RO1138452

Rat I₂ Receptor ( IC50 = 7 nM ); Rat I₂ Receptor ( pKi = 8.33 ); Rabbit PAF Receptor ( IC50 = 52.9 nM );
Human α_2A adrenoceptor ( IC50 = 724 nM ); Rat α_1B adrenoceptor ( IC50 = 3280 nM ); Human Muscarinic M₄ Receptor ( IC50 = 1450 nM );
Human muscarinic M₂ Receptor ( IC50 = 2220 nM ); Human muscarinic M₁ Receptor ( IC50 = 2570 nM ); Human muscarinic M₅ Receptor ( IC50 = 3110 nM );
Rat 5-HT_1B Receptor ( IC50 = 1130 nM ); pig 5-HT_2C Receptor ( IC50 = 1190 nM ); Rat 5-HT_2A Receptor ( IC50 = 3040 nM );
Human 5-HT_1A Receptor ( IC50 = 8580 nM ); Guinea-pig 5-HT₄ Receptor ( IC50 = 8910 nM ); Rat α_2Badrenoceptor ( pKi = 5.87 );
Human α_2A adrenoceptor ( pKi = 6.49 ); Human muscarinic M₁ Receptor ( pKi = 5.66 ); Human muscarinic M₅ Receptor ( pKi = 5.81 );
Human muscarinic M₂ Receptor ( pKi = 5.88 ); Human muscarinic M₄ Receptor ( pKi = 6.14 ); Rabbit PAF Receptor ( pKi = 7.9 );
Guinea-pig 5-HT₄ Receptor ( pKi = 5.35 ); Human 5-HT_1A Receptor ( pKi = 5.37 ); Rat 5-HT_2A Receptor ( pKi = 5.71 );
Rat 5-HT_1B Receptor ( pKi = 6.11 ); Pig 5-HT_2C Receptor ( pKi = 6.11 )

RO1138452 (CAY10441)是 IP 受体拮抗剂。 RO1138452减弱cAMP积累的pIC50值为7.0±0.07。通过测量稳定表达人 IP 受体的 CHO-K1 细胞中卡前列环素诱导的 cAMP 积累的抑制来研究 RO1138452 的功能拮抗作用。 RO1138452的拮抗剂亲和力(pKi)为9.0±0.06。 RO1138452 的选择性谱是通过一组受体结合和酶测定确定的。 RO1138452 对咪唑啉 2 (I2) (8.3) 和血小板激活因子 (PAF) (7.9) 受体具有亲和力[1]。将 RO1138452 (10 pM-10 μM) 与固定浓度的他前列素 (1 μM) 同时添加到细胞中，以浓度依赖性方式防止对 CXCL9 和 CXCL10 释放的抑制，p[A]50（摩尔）值为分别为-8.73±0.11 和-8.47±0.16 (p>0.05)[2]。

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cPGI2诱导cAMP积累的功能拮抗作用[1]
为了确定RO1138452 (CAY10441)和RO3244794是否表现为IP受体的功能拮抗剂，我们在4-5个独立实验中测试了这两种化合物是否可以阻断过表达人类IP受体的CHO-K1细胞中cAMP的积累（图3）。cPGI2被用作激动剂来刺激这些细胞中的IP受体，其效力（pEC50）为10±0.08。对于cAMP抑制实验，10 在用不同浓度的RO1138452和RO3244794孵育细胞后，使用nM cPGI2来驱动cAMP信号通路。与结合亲和力一致，RO1138452是比RO3244794更有效的人类IP受体拮抗剂。RO1138452和RO3244794在减弱cAMP积累方面的pIC50值分别为7.0±0.07和6.5±0.06。使用Cheng-Prusoff校正因子（Cheng&Prusoff，1973），RO1138452和RO3244794的亲和力函数估计值分别为9.0±0.06和8.5±0.11。这两种化合物的可逆性仍有待表征。RO1138452和RO3304794均未在重组IP受体上显示任何激动剂活性（数据未显示）。这两种化合物都不抑制血小板聚集，与刺激（ADP或肾上腺素）无关，正如天然IP受体激动剂所预期的那样（数据未显示）。

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RO1138452 (CAY10441)或RO3244794[1]的选择性[1]
通过评估IP受体配体对标准放射性配体与50多种受体特异性结合的影响，确定了RO1138452 (CAY10441)和RO3244794的受体选择性特征。在初始筛选中，RO1138452和RO3244794（10μM）分别抑制特异性放射配体结合>70%和>30%的受体亚型构建了全置换曲线：α1B和α2A肾上腺素受体、I2、毒蕈碱（M1-M5）、血小板活化因子（PAF）和5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A、5-HT2C和5-HT4。表1显示了RO1138452和参考标准在这些受体亚型上的效力（IC50）和亲和力（pKi）估计值。除I2和PAF受体外，RO1138452在所有其他受试受体亚型中显示出相对较低的亲和力。RO1138452对非IP前列腺素受体（EP1、EP3、FP和TP；数据未显示）没有表现出任何显著效力。由于固有的IP受体亲和力较低，选择性面板中受体亚型的RO3244794（10μM）置换阈值降至30%。在这个实验中，RO3244794置换了以下受体亚型30%或更多的放射性配体：腺苷（A3）、EP1、EP3、EP4和TP。RO3244794在这四种受体亚型上显示出相对较弱的亲和力（表1），在I2或PAF受体上没有活性。
我们还确定RO1138452 (CAY10441)和RO3244794是COX-1和COX-2酶的弱抑制剂。RO1138452（CAY10441）（10μM）对公羊COX-1的抑制作用小于10%，但对人COX-2的活性抑制了29%。同样，RO3244794（10μM）没有抑制人COX-1活性，但对人COX-2产生了相当的抑制作用（27%）。

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使用新型竞争性IP受体拮抗剂4,5-二氢-1H-咪唑-2-基）-[4-（4-异丙氧基-苄基）-苯基]-胺（RO1138452（CAY10441））研究了前列环素（IP）受体调节人气道上皮细胞释放两种促炎趋化因子的程度。在BEAS-2B人气道上皮细胞中，选择性IP受体激动剂他前列烯以浓度依赖的方式抑制干扰素γ诱导的CXCL9和CXCL10释放。这些效应被8-溴-cAMP模拟，在感染了编码cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）高选择性抑制剂的腺病毒载体的细胞中被消除。RO1138452以与可克服的竞争性拮抗不一致的方式阻断了他前列烯对趋化因子输出的抑制作用。使用人气道上皮细胞的原代培养获得了类似的结果。使用用cAMP反应元件（CRE）荧光素酶报告基因稳定转染的BEAS-2B细胞进一步研究了RO1138452施加的拮抗作用的基础。在这个输出上，RO1138452的表现也令人难以置信。从机制上讲，这不能归因于共价受体失活、异雄性或半平衡状态。其他研究证实，在20小时的“洗脱期”内，RO1138452（CAY10441）拮抗他前列烯诱导的CRE依赖性转录的程度没有逆转。这种药理学特征与伪不可逆拮抗剂的行为一致，其中与同源受体的解离非常缓慢，以至于在测量反应时无法实现再平衡。总的来说，这些数据提供了令人信服的证据，表明人类气道上皮细胞表达与PKA激活相关的抑制性IP受体。此外，与现有文献相反，RO1138452表现出伪不可逆性，强调了在药物发现中，需要在感兴趣的靶组织中筛选潜在的新药[2]。

RO1138452 (CAY10441)是人类和大鼠 IP 受体的有效选择性拮抗剂，具有镇痛和抗炎潜力。 RO1138452（1-10 mg/kg，静脉注射）可显着减少乙酸引起的腹部收缩。 RO1138452（3-100 mg/kg，口服）可显着减少角叉菜胶引起的机械痛觉过敏和水肿形成。给大鼠施用 RO1138452（5 mg/kg，静脉注射）一小时后，总血浆浓度为 0.189 μg/mL，而游离血浆浓度经计算为 0.009 μg/mL (28 nM)[1]。

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疼痛、痛觉过敏和炎症试验[1]
腹膜内注射刺激物，如乙酸，会引起前列腺素依赖性化学伤害性疼痛，其特征是腹部收缩（Berkenkopf和Weichman，1988）。为了确定IP受体是否介导反应，评估了两种选择性IP受体拮抗剂对醋酸诱导的大鼠腹部收缩的影响。在载体处理的大鼠中，乙酸在15分钟的观察期内诱导了12±1.7次收缩（图5a）。RO1138452（CAY10441）（1-10毫克 kg−1，静脉注射，n=6-8）在10℃时显著（P<0.05）抑制收缩65±10% mg kg−1，静脉注射（见图5a）。在另一项研究中（图5b），醋酸诱导了9.8±0.8的收缩，RO3244794（1-30mg kg−1，静脉注射，n=8）在最高剂量水平下显著（P<0.01）且剂量依赖性地将收缩次数减少了100%，ED50值为3.8±1.03 mg kg−1。

将角叉菜胶注射到大鼠后爪中会引起持续的炎症反应，其部分特征是机械性痛觉过敏（Vinegar等人，1976）。为了确定IP受体在卡拉胶诱导的机械性痛觉过敏中的作用，选择性IP受体拮抗剂对2 卡拉胶处理后h和1 测试前h进行评估。在载体处理的幼稚大鼠（未用角叉菜胶处理）中，缩爪阈值为125±6 g、 而用赋形剂和卡拉胶预处理的大鼠的戒断阈值为55±5 g，较低的阈值反映了机械性痛觉过敏（图6a）。RO1138452（CAY10441）（3-100毫克 kg−1，口服，n=10）以剂量依赖的方式显著（p<0.01）将戒断阈值提高到113±5 g、 （痛觉过敏抑制率为84±8%），ED50值为18.3±1.9 mg kg−1（图6a）。在另一项研究中（图6b），角叉菜胶预处理将缩爪阈值从220±15降低 对照组大鼠的g值为104.5±4.9 g、 RO3244794（1-30毫克 kg−1，口服，n=10）以剂量依赖的方式显著（p<0.01）增加了缩爪阈值，最大为192±13.5 g（76±12%的痛觉过敏抑制），ED50值为14±3.6 mg kg−1.这种反应不是由镇静引起的，因为更高的剂量（100 mg kg−1，口服）不影响大鼠的运动活动（数据未显示）。

将角叉菜胶注射到大鼠后爪中也会诱导水肿的形成，COX酶抑制剂在一定程度上可以减轻水肿（Vinegar等人，1976）。为了确定IP受体在水肿形成的前列腺素依赖性成分中的作用，评估了两种选择性IP受体拮抗剂对卡拉胶诱导的水肿的影响，在注射卡拉胶之前立即给予化合物。在载体处理的大鼠中，卡拉胶刺激0.71±0.04 ml（图7a）水肿。吲哚美辛（10mg kg−1，口服）显著（p<0.01）将水肿减轻至0.37±0.03 ml，前列腺素依赖性水肿形成减少100%。在相同条件下，RO1138452 (CAY10441)（3-100mg kg−1，口服n=10）显著（p<0.01）将水肿降至0.48±0.03 ml，在测试的最高剂量水平下，前列腺素依赖性水肿减少77±27%（图7a）。在另一项研究中（图7b），卡拉胶刺激的赋形剂处理大鼠水肿为0.56±0.03 g.吲哚美辛（5毫克 kg−1，口服）显著（p<0.01）将水肿减轻至0.32±0.04 g.RO3244794（0.3-10毫克 kg−1，口服，n=10）以剂量依赖的方式显著（p<0.01）减少水肿形成至0.33±0.03 g、 前列腺素依赖性水肿减轻99±7%。该值与吲哚美辛产生的值没有显著差异。更高剂量（30mg kg−1）并没有进一步减少水肿的形成（数据未显示）。

关节内注射mIOA会在大鼠体内产生慢性骨关节炎样症状，可能与关节不适有关（Bove等人，2003）。与RO1138452 (CAY10441)相比，RO3244794显示出更优越的药代动力学，通常具有更好的体内效力和疗效，因此在大鼠骨关节炎的mIOA模型中得到了进一步的表征。RO3244794（1和10 mg kg−1，口服，n=10）显著（p<0.05）减少了骨关节炎患者和对照组后爪之间的重量分布差异，反映了关节不适的改善（图8）。 At 1 mg kg−1时，体重分布的差异从24.8±4.4减小到12.8±4.2 g（P<0.05） 与赋形剂相比，给药后h，体重分布从31.2±7.8略微增加到33.1±5.7 g在同一个1 h.10时 mg kg−1时，体重分布差异从22.1±5.4降至0.34±7.5 g（P<0.01） h与车辆控制相比，在给药后；这相当于减少了99±23%。两种剂量的RO3244794在1小时时都出现了活动 h持续到至少3 h.此外，两种剂量的RO3244794的效果与选择性COX-2抑制剂罗非昔布（10mg kg−1），阳性对照。

RO1138452 (CAY10441)(10 μM) 取代 51 个受体上特定标准放射性配体结合的能力决定了其选择性。对于 RO1138452，一式三份构建完整的浓度依赖性位移曲线，并在观察到放射性配体显着位移（>70%）时用于生成 IC50 值。 EP3受体发生置换结合。还有酶抑制实验。使用 10 μM RO1138452 一式三份评估 COX 亚型，即 COX-1（公羊精囊）和 COX-2（羊胎盘和人脐静脉）的抑制作用。使用的底物是花生四烯酸，观察到 PGE2 积累[1]。

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人血小板中的天然IP受体[1]
人血小板首先以低速（约800×g）离心5分钟 在台式离心机上。然后将上清液在17000℃下离心 转速（45400×g）30 最低温度为4°C。将沉淀物重新悬浮在膜缓冲液（20mM Tris-HCl mM EDTA），使用polytron均质器（设置5）均质化，并在45400×g下再次离心30分钟 最低温度为4°C。然后将颗粒重新悬浮在20 mM Tris-HCl，5 mM MgCl2，均质化，等分并储存在-80°C下直至使用。对于竞争置换结合实验，使用浓度增加的伊洛前列素、RO1138452 (CAY10441)和RO3244794与10 nM 3H标记的伊洛前列素结合。简而言之，50 μg血小板膜用于每种反应，并在10μg存在下测定非特异性结合 μM未标记的伊洛前列素，而在8.5μM的存在下测定总结合量 nM 3H标记的伊洛前列素。潜伏期为90 在25°C下搅拌min，用Whatman GF/B滤板真空过滤终止反应。然后加入闪烁剂，使用TopCount微孔板闪烁计数器对放射性进行计数。

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IP受体拮抗作用的功能测定（cAMP）[1]
将IP受体转染的CHO-K1细胞在添加了10%胎牛血清和G418（300μg ml−1），在90%汇合时收获，用PBS洗涤两次，用VERSENE分离5 最低温度为37°C。然后将细胞重新悬浮在40 ml刺激缓冲液（含5 mM HEPES、0.1%牛血清白蛋白）并在800×g下离心5分钟 分钟。离心后，将沉淀物悬浮在刺激缓冲液中（含0.5 M异丁基甲基黄嘌呤、IBMX）。将细胞稀释至适当数量的细胞 ml−1，镀层密度为100000 cells 好-1。使用AlphaScreen™测定平台以96孔格式进行cAMP检测。对于抑制实验，5 μl的RO1138452 (CAY10441)或RO3244794（在刺激缓冲液中）分装到96孔板上，一式三份。将细胞悬浮液（10μl）与刺激缓冲液中的抗cAMP受体珠一起加入到每个板中，并孵育15 在室温下（在黑暗中或用黑板覆盖）。然后5 向每个孔中加入μl激动剂或载体；对于含有拮抗剂的孔，10 使用nM的卡巴前列环素（cPGI2），一种稳定的PGI2类似物。培养板孵育30 在加入10 μl供体珠，在溶血缓冲液中含有生物素cAMP（5 mM HEPES，0.3%吐温-20，0.1%牛血清白蛋白）。培养皿孵育1小时 h轻轻摇晃（在黑暗中或用黑色盘子盖住）。在AlphaScreen™Fusion分析仪上读取板。

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受体/酶谱分析[1]
选择性由RO1138452 (CAY10441)或RO3244794（10μM）取代51个受体上标准放射性配体特异性结合的能力决定。当观察到放射性配体的显著位移时（RO1138452（CAY10441）为>70%，RO3244794为>30%），构建完整的浓度依赖性位移曲线（一式三份）以产生IC50值。EP3受体的置换结合在罗氏帕洛阿尔托进行。Cerep还根据标准化方案进行了酶抑制试验。RO1138452的评估值为10 μM，一式三份，用于抑制COX亚型：COX-1（绵羊精囊）、COX-2（绵羊胎盘和人脐静脉）。花生四烯酸用作底物，通过FlashPlate™检测PGE2的积累。对于RO3244794（10μM），使用花生四烯酸作为底物（PMA作为COX-2诱导剂）测定人COX-2活性，并通过放射免疫测定法测定PGE2积累。

BEAS-2B 细胞在含有或不含 100 nM RO1138452 (CAY10441)的无补充剂角质形成细胞无血清培养基 (KSFM) 中于 37°C 培养 30 分钟。在无补充剂的 KSFM 中洗涤后，将细胞暴露于 1 μM Taprostene 并在相同的培养基中孵育预定的时间长度。在报告裂解缓冲液中收获细胞四小时后，测定荧光素酶活性。通过测量线粒体脱氢酶将四唑盐 MTT 转化为甲臜的量，使用比色分析来评估 HAEC 和 BEAS-2B 细胞的活力[2]。

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中国仓鼠卵巢（CHO）-K1细胞中的重组IP受体[1]
为了用RO1138452（CAY10441）置换3H标记的伊洛前列素，将膜预偶联到小麦胚芽凝集素偶联闪烁邻近测定珠（WGA-SPA珠，通过将珠悬浮在500℃的测定缓冲液中 mg/25 ml。将等体积的悬浮珠和再悬浮的膜混合，并放置在保持在300℃的轨道振荡器上 下午3点 h.然后将受体预偶联珠在300-500×g下离心7小时 min，用测定缓冲液洗涤沉淀物一次。用测定缓冲液将最终的沉淀物升至原始体积。为了用冷伊洛前列素和RO3244794置换3H标记的伊洛前列醇，使用了天然人血小板的常规过滤方法。随着伊洛前列素浓度的增加，使用RO1138452 (CAY10441)和RO3244794替代7.5 nM（用于WGA-SPA测定）或12 nM（用于过滤测定）3H标记的伊洛前列素。

大鼠：将RO1138452 (CAY10441)（5 mg/kg，静脉注射）给予三只雄性Sprague-Dawley大鼠。给药后，用5%氟烷麻醉大鼠。使用肝素化注射器，通过眼眶穿刺法从大鼠眼眶抽取血液。将血液在临床离心机中以2600×g离心5分钟，提取血浆。采用高效液相色谱-质谱联用技术检测每个样本中RO1138452的含量[1]。

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\n\nRO1138452 (CAY10441)（2–10 ml kg−1，<10 mg ml−1）易溶于生理盐水或水中。 RO3244794（1 ml kg−1，<30 mg ml−1）溶解于以下几种溶剂之一：（a）100 mM Trizma® 碱；（b）10% DMSO、50% 丙二醇的去离子水；（c）5.6% 苯甲酸钠、0.5% 苯甲酸、85% 丙二醇，或悬浮于 0.5% 羧甲基纤维素、0.9% 氯化钠、0.4% 聚山梨醇、0.9% 苯甲醇的去离子水中。[1]
\n\n腹部收缩试验[1]
\n雄性 Sprague-Dawley 大鼠（约 120 g）经静脉注射（iv）给予溶剂（1 ml kg−1）、吲哚美辛（5–10 mg kg−1）或测试化合物（n=6–8）。 60分钟后，按照先前描述的方法（Jett等人，1999），将溶于去离子水的乙酸（1%，2 ml kg−1）注射到腹膜内。计数在注射乙酸15分钟后开始的15分钟内发生的腹部收缩次数，随后进行背屈和伸展。数据以每15分钟内腹部收缩次数的平均值（±标准误）表示。\n

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\n\n角叉菜胶诱导的足底痛觉过敏试验[1]
\n雄性Sprague-Dawley大鼠（约120 g，n=10）用5%氟烷麻醉，并在左后爪足底皮下注射100 μl溶剂或角叉菜胶（1%生理盐水），如先前所述（Jett等人，1999）。在给予角叉菜胶 2 小时后，以及评估后爪机械性痛觉过敏前 1 小时，分别经口给予赋形剂（1 ml kg−1）或测试化合物。使用 Ugo Basile 镇痛仪测量大鼠后爪缩回阈值 (g) 的变化，即大鼠缩回后爪、发出叫声或挣扎的阈值。数据以平均（±标准误）缩回阈值 (g) 表示。\n

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\n\n角叉菜胶诱导水肿形成试验 [1]
\n雄性 Sprague-Dawley 大鼠（约 130-140 g，n=10）被随机分配到各处理组，使每组体重平衡，并分别给予赋形剂、吲哚美辛（阳性对照）或测试化合物。随后立即用5%氟烷麻醉大鼠，并在左后爪足底皮下注射50 μl溶剂或角叉菜胶（0.5%生理盐水），如前所述（Jett等，1999）。3小时后，记录处理组和对照组后爪的体积或重量，并计算两爪的体积或重量差。两种测量水肿形成的方法均得到相似的结果。数据以体积（ml）或重量（g）的平均值（±标准误）差异表示，以此反映水肿的形成。\n

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\n\n单碘乙酸钠诱导骨关节炎试验[1]
\n为了诱导骨关节炎症状，雄性Wistar大鼠（170-180 g，n=10）用异氟烷（2%异氟烷/氧气）麻醉，单次关节内注射单碘乙酸钠（mIOA；1 mg/50 μl），然后放回动物房（Bove等，2003）。14天后，使用关节功能测试仪评估大鼠的关节不适，该测试仪测量右（注射侧）和左（对照侧）后爪之间的重量分布，重量分布的差异作为关节不适的指标。在给予赋形剂、罗非昔布（阳性对照）或试验化合物前后，对大鼠进行测试。数据以骨关节炎组和对照组后爪重量分布的平均值（±标准误）差异（g）表示。\n

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\n\n药代动力学分析[1]
\n雄性Sprague-Dawley大鼠（n=3）分别静脉注射RO1138452 (CAY10441)或RO3244794（5 mg kg−1）。给药后不同时间点，用5%氟烷麻醉大鼠，通过眼眶采血至肝素化注射器中，并在临床离心机中以2600 × g离心5分钟获得血浆。采用高效液相色谱-质谱联用技术测定各样品中受试化合物的浓度。数据以平均值（±标准差）表示。使用 WinNonlin 计算血浆半衰期、分布容积等值。

药代动力学[1]
RO1138452 (CAY10441) 和 RO3244794 表现出不同的药代动力学特性（表 2）。大鼠静脉注射 RO1138452 后，其血浆半衰期更短、血浆蛋白结合率更低、分布容积 (Vdβ) 更大、总血浆浓度更低。然而，尽管两种化合物在等剂量静脉注射后的总血浆浓度存在差异（图 4），但如果考虑到 RO3244794 较高的血浆蛋白结合率，则它们的游离血浆浓度可能相似。例如，大鼠静脉注射RO1138452和RO3244794（5 mg kg⁻¹）1小时后，血浆总浓度分别为0.189和3.57 μg ml⁻¹，而游离血浆浓度分别为0.009和0.005 μg ml⁻¹（28和11 nM）。RO3244794在大鼠体内的口服生物利用度也高于RO1138452：分别为50.8%和0.69%。

[1]. RO1138452 and RO3244794: characterization of structurally distinct, potent and selective IP (prostacyclin) receptor antagonists. Br J Pharmacol. 2006 Feb;147(3):335-45.

[2]. 4,5-Dihydro-1H-imidazol-2-yl)-[4-(4-isopropoxy-benzyl)-phenyl]-amine (RO1138452) is a selective, pseudo-irreversible orthosteric antagonist at the prostacyclin (IP)-receptor expressed by human airway epithelial cells: IP-receptor-mediated inhibition of CXCL9 and CXCL10 release. J Pharmacol Exp Ther . 2008 Feb;324(2):815-26.

前列环素 (PGI2) 具有多种生理功能，包括调节伤害感受、炎症和心血管活动。由于缺乏选择性 IP 受体拮抗剂，对这些功能的阐明一直受到阻碍。目前已开发出两种结构不同的 IP 受体拮抗剂：4,5-二氢-1H-咪唑-2-基)-[4-(4-异丙氧基苄基)-苯基]-胺 (RO1138452) 和 R-3-(4-氟苯基)-2-[5-(4-氟苯基)-苯并呋喃-2-基甲氧羰基氨基]-丙酸 (RO3244794)。RO1138452 (CAY10441) 和 RO3244794 对 IP 受体具有高亲和力。在人血小板中，受体亲和力（pKi）分别为 9.3 ± 0.1 和 7.7 ± 0.03；在重组 IP 受体系统中，pKi 值分别为 8.7 ± 0.06 和 6.9 ± 0.1。通过测定卡前列环素诱导的 cAMP 在稳定表达人 IP 受体的 CHO-K1 细胞中积累的抑制情况，研究了 RO1138452 和 RO3244794 的功能性拮抗作用。RO1138452 和 RO3244794 的拮抗剂亲和力（pKi）分别为 9.0 ± 0.06 和 8.5 ± 0.11。通过一系列受体结合和酶活性测定，确定了 RO1138452 和 RO3244794 的选择性。 RO1138452 对 I2 (8.3) 和 PAF (7.9) 受体具有亲和力，而 RO3244794 对 IP 受体具有高度选择性：EP1 (< 5)、EP3 (5.38)、EP4 (5.74) 和 TP (5.09) 的 pKi 值均较低。RO1138452 (1-10 mg kg⁻¹，静脉注射) 和 RO3244794 (1-30 mg kg⁻¹，静脉注射) 均能显著减轻醋酸诱导的腹部收缩。RO1138452 (3-100 mg kg⁻¹，口服) 和 RO3244794 (0.3-30 mg kg⁻¹，口服) 均能显著减轻角叉菜胶诱导的机械性痛觉过敏和水肿。RO3244794 (1 和 10 mg kg⁻¹，口服) 还能显著减轻单碘乙酸诱导的慢性关节不适。这些数据表明，RO1138452 和 RO3244794 是人和大鼠 IP 受体的强效选择性拮抗剂，并具有镇痛和抗炎潜力。[1]

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值得注意的是，尽管 RO1138452 (CAY10441) 在体外对 IP 受体具有更高的亲和力，但在我们的体内大鼠试验中，口服或静脉注射后，RO1138452 的 ED50 值略高于 RO3244794，这可能是由于 RO1138452 在大鼠体内的药代动力学特征较差所致。与血浆半衰期更长（3.4 小时）且口服生物利用度更高的 RO3244794 相比，RO1138452 的血浆半衰期仅为 1.3 小时，且口服生物利用度极低。此外，RO3244794 本身的体内效力可能因血浆蛋白结合率较高而略有降低。[1]

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总之，RO1138452 (CAY10441)和 RO3244794 是新型 IP 受体拮抗剂，对人和啮齿动物的 IP 受体均具有高亲和力。体外研究表明，这些化合物对 IP 受体的选择性高于 EP 受体和其他前列腺素受体家族成员，以及许多其他受体和酶。两种化合物均已进行了广泛的体内药理学评价，结果表明 IP 受体拮抗剂具有镇痛和抗炎潜力。鉴于其相对较高的受体亲和力和选择性，这些化合物有望为深入了解 PGI2 的生理功能以及 IP 受体在心脏保护、血流调节、疼痛和炎症中的作用提供有益的见解。本文提交后，作者注意到一篇即将发表的论文（Nakae et al., 2005b）描述了与 RO3244794（Cournoyer et al., 2001）属于同一结构系列的两种化合物的生物活性。这些数据似乎证实了本文报道的一些体外实验结果。

C19H23N3O

309.4054

309.184

C, 73.76; H, 7.49; N, 13.58; O, 5.17

221529-58-4

9839644

Light yellow to brown solid powder

1.1±0.1 g/cm3

449.7±47.0 °C at 760 mmHg

225.8±29.3 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.597

3.17

45.65

2

2

6

23

380

0

O(C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])C([H])([H])C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])N([H])C1=NC([H])([H])C([H])([H])N1[H]

GYYRMJMXXLJZAB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H23N3O/c1-14(2)23-18-9-5-16(6-10-18)13-15-3-7-17(8-4-15)22-19-20-11-12-21-19/h3-10,14H,11-13H2,1-2H3,(H2,20,21,22)

N-[4-[(4-propan-2-yloxyphenyl)methyl]phenyl]-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-amine

RO 1138452; CAY10441; RO-1138452; 221529-58-4; RO1138,452; Ro-1138,452; CAY10441; N-[4-[(4-propan-2-yloxyphenyl)methyl]phenyl]-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-amine; CAY-10,441; N-(4-(4-isopropoxybenzyl)phenyl)-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-amine; DH5W8F3S4H; RO1138452; CAY-10441; CAY 10441

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 62~100 mg/mL (200.4~323.2 mM)
Ethanol: ~50 mg/mL (~161.6 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.08 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (8.08 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。