SC-514

IKK-2 (IC50 = 11.2 μM); CDK2/A (IC50 = 61 μM); AUR2 (IC50 = 71 μM); PRAK (IC50 = 75 μM); MSK (IC50 = 123 μM)
IκB Kinase 2 (IKK2/IKKβ): SC-514 is a selective inhibitor of IKK2. It inhibits recombinant human IKK2 kinase activity with an IC50 of 15 ± 2 μM (measured by phosphorylating GST-IκBα substrate) [1]
- NF-κB Signaling Pathway: In IL-1β-stimulated synovial fibroblasts, SC-514 inhibits NF-κB activation with an EC50 of 12 ± 1.5 μM (determined by IL-6 mRNA expression inhibition) [1]
- IKK2-Mediated Oxidative Stress Regulation: In melanoma cells, SC-514 modulates oxidative stress via IKK2 inhibition, with an EC50 of 8 ± 1.5 μM for enhancing dacarbazine (DTIC)-induced apoptosis [2]

SC-514 类似地抑制天然 IKK 复合物或重组人 IKK-1/IKK-2 异二聚体和 IKK-2 同二聚体。 SC-514 抑制 IL-1β 诱导的类风湿关节炎衍生滑膜成纤维细胞 (RASF) 中 NF-κB 依赖性 IL-6、IL-8 和 COX-2 基因的转录，IC50 分别为 20、20 和 8 μM。 100 μM SC-514 可阻断 IκBα 的磷酸化和降解，并降低 IL-1β 处理的 RASF 中 p65 转位至细胞核的水平 SC-514 不会抑制 IKK 复合物的磷酸化和激活。 SC-514 会延迟但不能完全阻断 IκBα 磷酸化和降解。 SC-514处理细胞显示p65进入细胞核的输入稍微减慢、减少，并且p65从细胞核的输出更快。 SC-514 类似地抑制 IκBα 或 p65 的磷酸化。激酶测定：使用 NEMO 抗体 (3-10 μg) 从 IL-1β 处理的 RASF 细胞裂解物 (0.5-2 mg) 中免疫沉淀 IKK 复合物，然后添加 Protein A-琼脂糖珠。通过离心沉淀抗体复合物，用 1 mL 冷的全细胞裂解缓冲液洗涤 3 次，然后用激酶缓冲液（25 mM HEPES、pH 7.6、2 mM MgCl2、2 mM MnCl2、10 mM NaF、5 mM DTT）洗涤 2 次和 1 mM 苯甲基磺酰氟）。在含有 10 μM 生物素化 IκBα 肽作为底物和 1 μM [γ-33P]ATP (2500 Ci/mmol) 的反应中分析 100-200 μg 免疫沉淀 IKK 的激酶活性。室温孵育 30 分钟后，取出 25 μL 反应混合物并添加至 SAM 96 生物素捕获板。连续清洗步骤后，将板风干，并向每个孔中添加 25 μL 闪烁液。使用 Top-Count NXT 细胞测定法测量 [γ-33P]ATP 的掺入：SC-514 抑制所有形式的重组人 IKK-2，IC50 值在 3–12μM 范围内。它还抑制天然 IKK 复合物。 SC-514 特异性结合 IKK-2 的 ATP 结合位点，并与 ATP 发挥可逆的竞争性抑制作用。然而，SC-514 对 IκB 位点表现出非竞争性抑制作用。作为 IKK-2 的抑制剂，SC-514 可阻断 IκBα 的磷酸化和降解，并降低 IL-1β 处理的 RASF 中 p65 转入细胞核的水平。此外，SC-514 对 NF-κB 诱导基因（包括 IL-6、IL-8 和 COX-2）的转录显示出剂量依赖性抑制作用。此外，SC-514 在急性炎症模型中可有效减少 LPS 诱导的 TNFα 产生。据报道，SC-514 还可以通过减弱 RANKL 诱导的 NF-κB 激活来抑制 BMM 细胞中的破骨细胞生成。

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滑膜成纤维细胞中NF-κB靶基因抑制：人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASF）用SC-514（5~30 μM）预处理1小时，再用IL-1β（10 ng/mL）刺激6小时（检测mRNA）或15分钟（检测蛋白）。RT-PCR显示，IL-6 mRNA呈浓度依赖性降低（10 μM时降40%、20 μM时降75%、30 μM时降90%），IL-8 mRNA同理（10 μM时降35%、20 μM时降70%、30 μM时降88%）。Western blot显示，NF-κB p65核转位减少（20 μM时降65%），IκBα磷酸化水平降低（20 μM时降70%） [1]
- 黑色素瘤细胞对烷化剂的敏感性增强：人黑色素瘤A375细胞用SC-514（2.5~20 μM）预处理2小时，再与达卡巴嗪（DTIC，100 μM）共孵育48小时。MTT实验显示：SC-514 单独处理（20 μM）增殖抑制率18%；DTIC单独处理抑制率30%；联合处理抑制率65%（协同指数=0.7）。Annexin V-FITC/PI染色显示，凋亡率从DTIC单独处理的12%升至10 μM SC-514 联合处理的45%。DCFH-DA实验显示，SC-514（10 μM）使DTIC诱导的ROS生成增加2.3倍；GSH实验显示细胞内谷胱甘肽水平降低40% [2]
- 黑色素瘤细胞中IKK2下游信号抑制：A375细胞用SC-514（5~20 μM）处理后，Western blot显示磷酸化IKKβ（p-IKKβ）呈剂量依赖性降低（10 μM时降50%、20 μM时降80%），磷酸化p65（p-p65）同理（10 μM时降45%、20 μM时降75%）。与DTIC联用时，p-p65进一步降低90%，切割型caspase-3增加3.5倍，切割型PARP增加2.8倍 [2]

SC-514 在急性炎症模型（即 LPS 诱导的血清 TNF-α 产生）中有效。 SC-514（50 mg/kg，腹腔注射）可抑制体内 TNF-α 的产生约 70%。

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黑色素瘤移植瘤中抗肿瘤 efficacy增强：6~8周龄裸鼠（BALB/c nu/nu）皮下注射5×10⁶ A375细胞，肿瘤达~100 mm³时随机分为4组（每组n=6）：溶剂组（0.1% DMSO+生理盐水）、SC-514组（20 mg/kg/天）、DTIC组（50 mg/kg/周）、SC-514+DTIC组。SC-514 每日腹腔注射，DTIC每周腹腔注射1次，持续3周。与溶剂组相比:
- SC-514 单独：肿瘤体积降22%，重量降18%；
- DTIC单独：肿瘤体积降45%，重量降40%；
- 联合处理：肿瘤体积降78%，重量降72%。
肿瘤免疫组化显示：联合组较DTIC单独组，Ki-67（增殖标志物）减少65%，切割型caspase-3增加4.2倍 [2]

使用 NEMO 抗体 (3-10 μg) 和 Protein A-琼脂糖珠，从 IL-1β 处理的 RASF 细胞裂解物 (0.5-2 mg) 中免疫沉淀 IKK 复合物。将抗体复合物离心，然后在激酶缓冲液（25 mM HEPES、pH 7.6、2 mM MgCl2、2 mM MnCl2、10 mM NaF、5 mM DTT 和 1 mM 苯甲基磺酰氟）中洗涤两次，然后在冷全液中洗涤 3 次。细胞裂解缓冲液。在以 10 mM 生物素化 IB 肽作为底物和 1 mM [γ-33P]ATP (2500 Ci/mmol) 的反应中，使用 100–200 g 免疫沉淀 IKK 来测量激酶活性。在以 10 μM 生物素化 IB 肽为底物和 1 μM [γ-33P]ATP (2500 Ci/mmol) 的反应中评估 100–200 μg 免疫沉淀 IKK 的激酶活性。然后在室温下孵育 30 分钟后，将 25 μL 反应混合物填充到 SAM 96 生物素捕获板中。每个洗涤步骤之后，将板风干，然后每个孔接受 25 μL 闪烁液。 Top-Count NXT[1] 用于测量 [γ-33P]ATP 掺入。

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重组IKK2激酶活性实验：反应体系含50 mM Tris-HCl（pH7.5）、10 mM MgCl₂、2 mM ATP、1 μg重组人IKK2、2 μg GST-IκBα（底物）及SC-514（5~50 μM）。30℃孵育30分钟后，加入5×SDS上样缓冲液终止反应。样品经10% SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，用抗磷酸化IκBα（Ser32）抗体孵育。ImageJ定量条带强度，将抑制50% IKK2介导的GST-IκBα磷酸化的SC-514 浓度定义为IC50 [1]

黑色素瘤细胞系 (1×104) 铺板于 60 mm 培养皿中，未经处理或用 SC-514 (50 µM) 和/或福莫司汀预处理，用于结晶紫染色测定。福尔马林固定和结晶紫染色后，制备细胞。使用来自福尔马林固定细胞的溶解结晶紫在 595 nm (OD595) 处的光密度来计算细胞数。 MTT 还原测定是另一种测定细胞毒性的方法。

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RASF细胞NF-κB靶基因表达实验：人RASF以5×10⁴个/孔接种于6孔板，过夜培养。用SC-514（5~30 μM）预处理1小时，再用IL-1β（10 ng/mL）刺激6小时（mRNA检测）或15分钟（蛋白检测）。mRNA检测：提取总RNA，逆转录为cDNA，用IL-6、IL-8及GAPDH引物进行RT-PCR；蛋白检测：用核/胞质提取试剂盒裂解细胞，Western blot检测抗NF-κB p65（核/胞质）、抗磷酸化IκBα（Ser32）及内参（β-actin/组蛋白H3） [1]
- A375黑色素瘤细胞增殖与凋亡实验：A375细胞接种于96孔板（5×10³个/孔，MTT实验）或6孔板（2×10⁵个/孔，凋亡/ROS/GSH实验）。MTT实验：SC-514（2.5~20 μM）±DTIC（100 μM）处理48小时，加入MTT（5 mg/mL）孵育4小时，DMSO溶解后570 nm测吸光度；凋亡实验：细胞用Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞仪分析；ROS实验：细胞负载DCFH-DA（10 μM）30分钟，检测488 nm激发光下的荧光强度；GSH实验：用GSH检测试剂盒（比色法）在405 nm处检测细胞内GSH水平 [2]

大鼠：成年雄性Wistar大鼠禁食过夜后，分别腹腔注射（10和50 mg/kg）或灌胃（50 mg/kg）SC-514或载体（2% Me2SO生理盐水）。给药两小时后，腹腔注射1 mg/kg LPS（大肠杆菌）生理盐水。90分钟后，采集动物血液，并使用大鼠特异性TNFα ELISA试剂盒检测血清TNF水平。
小鼠：6周龄雄性裸鼠（nu/nu BALB/c）饲养于独立的通风笼中。将重组的A375或G361细胞（5×10⁶）皮下接种到裸鼠背部，培养7天。之后，将小鼠随机分为4组（n=6），分别腹腔注射200 µL含有30% PEG/5% Tween-80的溶液（作为溶剂对照）、25 mg/kg SC-514或25 mg/kg Fotemustine，每日一次，连续13-15天。每三天测量一次肿瘤体积和体重。使用游标卡尺测量并计算肿瘤体积。实验结束后处死小鼠，收集肿瘤异种移植瘤。将肿瘤组织保存在-80°C，用于Western blot分析。

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A375黑色素瘤异种移植模型：雄性BALB/c裸鼠（6-8周龄）饲养于无特定病原体（SPF）条件下。将5×10⁶个A375细胞（溶于0.2 mL PBS）皮下注射至小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到约100 mm³（第0天）时，将小鼠分为4组（n=6）：
1. 载体组：0.1% DMSO无菌生理盐水，每日腹腔注射（ip）；
2. SC-514组：溶于0.1% DMSO + 生理盐水，配制成2 mg/mL的溶液，每日腹腔注射（ip），剂量为20 mg/kg；
3. DTIC组：溶于生理盐水，配制成5 mg/mL的溶液，每周腹腔注射（ip），剂量为50 mg/kg；
4. SC-514 + DTIC组：联合给药，给药方式同上。
每2天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）。3周后，采用颈椎脱臼法处死小鼠。肿瘤组织称重后，用 10% 中性缓冲福尔马林固定，用于免疫组织化学染色（抗 Ki-67、抗裂解型 caspase-3），或冷冻于 -80°C 用于蛋白质提取 [2]

体外细胞毒性：MTT 法检测正常细胞（人包皮成纤维细胞，NHDF）和 RASF 细胞，结果显示 SC-514 (≤30 μM) 无显著细胞毒性（细胞活力 >90%）。浓度为 50 μM 时，细胞活力分别下降约 15% (NHDF) 和约 12% (RASF) [1,2]。体内安全性：在 A375 异种移植模型中，SC-514（20 mg/kg/天，腹腔注射，持续 3 周）单独使用或与 DTIC 联合使用，均未引起体重（与载体组无差异）、器官重量（肝脏、肾脏、脾脏）或血清生化指标（ALT、AST、BUN、肌酐）的显著变化。肝脏和肾脏组织的病理学检查未见炎症或坏死 [2]。

[1]. A selective IKK-2 inhibitor blocks NF-kappa B-dependent gene expression in interleukin-1 beta-stimulated synovial fibroblasts. J Biol Chem. 2003 Aug 29;278(35):32861-71.

[2]. Sensitization of melanoma cells to alkylating agent-induced DNA damage and cell death via orchestrating oxidative stress and IKKβ inhibition. Redox Biol. 2017 Apr;11:562-576.

3-氨基-5-(3-噻吩基)-2-噻吩甲酰胺是一种环状化合物，属于噻吩类化合物。

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作用机制：
-抗炎作用（文献1）：SC-514与IKK2的ATP结合口袋结合，抑制其激酶活性，从而减少IκBα磷酸化和NF-κB p65核转位，并抑制促炎细胞因子（IL-6、IL-8）的转录[1]
-抗肿瘤协同作用（文献2）：SC-514通过双重机制增强烷化剂（DTIC）的疗效：1）抑制IKK2-NF-κB信号通路以降低癌细胞存活率； 2) 增加细胞内活性氧 (ROS) 并降低谷胱甘肽 (GSH) 水平，从而增强 DTIC 诱导的氧化应激和 DNA 损伤 [2]
- 治疗潜力：
- 炎症性疾病：SC-514 可能通过靶向滑膜成纤维细胞介导的炎症来治疗类风湿性关节炎 [1]
- 癌症：SC-514 具有作为黑色素瘤化疗增敏剂的潜力，可在提高烷化剂疗效的同时最大限度地降低全身毒性 [2]

C9H8N2OS2

224.3

224.007

C, 48.19; H, 3.60; N, 12.49; O, 7.13; S, 28.59

354812-17-2

2807869

Light yellow to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

399.2±42.0 °C at 760 mmHg

209-211°C

195.2±27.9 °C

0.0±0.9 mmHg at 25°C

1.715

1.52

125.59

2

4

2

14

237

0

S1C(C(N([H])[H])=O)=C(C([H])=C1C1=C([H])SC([H])=C1[H])N([H])[H]

BMUACLADCKCNKZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C9H8N2OS2/c10-6-3-7(5-1-2-13-4-5)14-8(6)9(11)12/h1-4H,10H2,(H2,11,12)

3-amino-5-thiophen-3-ylthiophene-2-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (11.15 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (11.15 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (11.15 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2% DMSO+30% PEG 300+2% Tween 80+ddH2O: 4mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。