子量 |
371.30102
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| 精确质量 |
371.075
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| 元素分析 |
C, 54.99; H, 3.53; N, 11.32; O, 30.16
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| CAS号 |
418805-02-4
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| 相关CAS号 |
418805-02-4
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| PubChem CID |
5335621
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| 外观&性状 |
Brown solid powder
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| 密度 |
1.5±0.1 g/cm3
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| 折射率 |
1.652
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| LogP |
2.87
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| tPSA |
134.67
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| 氢键供体(HBD)数目 |
1
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| 氢键受体(HBA)数目 |
7
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| 可旋转键数目(RBC) |
5
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| 重原子数目 |
27
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| 分子复杂度/Complexity |
664
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
O1C(=C([H])C([H])=C1/C(/[H])=C1/C(N([H])N(C/1=O)C1C([H])=C([H])C(C(=O)OC([H])([H])C([H])([H])[H])=C([H])C=1[H])=O)[N+](=O)[O-]
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| InChi Key |
ARGIPZKQJGFSGQ-LCYFTJDESA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C17H13N3O7/c1-2-26-17(23)10-3-5-11(6-4-10)19-16(22)13(15(21)18-19)9-12-7-8-14(27-12)20(24)25/h3-9H,2H2,1H3,(H,18,21)/b13-9-
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| 化学名 |
ethyl 4-(4-((5-nitrofuran-2-yl)methylene)-3,5-dioxopyrazolidin-1-yl)benzoate
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| 别名 |
PYR41; PYR 41; PYR-41.
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : 46~74 mg/mL ( 123.89~199.29 mM )
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: 2% DMSO + 30% PEG300 + 5% Tween80 + 63% ddH2O: 2mg/ml 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.6932 mL | 13.4662 mL | 26.9324 mL | |
| 5 mM | 0.5386 mL | 2.6932 mL | 5.3865 mL | |
| 10 mM | 0.2693 mL | 1.3466 mL | 2.6932 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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