Human 80S ribosome (binds selectively; no IC50/Ki/EC50 reported). [1]

R-IMPP 可提高 LDL-R 水平，而不改变转铁蛋白的释放量，从而刺激肝癌细胞对 LDL-C 的摄取。R-IMPP 可导致 PCSK9 翻译的转录依赖性抑制，但既不增加也不减少 PCSK9 的转录。R-IMPP 仅与人核糖体结合，不与大肠杆菌核糖体结合 [1]。在 Huh7 细胞中，R-IMPP (30 μM) 可降低分泌的 PCSK9 水平并增加细胞表面 LDL-R 的表达，从而导致 Alexa Fluor 546 标记的 LDL 摄取增加（增加 47.5% ± 6.6%）。对转铁蛋白的分泌无影响。[1] 在 WT-7 细胞（过表达 V5 标签 PCSK9 的 Huh7 细胞）中，R-IMPP (30 μM) 可在 1 小时内降低 PCSK9 蛋白水平，但不影响 PCSK9 mRNA（qPCR）。脉冲追踪实验表明，pro-PCSK9 和成熟 PCSK9 的生成减少，但对白蛋白无影响。蛋白酶体抑制剂（MG132、ALLN）和溶酶体抑制剂（氯喹、抑蛋白酶）均不能逆转 R-IMPP 的作用，排除了降解增加的可能性。[1]
在 HeLa 无细胞体外翻译实验中（30 μM），R-IMPP 抑制了全长 PCSK9-荧光素酶和前结构域 (1-152)-荧光素酶融合 mRNA 的翻译，但并不抑制单独的荧光素酶的翻译。[1]
亲和选择质谱分析表明，R-IMPP 选择性地与人 80S 核糖体结合，但不与大肠杆菌核糖体结合；S-IMPP 的结合力则弱得多。[1]

核糖体结合分析 (ASMS)：将纯化的人类 (7.6 μM) 和大肠杆菌 (7.0 μM) 核糖体与测试化合物（各 10 μM）孵育，并进行亲和选择质谱分析。高三尖杉酯碱和阿奇霉素分别用作人类和大肠杆菌核糖体的结合对照。记录叠加的提取离子色谱图。[1]
核糖体纯化：HeLa 细胞和大肠杆菌的核糖体按照先前描述的方法进行纯化（Maguire 等，2008；Khatter 等，2014）。通过分析型超速离心和蛋白质质谱分析确定其质量。[1]

高通量表型筛选：使用过表达ProLabel标记的PCSK9的CHO-K1细胞。筛选出的化合物在多种细胞毒性试验和对其他分泌蛋白的影响的复筛中进行评估。[1]
PCSK9和转铁蛋白ELISA（AlphaLISA）：将Huh7细胞以7500个细胞/孔的密度接种于384孔板中，每孔加入2 μL待测化合物。最终体积为20 μL。细胞在37°C、5% CO2条件下孵育过夜（16-20小时）。然后加入5 μL生物素化抗体（终浓度3 nM）和抗体偶联的Alphabeads磁珠（终浓度10 μg/mL），孵育0.5小时，再加入5 μL链霉亲和素供体磁珠（终浓度40 μg/mL），室温孵育1小时。使用 EnVision 酶标仪读取结果（激发波长 680 nm，发射波长 615 nm）。[1]
LDL 摄取实验：将 Huh7 细胞以 20,000 个细胞/孔的密度接种于黑色 96 孔透明底板中。在含 DMSO 的无血清培养基中培养过夜，或进行其他处理，然后加入 10 μg/mL AF-LDL 孵育 24 小时。用含 2 mg/mL BSA 的 TBS 缓冲液洗涤细胞，并用 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞。在激发波长 520 nm、发射波长 580 nm 处读取荧光值。LDL 摄取量根据蛋白质浓度（BCA 法）进行标准化。 [1]
LDL-R免疫印迹：将蛋白裂解液在4%-12% SDS-PAGE凝胶上分离，转移至硝酸纤维素膜，用3%脱脂奶粉封闭，与一抗（山羊抗人LDL-R、兔抗PCSK9、小鼠抗β-肌动蛋白）孵育，然后与HRP标记的二抗孵育，最后用化学发光法检测信号。[1]
qRT-PCR：详见补充实验步骤（正文中未完全描述）。[1]
时间进程：将WT-7细胞以1×10^6个细胞/孔的密度接种于6孔板中，分别用载体或30 μM R-IMPP处理0.5、1、2、4、8和24小时。用2× SDS-PAGE缓冲液裂解细胞。使用抗V5抗体（1:5000）和抗β-肌动蛋白抗体，通过免疫印迹法检测PCSK9和β-肌动蛋白。[1]
蛋白酶处理：WT-7细胞预先用2 μg/mL抑蛋白酶、17 μg/mL ALLN、25 μM氯喹或1 μM MG132处理2小时，然后用30 μM R-IMPP处理1小时。通过免疫印迹法测定PCSK9和β-肌动蛋白水平。[1]
脉冲追踪：WT-7细胞预先在不含甲硫氨酸/半胱氨酸的RPMI培养基中用0.1% DMSO或30 μM R-IMPP处理2小时，然后用³⁵S标记的氨基酸处理0.5小时。在含DMSO或R-IMPP的完全培养基中追踪1、2、3小时。细胞裂解液和培养基经抗PCSK9或抗白蛋白抗体免疫沉淀后，经SDS-PAGE分离，干燥后进行磷成像。[1]
PCSK9截短研究：使用Fugene 6将全长或截短的PCSK9-V5构建体（1 μg DNA，PCSK9-152为2 μg）转染至Huh7细胞。24小时后，分别用载体、30 μM R-IMPP或30 μM S-IMPP处理24小时。裂解液进行V5和β-肌动蛋白的免疫印迹分析。[1]
荧光素酶报告基因检测：将编码PCSK9信号序列和前结构域与萤火虫荧光素酶融合的DNA（pCMV-PCSK9proLuc）以及20个氨基酸缺失突变体瞬时转染至Huh7细胞。 24 小时后，分别用载体、30 μM R-IMPP 或 30 μM S-IMPP 处理 24 小时。荧光素酶活性以 β-半乳糖苷酶共转染进行标准化。数据以三次重复实验的平均值 ± 标准差表示。[1]
体外翻译实验：从悬浮细胞制备 HeLa 裂解液。使用 T7 试剂盒将线性模板 DNA 转录为 mRNA。将 50 nL 测试化合物加入含有 0.5% DMSO 载体和 50 μM 嘌呤霉素（作为对照）的 384 孔板中。 10 μL IVT 混合液，包含 HeLa 细胞裂解液、1.25 mM ATP、0.12 mM GTP、20 mM 磷酸肌酸、60 μg/mL 磷酸己烷肌酸、90 μg/mL tRNA、氨基酸、1.6 mM 乙酸镁、112 mM 乙酸钾、4.6 mM TCEP、8 单位 RNasin 和 0.1 μg 荧光素酶报告基因 mRNA。30°C 孵育 45 分钟。然后取 1 μL 转移至 25 μL Steady-Glo 试剂盒中，并在 EnVision 酶标仪上读取结果。[1]

分子量：389。LogD（pH 7.4）：1.1。渗透性（MDCKII-LE 细胞中的 Papp AB）：5.4 × 10^-6 cm/s。[1]

THLE细胞毒性（ATP耗竭，72小时）：IC50 = 230 μM。[1]
Caspase-Glo 3/7凋亡检测：IC50 > 300 μM。[1]
HepG2细胞（72小时）：IC50 = 79 μM。[1]
HepG2细胞在葡萄糖中（24小时）：IC50 = 160 μM。[1]
HepG2细胞在半乳糖中（24小时）：IC50 = 100 μM。[1]

[1]. A Small-Molecule Anti-secretagogue of PCSK9 Targets the 80S Ribosome to Inhibit PCSK9 Protein Translation. Cell Chem Biol. 2016 Nov 17;23(11):1362-1371.

R-IMPP是首个小分子PCSK9抗分泌剂，其作用机制是通过与人80S核糖体结合抑制PCSK9的翻译。其活性具有序列依赖性，需要信号肽和部分前结构域。它不影响一般的蛋白质合成（对单独的荧光素酶或白蛋白无影响）。对映体S-IMPP在PCSK9分泌和LDL摄取实验中均无活性。R-IMPP选择性地与人核糖体结合，但不与大肠杆菌核糖体结合。这代表了一种调节PCSK9的新机制。[1]

C24H27N3O2

389.490085840225

389.21

C, 74.01; H, 6.99; N, 10.79; O, 8.22

2133832-83-2

2133832-83-2;2173005-10-0 (HCl);

122198706

Light yellow to yellow solid powder

3.8

54.5

1

4

6

29

520

1

COC1=CC=C(C=C1)CCC(=O)N([C@@H]2CCCNC2)C3=NC=CC4=CC=CC=C43

(R)-N-(isoquinolin-1-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-N-(piperidin-3-yl)propanamide

OKTGXQMSOIQCTJ-HXUWFJFHSA-N

R-IMPP RIMPP R IMPP

R-IMPP PF-00932239 RIMPP PF00932239 R IMPP

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~256.75 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.42 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。