Osteoclast-mediated bone resorption

在这里，研究人员确定了利塞膦酸盐（临床上用于治疗骨吸收疾病的最有效的双膦酸盐之一）对恶性疟原虫血液期的抗疟疾活性（50%抑制浓度[IC50]为20.3±1.0μM）。他们还提出了利塞膦酸盐对恶性疟原虫红细胞内阶段的作用机制，并表明蛋白质异戊二烯化似乎直接受到这种药物的调节。利塞膦酸盐抑制法尼醇焦磷酸基团转移到寄生虫蛋白上，而香叶基香叶醇焦磷酸的转移没有观察到这种作用[1]

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在这份报告中，研究人员证实，利塞膦酸盐是一种含氮双膦酸盐（N-BP），在体外对恶性疟原虫的血液阶段具有强效活性。为寄生虫生长建立的IC50在先前研究中为同一分离物（3D7）获得的范围内。研究人员还表明，在恶性疟原虫培养处理过程中同时添加FPP或GGPP可以部分逆转利塞膦酸盐诱导的抑制作用（图1）。添加GGPP后观察到的恢复是合理的，因为Couto等人之前证明恶性疟原虫能够将GGPP转化为FPP。相比之下，当我们在培养物中添加IPP时，寄生虫无法恢复，这表明FPPS的抑制是利塞膦酸盐的潜在靶点，利塞膦酸酯也可以通过抑制GGPPS起作用。Luckman等人验证了J774巨噬细胞与阿仑膦酸盐和FPP或GGPP共孵育后的相同恢复事件，观察到凋亡事件的部分预防。[1]
利塞膦酸钠对类异戊二烯生物合成的影响结果（图2）表明FPPS受到抑制。处理过的寄生虫的RP-TLC图谱显示，与未处理的寄生虫的信号相比，Rf值相当于FOH和GGOH的条带减少，这使我们推测利塞膦酸盐抑制了参与FPP和/或GGPP合成的酶。众所周知，利塞膦酸钠等N-BP的主要靶点是FPPS（11）；因此，我们假设利塞膦酸二钠可能通过抑制FPPS，从而阻断蛋白质法尼酰化和香叶基香叶酰化，成为恶性疟原虫类异戊二烯途径的强效抑制剂。在J774巨噬细胞中，该药物抑制了蛋白质的异戊二烯化，包括Ras蛋白的异戊二烯化[1]。

体内实验表明，利塞膦酸盐在治疗第七天对小鼠体内的啮齿动物寄生虫伯氏疟原虫的抑制率为88.9%；然而，利塞膦酸钠治疗并没有普遍提高生存率。[1]
在体外测定利塞膦酸二钠的抗疟原虫作用后，我们验证了其在感染伯氏疟原虫ANKA株的BALB/c小鼠中的疗效。连续4天服用20和25mg/kg利塞膦酸盐后，寄生虫血症分别减少了68.9%和83.6%。在治疗的第七天，20和25mg/kg的抑制率分别为63%和88.9%（图4A）。在恢复寄生虫血症后，获得了一条剂量反应曲线，用于估算ID50（引起50%抑制的剂量），相当于治疗7天后的17±1.8mg/kg。中断治疗4天后（感染后11天），10、15、20和25mg/kg/天治疗组的寄生虫血症分别为15.3%、15.9%、15.2%和5.7%。相反，接受PBS的组出现了25.6%的寄生虫血症。在接受利塞膦酸钠治疗的组中，只有接受25mg/kg治疗的动物具有77.8%的显著抑制作用（见补充材料中的表S1），这表明即使在停止治疗后，动物的寄生虫血症仍低于对照组；然而，所有治疗组均观察到寄生虫复发。通过Kaplan-Meier生存分析，利塞膦酸钠治疗组和PBS治疗组之间没有差异（图4B）[2]。

利塞膦酸盐抑制试验和救援试验。[1]
将利塞膦酸盐溶解在无菌去离子水中，得到25mM储备溶液。使用平底微量滴定板进行抑制试验，使用以下药物浓度：3000、300、30、3、0.3、0.03和0.003μM。我们采用了Desjardins和合著者之前描述的方法，并进行了一些修改，以确定治疗48小时后恶性疟原虫红细胞内阶段的50%抑制浓度（IC50）。简而言之，将同步环期寄生虫培养物（5%血细胞比容和1%寄生虫血症）暴露于不断增加的药物浓度中，并在开始前立即用Giemsa染色涂片测定寄生虫血症和寄生虫形态，间隔24至96小时，而不是[3H]次黄嘌呤掺入。所有测试均进行了三次独立实验，共三次。使用Origin 8.1软件计算生长抑制的IC50、IC90（±标准差）和95%置信区间（CI95%）值。对于救援试验，将FPP、GGPP和IPP溶解在RPMI培养基（5 mM储备溶液）中，然后将不同浓度的每种化合物（100 nM至1000 nM）同时加入到之前用20μM利塞膦酸盐处理的环期同步恶性疟原虫培养物中。每24小时评估一次寄生虫血症。使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行Dunnett事后检验。P值<0.05被认为具有统计学意义。

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利塞膦酸盐和代谢标记治疗。[1]
恶性疟原虫的异步培养物用15μM的利塞膦酸盐处理36小时，并在药物存在的情况下，在正常RPMI 1640培养基中用[1-3H]GGPP（3.125μCi/ml）或[1-3H]FPP（3.125µCi/ml）标记最后12小时。标记后，在40%-70%-80%的不连续Percoll梯度上纯化环、滋养体和分裂体形式，然后在含有冰冷的10 mM Tris-HCl（pH 7.2）、150 mM NaCl、2%（体积/体积）Triton X-100、0.2 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、5 mM碘乙酰胺、1 mM N-（对甲苯磺酰赖氨酸）氯甲基酮和1μg/ml亮肽的溶液中裂解细胞。在4°C下孵育15分钟后，将裂解物在10000×g下离心30分钟。将寄生虫的上清液储存在液氮中，以备后续SDS-PAGE分析。为了分析类异戊二烯，将环期的同步培养物用15μM利塞膦酸盐处理36小时，并在最后12小时用[1-14C]IPP进行代谢标记。标记后，如上所述，在40%-70%-80%的不连续Percoll梯度上纯化分裂期寄生虫，并在如前所述的脂质提取前进行冷冻干燥（30）。15μM的利塞膦酸盐被认为是我们代谢标记实验中使用的理想药物浓度，因为大约90%的寄生虫在治疗36小时后仍然存活。

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反相薄层色谱法（RP-TLC）。[1]
用己烷提取类似量的未经处理或利塞膦酸盐处理的寄生虫分裂期颗粒，如上所述用[1-14C]IPP标记，随后在反相硅胶60板上用丙酮-H2O（6:1，体积/体积）分离醇。用En3Hance喷涂钢板，并在-70°C下进行45天的放射自显影。用碘蒸气对标准品进行可视化，并测定Rf值。未感染红细胞的己烷提取物用作对照组。

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免疫沉淀试验。[1]
环期同步培养物用15μM＜strong＞利塞膦酸盐处理24小时，并在药物存在下用[1-3H]FPP或[1-3H]GGPP代谢标记另外12小时。标记后，如上所述，在40%-70%-80%的不连续Percoll梯度上纯化分裂期寄生虫。将未处理和处理过的分裂期寄生虫的颗粒重新悬浮在免疫沉淀缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH 8.0]、150 mM NaCl、1%[vol/vol]Triton X-100、0.5%[wt/vol]脱氧胆酸钠、0.1%[wt/vol]SDS、5μg/ml蛋白酶抑制剂混合物[0.2 mM苯甲基磺酰氟、1 mM苯甲脒、2 mMβ-巯基乙醇、糜蛋白酶抑制剂{5 mg/ml}和1μg/ml亮肽、安替班和胃蛋白酶抑制剂A]）中，然后用蛋白A-琼脂糖珠预冷。然后将Schizont形式与抗人Ras或抗Rap1/Krev-1单克隆免疫球蛋白（1:20稀释）在4°C下孵育2小时。用100μl 10%蛋白a-Sepharose浆液沉淀抗原-抗体复合物。用磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤五次后，结合的抗原在SDS样品缓冲液中释放，并通过SDS-PAGE和放射自显影进行分析（20）。使用Image J软件进行密度分析。

每只雄性BALB/c小鼠（3至4周龄）（每组10至15只）腹腔注射10⁶个血期伯氏疟原虫ANKA株。本实验室此前已确定该寄生虫负荷为接种后14天的半数致死剂量。感染后2小时（第0天）开始给予不同浓度的利塞膦酸钠治疗，持续7天。药物用PBS稀释，并以10、15、20和25 mg/kg体重/天的剂量腹腔注射。分别于感染后第4、7、11、14和17天，通过吉姆萨染色血涂片显微镜检查寄生虫血症水平。在此期间，记录每只动物的自然死亡情况。寄生虫血症抑制率的计算方法如下：100 − [(治疗组平均寄生虫血症/对照组平均寄生虫血症) × 100] (14)。为了比较不同时间点的平均寄生虫血症，采用方差分析，并使用事后Mann-Whitney检验进行均值比较。[1]

吸收、分布和排泄
吸收
口服生物利用度为0.63%，最大吸收时间约为给药后1小时。餐前30分钟给药会使生物利用度较空腹降低55%，餐前1小时给药会使生物利用度降低30%。
排泄途径
利塞膦酸钠经肾脏排泄，未吸收的剂量经粪便排出。
分布容积
13.8 L/kg。
清除率
平均肾清除率为52 mL/min，平均总清除率为73 mL/min。
吸收迅速且与剂量无关，发生于整个上消化道。平均口服生物利用度为0.63%，与食物同服会降低其生物利用度。与空腹状态（给药前10小时或给药后4小时内禁食禁水）相比，早餐前0.5小时或晚餐后2小时给药可使吸收率降低55%。与空腹状态相比，早餐前1小时给药可使吸收率降低30%。/利塞膦酸钠/
在大鼠和犬中进行的研究表明，静脉注射单剂量放射性标记的利塞膦酸钠后，约60%的剂量分布于骨骼。在人体中，平均稳态分布容积为6.3 L/kg体重。/利塞膦酸钠/
在大鼠中多次口服给药后，利塞膦酸钠在软组织中的吸收率在0.001%至0.01%之间。
在给药后24小时内，在接触哺乳期大鼠的幼鼠体内检测到了利塞膦酸钠，表明存在少量乳汁转运。利塞膦酸钠
排泄：粪便排泄，药物未吸收（未改变）。肾脏排泄，药物未改变，约50%的吸收剂量在24小时内排出，85%在28天内排出。平均肾清除率为105 mL/min，平均总清除率为122 mL/min，两者差异主要反映非肾清除或骨吸收清除。注：肾清除率与药物浓度无关，肾清除率与肌酐清除率呈线性关系。利塞膦酸钠代谢/代谢物
利塞膦酸在排泄前不太可能被代谢。PCP类双膦酸盐对化学和酶水解具有抵抗性，从而阻止了该分子的代谢。
没有证据表明利塞膦酸钠在人或动物体内代谢。
未发现利塞膦酸钠在人或哺乳动物体内代谢的证据。排泄途径：利塞膦酸钠主要以原形经肾脏排泄。在大鼠体内，仅有极少量（<0.1%静脉注射剂量）的药物经胆汁排泄。半衰期：1.5 小时

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生物半衰期
利塞膦酸的初始半衰期约为 1.5 小时，末端半衰期为 561 小时。
初始半衰期：约 1.5 小时；末端指数半衰期：480 小时（这可能代表利塞膦酸钠从骨表面解离）。

毒性概述
利塞膦酸钠对骨组织的作用部分基于其对羟基磷灰石的亲和力，羟基磷灰石是骨骼矿物基质的组成部分。利塞膦酸钠还靶向法尼基焦磷酸（FPP）合酶。含氮双膦酸盐（如帕米膦酸钠、阿仑膦酸钠、利塞膦酸钠、伊班膦酸钠和唑来膦酸钠）似乎作为异戊二烯二磷酸脂质的类似物发挥作用，从而抑制甲羟戊酸途径中的一种酶——FPP合酶。破骨细胞中该酶的抑制可阻止异戊二烯脂质（FPP和GGPP）的生物合成，而这些脂质对于小GTP酶信号蛋白的翻译后法尼基化和香叶基香叶基化至关重要。这种活性抑制破骨细胞活性，并减少骨吸收和骨转换。在绝经后妇女中，它能降低升高的骨转换率，平均而言，可使骨量净增加。

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妊娠期和哺乳期影响
◉哺乳期用药概述
由于目前尚无关于利塞膦酸钠在哺乳期使用的信息，因此建议选择其他药物，尤其是在哺乳新生儿或早产儿时。然而，母乳喂养的婴儿不太可能吸收利塞膦酸钠。
◉对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉对哺乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

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暴露途径
口服后迅速吸收（约1小时），主要通过上消化道吸收。

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症状
副作用包括腹痛、焦虑、背痛、打嗝、膀胱刺激、骨骼疾病和疼痛、支气管炎、滑囊炎、白内障、胸痛、结肠炎、便秘、抑郁、腹泻、呼吸困难、头晕、眼睛干涩、眼部感染、流感样症状、胀气、头痛、高血压、感染、失眠、瘙痒、关节疾病和疼痛、腿部抽筋、肌肉疼痛、肌肉无力、恶心、颈部疼痛、神经痛、疼痛、肺炎、皮疹、耳鸣、鼻窦问题、咽喉痛、胃出血、鼻塞或流鼻涕、肿胀、肌腱问题、肿瘤、溃疡、尿路感染、眩晕、视力问题和虚弱。

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药物相互作用
含二价阳离子的抗酸剂或矿物质补充剂：当利塞膦酸钠与含二价阳离子（例如铝、钙、镁）的抗酸剂或矿物质补充剂同时使用时，会发生药代动力学相互作用（降低利塞膦酸钠的吸收）。
非甾体抗炎药（NSAIDs）：未发现上消化道不良反应增加的证据。

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蛋白结合率：约24%。

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女性口服TDLo 1800 ug/kg/3D- 感觉器官和特殊感觉：虹膜炎：眼 Lancet., 341(436), 1993

Antimicrob Agents Chemother. 2011 May;55(5):2026-31.

利塞膦酸钠是一种1,1-双膦酸。
利塞膦酸钠是利塞膦酸钠的钠盐，利塞膦酸钠是一种合成的吡啶基双膦酸盐。利塞膦酸与骨骼中的羟基磷灰石晶体结合，抑制破骨细胞依赖的骨吸收。
它是一种吡啶和二膦酸衍生物，作为钙通道阻滞剂，抑制骨吸收。

C7H9NNA2O7P2

327.0759

304.983

C, 27.56; H, 3.30; N, 4.59; Na, 7.54; O, 36.71; P, 20.30

115436-72-1

105462-24-6 (free acid);115436-72-1 (sodium);

4194514

White to off-white solid powder

692.3ºC at 760 mmHg

252-262°C

372.5ºC

4.03E-20mmHg at 25°C

0.063

170.63

4

8

4

18

375

0

DRFDPXKCEWYIAW-UHFFFAOYSA-M

InChI=1S/C7H11NO7P2.Na/c9-7(16(10,11)12,17(13,14)15)4-6-2-1-3-8-5-6;/h1-3,5,9H,4H2,(H2,10,11,12)(H2,13,14,15);/q;+1/p-1

sodium hydrogen (1-hydroxy-1-phosphono-2-(pyridin-3-yl)ethyl)phosphonate

Risedronic Acid Sodium; NE-58095; NE 58095; Risedronate sodium; 115436-72-1; Sodium risedronate; Actonel; Atelvia; Risedronic acid sodium salt; Risedronate (sodium); Risedronic acid monosodium salt; NE58095; Risedronate, Risedronic acid, Risedronate sodium, Actonel, Atelvia, Benet

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~8.33 mg/mL (~27.30 mM)
DMSO : ~1 mg/mL (~3.28 mM)

配方 1 中的溶解度: 16.67 mg/mL (54.64 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。