Rottlerin (Mallotoxin; NSC 56346; NSC 94525)   中文名称: 粗糠紫苦素

PKC; PKCδ(IC50 = 3-6 μM); PKCα,β,γ (IC50 = 30-42 μM); PKCε,η,ζ(IC50 = 80-100 μM)
Rottlerin is a dose-dependent inhibitor of PKCθ (IC50 ≈ 1.25 μM) and PKCδ (IC50 ≥ 6.0 μM). At concentrations < 6.0 μM, it shows selective inhibition for PKCθ over PKCδ and PKCε/λ.

在原代 HMVEC 中，rottlerin（20 μM，2/6/24 小时）显着且时间依赖性地降低细胞周期蛋白 D-1 mRNA 水平 [2]。在 HMVEC 中，rottlerin (20 μM) 会导致细胞生长 [2]。

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Rottlerin是从菲律宾Mallotus中纯化的天然产物，具有多种靶分子和生物效应。我们最近发现，Rottlerin通过抑制NFκB和下调细胞周期蛋白D-1，导致MCF-7乳腺癌症细胞和人永生角质形成细胞的生长停滞。为了评估这种作用是否可以推广到原代细胞，我们用Rottlerin处理了人微血管内皮细胞。在这项研究中，我们证明Rottlerin也可以阻止人微血管血管内皮细胞中基础和TNFα刺激的NFκB核迁移和DNA结合，其中NFκB的抑制伴随着NFκB靶基因产物的下调，如细胞周期蛋白D-1和内皮素-1，它们是内皮细胞增殖和存活的重要分子。事实上，Rottlerin抑制了人微血管内皮细胞在Matrigel上的增殖和管形成。Rottlerin还会增加细胞质游离钙和一氧化氮水平，下调内皮素转换酶-1的表达，从而导致内皮素-1下降和生长停滞。这些结果表明，Rottlerin可能被证明可用于开发抗血管生成的治疗药物[2]。

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Rottlerin 在 T 细胞中抑制 HIV-1 复制。在 MT-2 细胞中，IC50 为 5.2 μM，导致超过 20 倍的抑制。在 Jurkat 细胞中，IC50 为 2.2 μM，抑制超过 20 倍。在抗 CD3/CD28 激活的外周血淋巴细胞 (PBLs) 中，IC50 为 4.4 μM，导致超过 4 倍的抑制。
Rottlerin (3.0 μM) 显著抑制 MT-2 细胞中的 HIV-1 前病毒整合。
Rottlerin 在 Jurkat 细胞中，无论是在基础条件下还是在 PMA 激活后，均能诱导剂量依赖性的 HIV-1 LTR 反式激活抑制。它还抑制 NF-κB 依赖的荧光素酶表达和 Tat 介导的 HIV-1 反式激活。
在 Jurkat 和 MT-2 细胞中稳定干扰 PKCθ mRNA（实现 60-70% 的敲低），与对照细胞相比，分别导致 HIV-1 复制降低超过 3 倍和 4 倍。
用 PKCθ shRNA 和 HIV-1 前病毒克隆质粒瞬时共转染 PBLs，导致 HIV-1 复制降低超过 6 倍。
Rottlerin 在低细胞毒性浓度范围内，不能抑制不表达 PKCθ 的 U87.CD4.CXCR4 细胞中的 HIV-1 复制。
Rottlerin 不干扰病毒进入，因为它能抑制 VSV 假型化的 HIV-1 感染（不依赖 CD4/CXCR4），并且没有显著改变 CD4、CXCR4 或 CCR5 的细胞表面表达。
Rottlerin (3.0 μM) 不改变 MT-2 细胞中早期 (R/U5) 和晚期 (LTR/gag) HIV-1 逆转录产物的量。
Rottlerin (3.0 μM) 降低了 PKCθ 在 Thr538 位点的磷酸化，阻止其向脂筏的转位，并通过抑制 IκBα 磷酸化/降解和 NF-κB 核结合活性来抑制 PKCθ 通路效应因子 NF-κB。

在 Balb C 裸鼠中，Rottlerin（20 mg/kg，每天一次，每周五天，持续六周）抑制 AsPC-1 胰腺肿瘤的生长，而不引起毒性 [3]。 Rottlerin 激活 caspase-3 并裂解聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP) 以诱导细胞凋亡。

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Rottlerin处理的小鼠显示出对肿瘤生长的显著抑制，这与细胞增殖的抑制、capase-3的激活和PARP的切割有关。与未治疗的对照组相比，Rottlerin抑制了肿瘤组织中Bcl-2、细胞周期蛋白D1、CDK2和CDK6的表达，并诱导了Bax的表达。Rottlerin抑制血管生成标志物（Cox-2、VEGF、VEGFR和IL-8）和转移标志物（MMP-2和MMP-9），从而阻断肿瘤微环境中致瘤介质的产生。Rottlerin还通过上调E-cadherin和抑制Slug和Snail的表达来抑制上皮间质转化。此外，与对照组相比，罗特林治疗从Kras（G12D）小鼠分离的异种移植肿瘤或胰腺癌症细胞显示出对Akt、Shh和Notch途径的显著抑制。这些数据表明，rottlerin可以通过抑制在癌症中组成型活性的多种信号通路来抑制胰腺癌症的生长。总之，我们的数据表明，rottlerin通过靶向Akt、Notch和Shh信号通路诱导细胞凋亡并抑制胰腺癌症生长，并为人类提供了一种具有转化潜力的新治疗方法。[3]

Rottlerin是一种来自菲律宾Mallotus的化合物，被证明可以抑制蛋白激酶，对PKC具有一定的特异性。在某种程度上，这种新型抑制剂能够区分PKC同工酶，PKCδ的IC50值为3-6微M，PKCα、β、γ为30-42微M，而PKCε、η、ζ为80-100微M。PKC的抑制似乎至少部分是由于rottlerin和ATP之间的竞争。在所测试的蛋白激酶中，只有钙调素激酶III能像PKCδ一样有效地被rottlerin抑制。rottlerin的化学结构可作为开发新型抑制剂的基础，这些抑制剂对不同的PKC同工酶（如PKCδ）或CaM激酶III具有更高的选择性[1]。

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使用免疫沉淀激酶实验测定 PKCθ 和 PKCδ 的酶活性。将 Jurkat 细胞与抑制剂孵育 18 小时，裂解，用抗 PKCθ 或抗 PKCδ 抗体免疫沉淀细胞质提取物。将免疫沉淀物与 PKCε 肽底物、磷脂酰丝氨酸、二酰基甘油和 [γ-32P]ATP 在 30°C 下孵育 10 分钟。反应通过点样到磷酸纤维素 P81 纸上终止，用磷酸洗涤，并计数放射性。分析酶活抑制情况，并计算 IC50。

蛋白质印迹分析[2]
细胞类型：原代 HMVEC（人微血管内皮细胞）。
测试浓度：20μM。
孵化持续时间：2、6、24 小时。
实验结果： Cyclin D-1 mRNA 水平以时间依赖性方式显着降低。治疗2小时后，mRNA水平减少至对照的50%，6小时后降至约40%，24小时后降至20%。在蛋白质水平上也观察到类似的趋势，2小时后下降约50％，6小时后下降80％，24小时后下降至几乎不可检测的水平。小时。

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细胞增殖测定 [2]
细胞类型：原代 HMVEC（人微血管内皮细胞）。
测试浓度：20μM。
孵化持续时间：24/48 小时。
实验结果：表现出强烈的生长抑制作用，相对于对照细胞（DMSO 0.1%），胸苷掺入分别减少约 75% 和 80%。

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对于 HIV-1 感染实验，用抗 CD3/CD28 或 PHA/IL-2 激活 3 天的 PBLs，或 MT-2 细胞，用 Rottlerin 预处理 30 分钟，然后用 HIV-1 NL4.3 毒株感染 2 小时。洗涤后，再次加入化合物并培养 2-7 天。收集上清液测量 p24 抗原，裂解细胞定量 Renilla 或荧光素酶活性。IC50 测定采用 96 孔板形式，使用重组 HIV-1 NL4.3-Renilla 和递增浓度的 Rottlerin，在感染后 48 小时测量 Renilla 活性。
细胞活力测定使用发光细胞活力检测法，在细胞与 Rottlerin 孵育 72 小时后，定量代谢活跃细胞中的 ATP 水平。也通过明场显微镜和碘化丙啶染色的流式细胞术评估细胞活力。
细胞增殖使用非放射性细胞增殖实验测定。将 PBLs 在有或无 PHA 和 Rottlerin 的情况下培养 72 小时，然后加入四唑化合物混合物。3 小时后在 490 nm 测量吸光度。
对于 HIV-1 逆转录分析，使用感染 HIV-1 NL4.3-wt 18 小时的 MT-2 细胞提取总 DNA。进行半定量 PCR 扩增短链 (R/U5) 和长链 (LTR/gag) 逆转录产物。
对于 HIV-1 前病毒整合分析，对从感染 HIV-1 NL4.3-wt 18 小时的 MT-2 细胞提取的基因组 DNA 进行半定量巢式 Alu-PCR 实验。
对于转录活性实验，将 Jurkat 细胞用 LTR-LUC 或 3κB-LUC 报告载体转染，用 Rottlerin 和/或 PMA 处理，18 小时后测量荧光素酶活性。
对于 DNA 亲和免疫印迹，将 Jurkat 细胞的核提取物与含有 κB 共有基序的生物素标记探针孵育。用链霉亲和素-琼脂糖捕获蛋白-DNA 复合物，通过 SDS-PAGE 分离，并用针对 p65/RelA 的抗体进行免疫印迹分析。
对于稳定 PKCθ 敲低细胞的构建，通过电穿孔将 Jurkat 和 MT-2 细胞与 shRNA 质粒 (pGeneClip-iPKCθ-1 和 pGeneClip-iPKCθ-3) 共转染，并用嘌呤霉素筛选。

动物/疾病模型：将AsPC-1细胞（2×10⁶个细胞与Matrigel按50:50比例混合）注射到4-6周龄的Balb C裸鼠体内[3]。
剂量：0或20 mg/kg。
给药途径：每日一次，每周5天，持续6周。
实验结果：抑制了Balb C裸鼠体内AsPC-1胰腺肿瘤的生长，且对荷瘤小鼠的体重无影响。

大鼠口服LDLo 750 mg/kg，《印度生理学与药理学杂志》，3(168)，1959 [PMID:13841348]

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在静息状态下，用递增剂量的Rottlerin处理静息PBL、Jurkat和MT-2细胞72小时，评估了其细胞毒性。结果表明，在PBL中，浓度≥15 μM时可诱导细胞毒性；在Jurkat细胞中，浓度≥10 μM时可诱导细胞毒性。即使在 100 μM 的浓度下，MT-2 细胞也未观察到明显的细胞毒性。
半数最大细胞毒性浓度 (CC50) 采用 S 型剂量反应公式计算。
在 HIV-1 感染的 MT-2 细胞中，长期治疗（7 天）Rottlerin 并未显著降低细胞活力，反而通过保护细胞免受 HIV 诱导的细胞病变效应/合胞体形成，使细胞活力提高了 2 倍以上。
Rottlerin 以剂量依赖的方式抑制 PHA 诱导的 T 细胞增殖，在 3.0 μM 浓度下，T 细胞增殖水平维持在静息细胞水平。

[1]. Rottlerin, a novel protein kinase inhibitor. Biochem Biophys Res Commun. 1994 Feb 28;199(1):93-8.

[2]. Rottlerin exhibits antiangiogenic effects in vitro. Chem Biol Drug Des. 2011 Jun;77(6):460-70.

[3]. Rottlerin suppresses growth of human pancreatic tumors in nude mice, and pancreatic cancer cells isolated from KrasG12D mice. Cancer Letters 353 (2014) 32-40.

[4]. Protein kinase Ctheta is a specific target for inhibition of the HIV type 1 replication in CD4+ T lymphocytes. J Biol Chem. 2011 Aug 5;286(31):27363-77.

[5]. Kinase inhibitors tyrphostin 9 and rottlerin block early steps of rabies virus cycle. Antiviral Res. 2019 Aug;168:51-60.

罗特林是一种色烯醇类化合物，其结构为2,2-二甲基-2H-色烯，在5位和7位分别被羟基取代，6位被3-乙酰基-2,4,6-三羟基-5-甲基苄基取代，8位被(1E)-3-氧代-1-苯基丙-1-烯-3-基取代。它是一种钾通道开放剂，从菲律宾野桐（Mallotus philippensis）中分离得到。罗特林具有多种药理活性，包括抗肿瘤、诱导细胞凋亡、作为代谢产物、K-ATP通道激动剂、抗高血压和抗过敏作用。它是一种烯酮、色烯醇、苯三醇、甲基酮和芳香酮。
据报道，罗特林存在于菲律宾野桐（Mallotus philippensis）中，并有相关数据。

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本研究旨在探讨罗特林抑制Balb C裸鼠体内人胰腺肿瘤生长以及从Kras(G12D)小鼠分离的胰腺癌细胞生长的分子机制。将AsPC-1细胞皮下注射到Balb C裸鼠体内，并用罗特林治疗荷瘤小鼠。分别通过Ki67和TUNEL染色检测细胞增殖和凋亡。通过免疫组织化学、Western blot分析和/或qRT-PCR检测Akt、Notch和Sonic Hedgehog (Shh)信号通路组分的表达。同时，也研究了罗特林对从Kras(G12D)小鼠分离的胰腺癌细胞的影响。罗特林处理的小鼠肿瘤生长显著受到抑制，这与细胞增殖抑制、caspase-3激活和PARP裂解有关。与未处理的对照组相比，罗特林抑制了肿瘤组织中Bcl-2、cyclin D1、CDK2和CDK6的表达，并诱导了Bax的表达。罗特林抑制了血管生成标志物（Cox-2、VEGF、VEGFR和IL-8）和转移标志物（MMP-2和MMP-9），从而阻断了肿瘤微环境中致瘤介质的产生。罗特林还通过上调E-cadherin和抑制Slug和Snail的表达来抑制上皮-间质转化。此外，与对照组相比，罗特林处理异种移植瘤或从Kras(G12D)小鼠分离的胰腺癌细胞后，Akt、Shh和Notch信号通路均受到显著抑制。这些数据表明，rottlerin 可通过抑制胰腺癌中持续激活的多种信号通路来抑制胰腺癌的生长。综上所述，我们的数据表明，rottlerin 通过靶向 Akt、Notch 和 Shh 信号通路诱导细胞凋亡并抑制胰腺癌的生长，为人类提供了一种具有转化潜力的新型治疗方法。[3] HIV-1 基因组整合到 CD4(+) T 细胞中会产生半衰期长的潜伏病毒库，从而阻碍感染的清除。控制病毒复制对于减少潜伏病毒库的大小至关重要，尤其是在 HIV-1 大量感染 CD4(+) T 细胞的原发感染期间。在原发感染期间，在高效抗逆转录病毒疗法中加入免疫抑制剂可通过限制 T 细胞活化来抑制 HIV-1 复制，但这些药物可能存在引起淋巴增生性疾病的风险。选择性抑制对T细胞功能至关重要的蛋白激酶C (PKC)，可以限制T细胞活化和HIV-1复制，而不会引起全身免疫抑制，因为PKC主要在T细胞中表达。因此，我们分析了剂量依赖性PKC抑制剂rottlerin对T细胞中HIV-1复制的影响。Rottlerin能够使MT-2细胞（IC50 = 5.2 μM）和Jurkat细胞（IC50 = 2.2 μM）中的HIV-1复制降低20倍以上，使外周血淋巴细胞中的HIV-1复制降低4倍以上（IC50 = 4.4 μM）。在浓度低于6.0 μM时，观察到Rottlerin对PKC（而非PKCδ或-ζ）的选择性抑制，降低了激酶催化结构域激活环上Thr(538)残基的磷酸化水平，并阻止了PKC向脂筏的转位。因此，PKC通路末端的主要效应分子NF-κB受到抑制。Rottlerin也显著抑制了HIV-1的整合。近年来，人们设计了几种特异性PKC抑制剂用于治疗自身免疫性疾病。在原发感染期间，将这些抑制剂与高效抗逆转录病毒疗法联合使用，可能有助于避免受感染的CD4(+) T细胞进行大规模病毒感染和复制，从而在感染早期减少病毒库的大小。[4]狂犬病毒（RABV）是一种嗜神经病毒，可引起人类和动物的致命性脑炎，每年仍导致全球多达59,000人死亡。迄今为止，只有预防性或暴露后疫苗接种可以预防该疾病，但尚无有效的治疗方法。在筛选了一个包含80种激酶抑制剂的化合物库后，我们发现了两种有效的RABV感染抑制剂：tyrphostin 9和rottlerin。作用机制研究表明，这两种抑制剂均干扰病毒周期的早期步骤，并能阻止病毒复制。在酪氨酸激酶抑制剂9（tyrphostin 9）存在的情况下，病毒通过内吞作用进入细胞的过程受到干扰，导致病毒颗粒无法正常进入细胞质；而罗特林（rottlerin）则抑制转录，这很可能是通过降低细胞内ATP浓度实现的，从而抑制病毒基因组的复制。[5]

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罗特林（又名马洛毒素）是一种细胞可渗透的蛋白激酶C（PKC）抑制剂，用作研究工具。在长期培养中，其对HIV-1复制的抑制作用从感染开始就持续存在。
本研究使用罗特林是为了证明PKCθ在HIV-1在T细胞中的复制中的重要性，而非将其推广为临床候选药物。该化合物的治疗窗较窄，仅用于研究。
PKCθ选择性地在T细胞中表达，对T细胞受体介导的激活和NF-κB信号通路至关重要。特异性抑制PKCθ可以限制T细胞活化和HIV-1复制，而不会引起全身免疫抑制。
作者建议，针对自身免疫性疾病设计的特异性PKCθ抑制剂可以与高效抗逆转录病毒疗法（HAART）联合用于原发性HIV-1感染，以减少病毒的大量复制和潜伏病毒库的建立。

C30H28O8

516.53852

516.178

C, 69.76; H, 5.46; O, 24.78

82-08-6

5281847

Brown to reddish brown solid powder

1.4±0.1 g/cm3

800.4±65.0 °C at 760 mmHg

200 °C

266.0±27.8 °C

0.0±2.9 mmHg at 25°C

1.682

8.66

144.52

5

8

6

38

921

0

CC1=C(C(=C(C(=C1O)C(=O)C)O)CC2=C(C(=C3C(=C2O)C=CC(O3)(C)C)C(=O)/C=C/C4=CC=CC=C4)O)O

DEZFNHCVIZBHBI-ZHACJKMWSA-N

InChI=1S/C30H28O8/c1-15-24(33)19(27(36)22(16(2)31)25(15)34)14-20-26(35)18-12-13-30(3,4)38-29(18)23(28(20)37)21(32)11-10-17-8-6-5-7-9-17/h5-13,33-37H,14H2,1-4H3/b11-10+

(E)-1-(6-((3-Acetyl-2,4,6-trihydroxy-5-methylphenyl)methyl)-5,7-dihydroxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-8-yl)-3-phenyl-2-propen-1-one

Mallotoxin; NSC 56346; rottlerin; Mallotoxin; 82-08-6; Kamalin; UNII-E29LP3ZMUH; E29LP3ZMUH; EINECS 201-395-4; NSC 94525; NSC56346; NSC94525; Kamalin; NSC-56346; NSC-94525.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~12.5 mg/mL (~24.20 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (2.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (2.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 22 mg/mL (42.59 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。