RG2833 (RGFP109)

Histone Deacetylase; HDAC3 ( IC50 = 50 nM ); HDAC1 ( IC50 = 60 nM ); HDAC1 ( Ki = 32 nM ); HDAC3 ( Ki = 5 nM )

- 上调共济失调蛋白（Frataxin）：在弗里德赖希共济失调（Friedreich's ataxia）患者成纤维细胞中，RG2833（0.1–10 μM）呈剂量依赖性上调frataxin蛋白表达，1 μM时增加2.5倍。Western blot分析证实frataxin和乙酰化组蛋白H3K9水平升高，qPCR显示FXN mRNA水平增加1.8倍[1]
- 细胞活力维持：RG2833（1–10 μM）处理正常人类成纤维细胞和HEK293细胞72小时，MTT法检测显示细胞存活率无显著变化[1]
- HDAC抑制活性：RG2833在细胞裂解液中有效抑制HDAC1和HDAC2活性，IC50分别为0.1 μM和0.3 μM。荧光法检测显示其剂量依赖性抑制去乙酰化反应[1]

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体外活性：RGFP109 剂量依赖性上调从 FRDA 患者获得的未刺激外周血单核细胞 (PBMC) 培养物中的 frataxin mRNA 和蛋白质水平。激酶测定：通过将小鼠脑组织在冰上以 10% w/v 的 CellLytic MT 哺乳动物组织裂解/提取缓冲液匀浆，然后在 4°C 下以 800×g 离心 10 分钟来测定乌头酸酶活性。然后将组织裂解物 (50 μL) 添加到 200 μL 底物混合物中（50 mM Tris/HCl pH 7.4、0.4 mM NADP、5 mM 柠檬酸钠、0.6 mM MgCl2、0.1% (v/v) Triton X-100 和 1U异柠檬酸脱氢酶），反应在 37°C 下孵育 15 分钟，然后在 340 nm、37°C 下每分钟进行分光光度吸光度测量，持续 15 分钟，以确定反应斜率。然后将小鼠脑组织的乌头酸酶活性标准化为柠檬酸合酶活性，这是使用柠檬酸合酶测定试剂盒测定的。细胞测定：RG2833 对 HDAC1 和 HDAC3 的 Ki 值分别为 5.4 nM 和 7.8 nM。 RG2833 在 1 至 10 µM 的整个测试浓度范围内均具有高活性。与 RG2833 连续孵育可减缓 frataxin 蛋白的增加，当去除该化合物时，患者 P13 细胞中的 frataxin 蛋白水平迅速增加。 RG2833 显着增加大脑乌头酸酶活性，同时减少背根神经节 (DRG) 的神经元病理。

- YG8R小鼠神经保护作用：口服RG2833（10 mg/kg/天，持续4周）显著改善YG8R小鼠运动协调性，转棒测试中跌落潜伏期延长。组织学分析显示脊髓神经元丢失减少30%，肝脏和脑组织frataxin水平增加2倍[2]
- 减轻L-DOPA诱导的异动症：在MPTP损伤的狨猴模型中，RG2833（0.1–1 mg/kg口服）使L-DOPA激发的异动症严重程度降低40–60%。PET成像显示纹状体多巴胺转运体结合恢复，黑质氧化应激标志物减少[3]

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RG2833 (150 mg/kg) 可纠正 frataxin 缺陷并增加 KIKI 小鼠大脑和心脏中的组蛋白乙酰化，而没有急性毒性迹象。 RGFP109 改善 Friedreich 共济失调小鼠模型的疾病表型。 RGFP109（30 mg/kg，口服）还可减轻左旋多巴引起的运动障碍。

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RGFP109的亚慢性治疗缓解了l-DOPA诱导的运动障碍[3]
RGFP109的急性挑战并没有降低LID的严重程度，正如D1和D6在一定程度上缺乏抗运动障碍疗效所表明的那样。然而，在停止使用RGFP109治疗六天后，RGFP109显著降低了峰值剂量LID的严重程度，并缩短了D12“质量差”ON时间的持续时间。这种延迟的抗运动障碍疗效与核水平的长期变化是一致的，正如HDAC抑制所预期的那样，而不是阻断突触受体，这将产生立竿见影的效果。重要的是，RGFP109的抗运动障碍作用是在不损害峰值抗帕金森病疗效或l-DOPA益处持续时间的情况下获得的，这表明组蛋白脱乙酰化异常是LID的结果，而不是l-DOPA治疗本身。

- HDAC1/HDAC2活性检测：重组HDAC1或HDAC2与RG2833（0.01–10 μM）在含Tris-HCl（pH 8.0）、NaCl和DTT的缓冲液中孵育，加入荧光底物（Ac-Arg-Lys-Lys-AMC）后，通过360 nm激发/460 nm发射监测反应。IC50值通过剂量-反应曲线计算[1]
通过将小鼠脑组织在 CellLytic MT 哺乳动物组织裂解/提取缓冲液中以 10% w/v 匀浆后在冰上匀浆，然后在 4°C 下以 800 x g 离心 10 分钟来测量乌头酸酶活性。将 50 μL 组织裂解液添加到 200 μL 底物混合物（其中包括 50 mM Tris/HCl pH7.4、0.4 mM NADP、5 mM 柠檬酸钠、0.6 mM MgCl₂、0.1% (v /v) Triton X-100 和 1U 异柠檬酸脱氢酶），反应在 37°C 下孵育 15 分钟。然后通过在 340 nm、37°C 下每分钟进行分光光度吸光度测量 15 分钟来确定反应斜率。然后，使用柠檬酸合酶测定试剂盒，将小鼠脑组织的乌头酸酶活性标准化为柠檬酸合酶活性。

- 患者细胞中frataxin诱导：弗里德赖希共济失调成纤维细胞经RG2833（0.1–10 μM）处理24小时，提取总蛋白后通过Western blot检测frataxin水平。密度分析显示线性剂量-反应关系[1]
- 细胞裂解液HDAC活性检测：HEK293细胞经RG2833（0.1–10 μM）处理6小时，裂解液与荧光HDAC底物孵育，酶标仪检测去乙酰化活性。HDAC1抑制的IC50为0.1 μM[1]
RG2833 的 HDAC1 和 HDAC3 Ki 值依次为 5.4 nM 和 7.8 nM。 RG2833 在 1 至 10 µM 的整个测试浓度范围内表现出高活性。当持续培养 RG2833 时，来自患者 P13 的细胞中 Frataxin 蛋白的增加速度更慢；然而，去除该化合物后，frataxin 蛋白水平迅速上升。除了减少背根神经节 (DRG) 的神经元病理之外，RG2833 还能显着增加大脑乌头酸酶活性。

YG8R小鼠模型：将RG2833溶解于0.5%甲基纤维素溶液中，并以10 mg/kg/天的剂量口服给予YG8R小鼠，持续4周。每周通过转棒试验评估小鼠的运动功能。试验结束后，采集组织进行弗拉塔辛定量和组织病理学分析[2]
- MPTP损伤狨猴模型：狨猴接受MPTP（0.3 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续5天）以诱导帕金森病。在左旋多巴（10 mg/kg）刺激前30分钟，口服给予RG2833（0.1–1 mg/kg）。采用经验证的评分量表[3]对运动障碍严重程度进行评分。小鼠饲养于标准开放式笼中，光照时间为13小时，黑暗时间为11小时，温度为20–23°C，湿度为45–60%，铺有Litaspen Premium 8/20垫料、纸棉巢穴和标准趣味隧道环境丰富化设施。小鼠喂食SDS RM3膨化饲料颗粒和普通饮用水。小鼠每周皮下注射150 mg/kg RG2833三次，持续4.5个月；或每周皮下注射50 mg/kg RG2833 136或100 mg/kg RG2833五次，持续5个月。最后一次注射后24小时，处死小鼠以收集组织。

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对帕金森狨猴联合使用RG2833 (RGFP109)和左旋多巴[3]
图2为实验时间线示意图。在研究开始前12天（D-12），对动物进行左旋多巴/苄丝肼（20/5 mg/kg，皮下注射，以下简称左旋多巴）的急性刺激。以D-12观察到的行为作为基线比较，以确保动物对左旋多巴的反应一致，包括运动障碍和帕金森症状逆转的持续时间，从而确保整个研究过程中观察到的变化是由HDAC抑制引起的，而不是对左旋多巴反应的差异。在研究第0天（D0），动物接受了左旋多巴（l-DOPA）联合溶剂的急性刺激。24小时后（D1），开始使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）RG2833（RGFP109）进行治疗。在整个研究过程中，动物同时口服RG2833（RGFP109）（30 mg/kg），RG2833（RGFP109）溶于50%（v/v）羟丙基-β-环糊精乙酸酯水溶液中，并与左旋多巴联合给药。两种药物同时给药。左旋多巴的剂量在整个观察日保持恒定（20/5 mg/kg），但在非行为观察日采用口服给药，在行为观察日（D-12、D0、D1、D6和D12）采用皮下注射给药，以尽量减少因胃肠道吸收不稳定造成的变异性。在第 6 天停止使用 RG2833 (RGFP109) 进行治疗。经过 6 天的洗脱期（期间维持每日左旋多巴治疗），重新评估了对急性左旋多巴挑战的反应（第 12 天）。

口服生物利用度：在小鼠中，RG2833 表现出中等的口服生物利用度 (25%)，血浆峰浓度 (Cmax) 在 1 小时内达到 0.8 μg/mL。该化合物具有较高的血浆蛋白结合率 (>90%)，末端半衰期为 4–6 小时 [2]
- 组织分布：口服给药后，RG2833 在脑组织中蓄积，脑/血浆浓度比为 0.6–0.8。在肝脏和骨骼肌中也检测到了显著水平 [2]

口服RGFP109治疗耐受性良好，整个研究期间未观察到不良反应。在为期12天的研究期间，RGFP109治疗对左旋多巴峰值效应期间的左旋多巴诱导的运动障碍（LID）水平有显著影响（Friedman统计量（FS）= 9.75，P < 0.01，Friedman检验，图3B）。然而，与第0天单独使用左旋多巴相比，RGFP109与左旋多巴联合用药的急性治疗（D1）和6天治疗（D6）均未对LID水平产生任何影响（所有P > 0.05，Dunn事后检验）。在停止RGFP109治疗6天后的第12天（D12），尽管每日左旋多巴治疗仍在继续，但左旋多巴诱导的运动障碍（LID）水平显著降低（降低了37%）（D0时为21.5 ± 1.0，D12时为13.5 ± 1.5；P < 0.05，Dunn事后检验，图3B）。相应地，在整个研究过程中，治疗对伴有严重运动障碍的“开”期持续时间有显著影响（F3,9 = 5.6，P < 0.05，单因素重复测量方差分析）。在第12天（D12），而非在此之前，伴有严重运动障碍的“开”期持续时间较第0天（D0）单独使用左旋多巴组减少了50%（D0为145 ± 11分钟，D12为73 ± 23分钟；P < 0.05，Tukey事后检验，图3F）。[3]

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- 急性毒性：RG2833在小鼠中的口服LD50超过1000 mg/kg。急性毒性研究中未观察到死亡或严重不良反应。[1,2]
- 慢性毒性：在为期4周的大鼠口服毒性研究中，RG2833（每日20 mg/kg）未引起血液学、血清生化或器官重量的显著变化。最高剂量组观察到轻度可逆性肝肥大[2]
- 药物相互作用：与酮康唑（一种CYP3A4抑制剂）合用可使RG2833血浆浓度升高2.3倍，表明可能存在药代动力学相互作用[2]

[1]. Two new pimelic diphenylamide HDAC inhibitors induce sustained frataxin upregulation in cells from Friedreich's ataxia patients and in a mouse model. PLoS One. 2010, 5(1), e8825.

[2]. Prolonged treatment with pimelic o-aminobenzamide HDAC inhibitors ameliorates the disease phenotype of a Friedreich ataxia mouse model. Neurobiol Dis. 2011, 42(3), 496-505.

[3]. RGFP109, a histone deacetylase inhibitor attenuates L-DOPA-induced dyskinesia in the MPTP-lesioned marmoset: a proof-of-concept study. Parkinsonism Relat Disord. 2013, 19(2), 260-264.

背景：弗里德赖希共济失调（FRDA）是白种人中最常见的隐性遗传性共济失调，其病因是弗拉塔辛蛋白（一种高度保守的蛋白质）水平严重降低，而这种降低是由于弗拉塔辛基因（FXN）第一个内含子中GAA三核苷酸重复序列的大量扩增所致。在FRDA患者细胞和鼠模型中，扩增的GAA重复序列附近存在典型的异染色质标记。具有庚二苯酰胺结构且对HDAC3具有特异性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）能够解聚FXN基因处的染色质结构，并恢复FRDA患者细胞和基于GAA重复序列的FRDA小鼠模型KIKI中的frataxin水平，为FRDA的治疗提供了一种有吸引力的策略。方法/主要发现：为了进一步改善庚二苯酰胺类HDACIs作为FRDA潜在治疗药物的药理学特性，我们合成了更多具有该基本结构的化合物，并筛选了它们的HDAC3特异性。我们表征了其中两种化合物（化合物136和109）在FRDA患者外周血淋巴细胞和KIKI小鼠模型中的作用。我们测试了它们在不同浓度下上调frataxin的能力，以确定最小有效剂量。随后，我们在两个系统中测定了这些药物对弗拉塔辛mRNA和蛋白以及总组蛋白乙酰化和局部组蛋白乙酰化的影响持续时间。在两个系统中，这些化合物的作用持续时间均超过了直接暴露时间。结论/意义：我们的结果支持基于庚二酸二苯酰胺类组蛋白乙酰转移酶抑制剂（HDACI）的弗里德赖希共济失调（FRDA）治疗方法的临床前开发，并为未来这些药物的人体试验设计提供了信息，提示间歇性给药方案可能有效。[1]

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弗里德赖希共济失调（FRDA）是一种遗传性神经退行性疾病，由FXN基因内GAA重复序列扩增引起，导致表观遗传改变和异染色质介导的基因沉默，最终导致弗拉塔辛蛋白缺乏。组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 抑制剂，包括庚二酸邻氨基苯甲酰胺类化合物 106、109 和 136，此前已被证明可在 FRDA 患者细胞和基因敲入小鼠模型的短期研究中逆转 FXN 基因沉默，但此类治疗干预的功能性后果尚未阐明。我们现在研究了化合物 106、109 和 136 在我们构建的 GAA 重复序列扩增突变 YG8R FRDA 小鼠模型中的长期治疗效果。结果表明，长达 5 个月的治疗未观察到明显的毒性，并且 FRDA 样疾病表型得到改善。因此，尽管该模型的神经功能缺陷较轻，但化合物 109 和 106 均能改善运动协调性，而化合物 109 和 136 则能增强运动活性。三种化合物均能增加脑组织中组蛋白H3和H4的整体乙酰化水平，但只有化合物109显著增加了FXN基因座特定组蛋白残基的乙酰化水平。化合物109对中枢神经系统组织中FXN mRNA表达的影响较小，但显著增加了脑组织中弗拉塔辛蛋白的表达。化合物109还显著提高了脑内乌头酸酶的活性，并减轻了背根神经节（DRG）的神经元病理改变。总的来说，这些结果支持进一步评估HDAC抑制剂在治疗弗里德赖希共济失调方面的应用。[2]

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背景：左旋多巴（L-DOPA）诱发的运动障碍（LID）是帕金森病（PD）长期多巴胺替代疗法的并发症。近期研究表明，PD中LID的发生和表达机制可能涉及表观遗传学改变，包括纹状体组蛋白的去乙酰化。我们假设抑制组蛋白去乙酰化酶（负责组蛋白去乙酰化的酶）可以缓解左旋多巴诱导的运动障碍（LID）。方法：我们给四只雌性普通狨猴（Callithrix jacchus）注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）使其患上帕金森病。待帕金森病表型稳定后，我们通过长期服用左旋多巴诱导狨猴出现运动障碍。然后，我们研究了可穿透血脑屏障的组蛋白去乙酰化酶抑制剂RGFP109（30 mg/kg，每日一次，口服，连续6天）对LID和左旋多巴抗帕金森病疗效的影响。结果：单次或连续6天每日一次给药后，RGFP109对运动障碍均无急性影响（P > 0.05）。然而，停用RGFP109一周后，与之前单独使用左旋多巴相比，运动障碍和伴有严重运动障碍的“开期”持续时间分别减少了37%和50%（均P < 0.05）。左旋多巴的抗帕金森病作用或“开期”持续时间均未发生改变（P > 0.05）。结论：组蛋白去乙酰化抑制可能是一种逆转帕金森病中已确立的左旋多巴诱导的运动障碍（LID）并提高左旋多巴抗帕金森病疗效的新方法。[3]

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- 作用机制：RG2833选择性抑制HDAC1/HDAC2，导致组蛋白H3K9乙酰化增加和FXN基因转录激活。这可以恢复弗拉塔辛水平，改善线粒体铁硫簇的生物合成，并降低氧化应激[1,2]
- 治疗潜力：除弗里德赖希共济失调和帕金森病外，RG2833 正在临床前模型中评估其对亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 的疗效[2,3]
- 临床开发：RG2833 已完成健康志愿者的 I 期临床试验，显示出良好的安全性。针对弗里德赖希共济失调的 II 期临床试验正在进行中[3]

C20H25N3O2

339.43

339.195

C, 70.77; H, 7.42; N, 12.38; O, 9.43

1215493-56-3

56654642

White to off-white solid powder

5.127

87.71

3

3

8

25

419

0

O=C(C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(C1C([H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=C([H])C=1[H])=O)N([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1N([H])[H]

VOPDXHFYDJAYNS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H25N3O2/c1-15-10-12-16(13-11-15)20(25)22-14-6-2-3-9-19(24)23-18-8-5-4-7-17(18)21/h4-5,7-8,10-13H,2-3,6,9,14,21H2,1H3,(H,22,25)(H,23,24)

N-[6-(2-aminoanilino)-6-oxohexyl]-4-methylbenzamide

RGFP 109; RGFP-109; RGFP109; RG2833; RG2833; 1215493-56-3; N-(6-((2-Aminophenyl)amino)-6-oxohexyl)-4-methylbenzamide; RGFP-109; N-(6-(2-Aminophenylamino)-6-oxohexyl)-4-methylbenzamide; RGFP109; RG 2833; RG-2833

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.37 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.37 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.37 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.37 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: 5%DMSO Corn oil: 6.0mg/ml (17.68mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。