RVX-297

BET bromodomain-containing proteins (BRD2, BRD3, BRD4), with selectivity for BD2 (second bromodomain). RVX-297 has 47-58 fold greater affinity for BD2 than for BD1. [1]

在滑膜成纤维细胞中，RVX-297（1-30 μM；24 小时）可降低促炎基因的表达[1]。与非选择性结合 BET 结合域的泛 BET 抑制剂类似，RVX-297 可将 BET 蛋白从敏感基因启动子上置换下来，并抑制活性 RNA 聚合酶 II 的募集[1]。体外实验表明，RVX-297 可降低炎症介质的基因表达。RVX-297 以剂量依赖的方式抑制人 U937 巨噬细胞、小鼠脾脏来源的原代 B 细胞、小鼠骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM) 和 THP-1 单核细胞中 IL-6 基因的诱导。RVX-297 的 IC50 值为 0.4-3 μM，可抑制脂多糖 (LPS) 刺激的小鼠 BMDM 中 IL-1β 的表达。 RVX-297 对未刺激的人外周血单核细胞 (PBMC) 中 MCP-1 表达的抑制 IC50 为 0.4 μM。RVX-297 可抑制 T 细胞抗原刺激和 IL-17 表达诱导 [1]。

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RVX-297 可抑制多种免疫细胞类型中的炎症基因表达。在人 U937 巨噬细胞、小鼠原代 B 细胞、小鼠骨髓来源巨噬细胞 (BMDM) 和 THP-1 单核细胞中，RVX-297 以剂量依赖的方式抑制 IL-6 基因的诱导。在 LPS 刺激的小鼠 BMDM 中，IL-1β 表达受到抑制。RVX-297 可抑制未刺激的人 PBMC 中 MCP-1 的表达。[1]
在 OKT3 刺激的人 PBMC 中，RVX-297 可抑制 IL-17 基因的表达。 [1]
在用TNFα刺激的人类类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞中，RVX-297（1、3、10 μM）在24小时后以剂量依赖的方式下调IL-6和VCAM-1基因表达。[1]
在用LPS刺激的原代小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中，RVX-297以及泛BET抑制剂JQ1和I-BET762抑制了IL-6、IL-1β和TNFα基因表达的上调。该系统中IL-6抑制的IC50为3.0 μM。[1]
作用机制：小鼠BMDM的染色质免疫沉淀（ChIP）研究表明，RVX-297（10 μM）处理降低了BRD3和BRD4（而非BRD2）与IL-6启动子的结合；降低了IL-1β启动子上的BRD4蛋白丰度；并降低了IL-6和IL-1β启动子上活性RNA聚合酶II（RNA pol II P-Ser2）的含量。它不影响NF-κBia启动子上的BET蛋白丰度，也不改变IL-6启动子上乙酰化组蛋白H4的水平。[1]

在胶原蛋白诱导的大鼠关节炎模型中，RVX-297（25–75 mg/kg；口服；每日一次，连续6天）可阻止疾病进展[1]。在胶原蛋白诱导的小鼠关节炎模型中，RVX-297（75–150 mg/kg）可阻止关节炎模型的病理进展[1]。在LPS处理的小鼠中，给予RVX-297后，细胞因子的产生减少[1]。

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LPS诱导的内毒素血症模型：在LPS刺激的C57Bl/6小鼠中，RVX-297（75 mg/kg，口服，刺激前4小时和刺激时）可降低循环血清中IL-6、IL-17和IFNγ的水平。它还能降低脾脏中IL-6和IL-17基因的表达。多分析物谱分析显示血清中GM-CSF、MCP-1、MCP-5、IL-2、TNFα和RANTES水平降低。[1]
大鼠胶原诱导性关节炎（rCIA）模型：在已建立关节炎的雌性Lewis大鼠中，RVX-297（25、50、75 mg/kg，口服，每日两次，连续6天）可减轻踝关节直径的增加。它可减少踝关节和膝关节的滑膜炎、软骨损伤、血管翳形成和骨吸收。它显著降低了踝关节中IL-1β、RANKL、MMP3和MMP13基因的表达以及IL-6和VCAM-1蛋白的水平。 [1]
小鼠胶原诱导性关节炎 (mCIA) 模型：RVX-297（75、150 mg/kg，口服，每日两次）可阻止临床关节炎评分的升高，并降低爪和膝关节的组织病理学评分。它还显著降低了抗 II 型胶原 IgG 血清水平。[1]
小鼠胶原抗体诱导性关节炎 (mCAIA) 模型：在已确诊的小鼠中，RVX-297（150 mg/kg，口服，每日两次，持续 9 天）可阻止临床症状的进展，并显著降低组织病理学评分。[1]
小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 模型：
预防方案：RVX-297（75、125 mg/kg，口服，每日两次，持续 27 天）可抑制 EAE 临床评分的升高，并预防 EAE 相关的体重减轻。脊髓组织学检查显示无炎症灶、脱髓鞘或凋亡细胞，与正常小鼠无异。该药物降低了脊髓中炎症基因（IL-6、IL-17、MCP-1、GM-CSF、TNFα）的表达，并减少了中枢神经系统中产生IL-6、GM-CSF和IFNγ的CD4+细胞的比例。[1]
治疗方案：RVX-297（75、125/100 mg/kg，口服，每日两次，持续18天）以剂量依赖的方式抑制了EAE临床评分的升高，并减轻了EAE相关的体重减轻。它显著减少了脊髓中的炎症、脱髓鞘和凋亡细胞。 [1]
体外评估：从经RVX-297治疗的EAE小鼠中分离出的淋巴细胞，在用MOG35-55再次刺激后，培养基中IL-17a、IL-6、TNFα和IFNγ的分泌显著减少。[1]

染色质免疫沉淀 (ChIP)：将小鼠骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM) 接种于培养皿中，并用化合物 (RVX-297 或 DMSO) 处理 1 小时。随后加入 LPS (1 μg/mL)，继续孵育 3 小时。用 1% 甲醛交联细胞，用甘氨酸淬灭，并通过超声处理剪切染色质。使用针对 BRD2、BRD3、BRD4、RNA 聚合酶 II、四乙酰化组蛋白 H4 或 IgG 的抗体进行免疫沉淀。解交联后，提取 DNA，并进行实时 PCR 以确定这些蛋白在基因启动子 (IL-6、IL-1β、NF-κBia) 处的相对丰度。[1]

RT-PCR[1]
细胞类型： 滑膜成纤维细胞
测试浓度： 1-30 μM
孵育时间： 24 小时
实验结果： 滑膜成纤维细胞中 IL-6 和 VCAM-1 基因表达下调。

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U937 细胞处理：用 60 ng/mL 佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 (PMA) 处理 U937 细胞 3 天，诱导其分化为巨噬细胞样细胞。细胞用 RVX-297 或 DMSO 预处理 1 小时，然后加入 LPS (1 μg/mL)。细胞孵育 3 小时后，进行实时 PCR 基因表达分析。 [1]
原代B细胞的分离和处理：使用CD43磁珠从C57/Bl6小鼠脾脏中分离B细胞。将细胞接种于培养皿中，并用RVX-297或DMSO、LPS（1 μg/mL）和离子霉素（1 μM）处理3小时，然后进行基因表达分析。[1]
人外周血单核细胞（PBMC）中IL-17的表达：将人PBMC解冻，并用RVX-297或DMSO预处理1小时。然后加入含有OKT3（1 μg/mL）的培养基，继续孵育3小时。通过实时PCR分析IL-17基因的表达。[1]
PBMC中MCP1的检测：将冷冻保存的人PBMC用RVX-297或DMSO处理3小时，并通过实时PCR分析MCP1基因的表达。 [1]
小鼠骨髓来源巨噬细胞 (BMDM) 的分离和处理：从小鼠股骨中分离 BMDM，并分化 6 天。将细胞重新铺板，并用 RVX-297 或 DMSO 处理 1 小时，随后用 LPS (1 μg/mL) 刺激 3 小时。通过实时 PCR 分析 IL-6 和 IL-1β 的表达。[1]
人类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞：将滑膜成纤维细胞铺板，并按照与 U937 细胞相同的方法进行处理，不同之处在于使用 30 ng/mL TNFα 进行刺激。处理 24 小时后进行实时 PCR。[1]
实时 PCR：从细胞培养物中分离 mRNA。通过基于 TaqMan 的实时 PCR 检测基因表达。mRNA 水平以内源性对照进行测定。[1]

动物/疾病模型： 雌性Lewis大鼠，6-8周龄，约150克（大鼠胶原诱导性关节炎）[1]
剂量： 25、50和75 mg/kg
给药途径： 口服；每日一次，连续6天
实验结果： 可预防踝关节和膝关节的肿胀和炎症。

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化合物制剂：** RVX-297以EA006制剂的形式用于口服给药。每种制剂中受试化合物的浓度均通过LC/MS/MS进行验证。[1]
* **LPS诱导的内毒素血症小鼠模型：** 8周龄雄性C57Bl/6小鼠腹腔注射LPS。在LPS刺激前4小时和刺激时分别口服给予RVX-297，剂量为75 mg/kg。为测定血清细胞因子水平，动物接受 5 μg LPS 注射，并在注射后 4 小时收集血清。为进行基因表达分析，动物接受 10 μg LPS 注射，并在注射后 3 小时收集脾脏。[1]
* **大鼠胶原诱导性关节炎 (rCIA)：** 雌性 Lewis 大鼠（6-8 周龄）于第 0 天经皮内注射牛 II 型胶原蛋白（与弗氏不完全佐剂 (IFA) 乳化）进行免疫，并在第 7 天进行加强免疫。从第 11 天（关节炎期）开始，以 25、50 和 75 mg/kg/剂量，每日两次 (bid) 口服 RVX-297，持续 6 天。通过体重、踝关节直径测量、踝关节和膝关节的组织病理学以及踝关节的基因表达/细胞因子水平评估疗效。 [1]
* **小鼠胶原抗体诱导关节炎 (mCAIA)：** 将四种抗胶原蛋白 II 的致关节炎单克隆抗体混合物静脉注射到雌性 BALB/cAnNHsd 小鼠体内。24 小时后，小鼠腹腔注射 25 μg LPS。LPS 注射后 30 小时开始，每天两次口服 RVX-297 (150 mg/kg)，持续 9 天。通过体重、临床关节炎评分、后爪总重和组织学评估来评价疗效。[1]
* **小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)：** 用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 35-55 (MOG35-55) 和弗氏完全佐剂 (CFA) 免疫雌性 C57Bl/6 小鼠，诱导 EAE。百日咳毒素在免疫后2小时和24小时通过腹腔注射给药。RVX-297采用灌胃法给药，治疗方案为75 mg/kg和125 mg/kg，每日两次（bid），疗程18天（从出现EAE首发症状开始），预防方案为27天（免疫后立即开始）。在治疗方案中，由于耐受性问题，125 mg/kg的剂量在第10天调整为100 mg/kg，每日两次。EAE的发展和临床评分根据临床表现进行评估，并收集脊髓进行基因表达分析、流式细胞术和组织学评估。[1]

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化合物制剂：RVX-297配制成EA006制剂，用于口服给药。采用LC/MS/MS法验证各制剂中受试化合物的浓度。 [1]
LPS诱导内毒素血症小鼠模型：8周龄雄性C57Bl/6小鼠腹腔注射LPS。在LPS刺激前4小时和刺激时分别口服RVX-297（75 mg/kg）。为测定血清细胞因子水平，小鼠注射5 μg LPS，并在注射后4小时采集血清。为进行基因表达分析，小鼠注射10 μg LPS，并在注射后3小时采集脾脏。 [1]
大鼠胶原诱导性关节炎 (rCIA)：雌性 Lewis 大鼠（6-8 周龄）于第 0 天皮内注射牛 II 型胶原蛋白（与弗氏不完全佐剂 (IFA) 乳化）进行免疫，第 7 天进行加强免疫。从第 11 天（关节炎期）开始，以 25、50 和 75 mg/kg/剂量，每日两次口服 RVX-297，持续 6 天。通过体重、踝关节直径测量、踝关节和膝关节的组织病理学以及踝关节的基因表达/细胞因子水平评估疗效。[1]
小鼠胶原抗体诱导性关节炎 (mCAIA)：雌性 BALB/cAnNHsd 小鼠静脉注射四种抗 II 型胶原蛋白的致关节炎单克隆抗体的混合物。 24小时后，小鼠腹腔注射25 μg LPS。LPS注射后30小时开始，每日两次口服RVX-297（150 mg/kg），持续9天。疗效评价指标包括体重、临床关节炎评分、后爪总重和组织学评估。[1]
小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）：用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）和弗氏完全佐剂（CFA）免疫C57Bl/6雌性小鼠，诱导EAE。免疫后2小时和24小时腹腔注射百日咳毒素。 RVX-297 的给药方式为：治疗方案中，从出现 EAE 首发症状时开始，每日两次（bid），剂量分别为 75 和 125 mg/kg，持续 18 天；预防方案中，从免疫接种后立即开始，持续 27 天。在治疗方案中，由于耐受性问题，第 10 天将 125 mg/kg 的剂量调整为 100 mg/kg，每日两次。EAE 的发展情况和临床评分根据临床表现进行评估，并收集脊髓进行基因表达分析、流式细胞术和组织学评估。[1]

大鼠体内系统暴露：在大鼠胶原诱导关节炎 (rCIA) 模型中，RVX-297 的血浆暴露量 (AUC0-12) 在 25 mg/kg bid 剂量下为 23,165 hrng/mL，在 50 mg/kg bid 剂量下为 52,145 hrng/mL，在 75 mg/kg bid 剂量下为 86,452 hrng/mL [1]

在小鼠EAE模型的治疗方案中，RVX-297以125 mg/kg bid的剂量给药时耐受性较差，导致体重加速下降。治疗第10天，剂量调整为100 mg/kg bid。[1]

[1]. RVX-297, a BET Bromodomain Inhibitor, Has Therapeutic Effects in Preclinical Models of Acute Inflammation and Autoimmune Disease. Mol Pharmacol. 2017;92(6):694-706.

[2]. RVX-297- a novel BD2 selective inhibitor of BET bromodomains. Biochem Biophys Res Commun. 2016;477(1):62-67.

背景：溴结构域和末端外结构域（BET）蛋白是染色质衔接蛋白，可调节基因转录。RVX-297 是一种新型的口服活性 BET 抑制剂，对 BD2 溴结构域具有选择性。[1]
机制：RVX-297 通过将 BET 蛋白从敏感基因启动子上的乙酰化组蛋白上置换下来，从而降低炎症基因的表达，并干扰活性 RNA 聚合酶 II 的募集。[1]
疗效：该研究首次证实，BD2 选择性 BET 抑制剂具有抗炎特性，并且在急性炎症和自身免疫性疾病（多发性关节炎、多发性硬化症）的临床前模型中有效。[1]
比较：在 EAE 模型中，RVX-297 的疗效与 S1P1 激动剂 FTY720（芬戈莫德，一种已获批准的多发性硬化症治疗药物）相当或更优。 [1]
资金来源：本研究由 Resverlogix 公司资助。[1]

C24H29N3O4

423.504766225815

423.215

1044871-04-6

135567084

White to light brown solid powder

3.5

72.4

1

6

7

31

639

0

O(C1C(C)=CC(C2=NC3C=C(C=C(C=3C(N2)=O)OC)OC)=CC=1C)CCN1CCCC1

PQZDYFRDRHRZGF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H29N3O4/c1-15-11-17(12-16(2)22(15)31-10-9-27-7-5-6-8-27)23-25-19-13-18(29-3)14-20(30-4)21(19)24(28)26-23/h11-14H,5-10H2,1-4H3,(H,25,26,28)

2-[3,5-dimethyl-4-(2-pyrrolidin-1-ylethoxy)phenyl]-5,7-dimethoxy-3H-quinazolin-4-one

RVX-297 RVX297 RVX 297

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~118.06 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。