Sepin-1

Separase (non-competitive inhibitor) [1]
Forkhead box protein M1 (FoxM1) (expression is inhibited) [1]
Raf kinase family members (A-Raf, B-Raf, C-Raf) (expression is inhibited) [1]

Sepin-1（0、20、40 µM；24 小时）可造成 DNA 损伤，并抑制细胞迁移和伤口愈合 [1]。在模拟的表达模式变化中，Sepin-1（0、10、20、40 µM；24 小时）可抑制 Plk1、Cdk1、pericentrin、Aurora 和 Lamin B1 的蛋白水平 [1]。细胞增殖实验表明，Sepin-1 可降低 FoxM1 蛋白的 mRNA 含量和表达 [1]。在乳腺癌细胞系 BT-474、MCF7、MDA-MB-231 和 MDA-MB-468 中，Sepin-1 以剂量依赖的方式抑制细胞生长。 BT-474 和 MCF7（管腔型）的半数最大有效浓度 (EC₅₀) 值约为 18 μM，MDA-MB-231 和 MDA-MB-468（基底样型）的半数最大有效浓度 (EC₅₀) 值约为 28 μM [1]。
Sepin-1 处理降低了所有四种乳腺癌细胞系中的分离酶蛋白水平，与三阴性乳腺癌细胞系相比，BT-474 和 MCF7 细胞中的分离酶蛋白水平降低更为显著 [1]。
在采用 MDA-MB-231 和 MDA-MB-468 细胞进行的 Transwell 迁移实验中，Sepin-1 以剂量依赖的方式显著抑制细胞迁移 [1]。
在采用 MDA-MB-468 细胞进行的伤口愈合实验中，Sepin-1 显著降低了伤口愈合，最早在治疗后 24 小时即可观察到 [1]。 TUNEL 检测结果显示，40 μM Sepin-1 处理后，BT-474 和 MCF7 细胞系中约 40% 的细胞呈 TUNEL 阳性，显著高于对照组或 20 μM 处理组的 <10%。相比之下，在 40 μM Sepin-1 处理的 MDA-MB-231 和 MDA-MB-468 细胞中，TUNEL 阳性细胞很少见 [1]。
虽然 Sepin-1 处理以浓度依赖的方式增加了促凋亡调节因子 Bak、Bax 和 Bid 的水平（RPPA 数据），但与阳性对照依托泊苷不同，它并未导致 caspase 3 和 7 的激活或 PARP 的裂解（产生 85 kDa 片段）。这表明Sepin-1诱导的生长抑制并非通过经典的细胞凋亡途径[1]。
Sepin-1处理降低了乳腺癌细胞中FoxM1的mRNA（qPCR）和蛋白（RPPA、Western blot）表达水平[1]。
Sepin-1抑制了Raf激酶家族成员A-Raf、B-Raf和C-Raf的表达，这已通过qPCR（针对A-Raf）和Western blot得到证实[1]。
Sepin-1降低了参与细胞周期进程和增殖的FoxM1靶基因的蛋白水平，包括Plk1、Cdk1、Aurora A、pericentrin和Lamin B1，这已通过RPPA和Western blot分析得到证实[1]。

在小鼠中，sepin-1（10 mg/kg；静脉注射；每日一次，每周五天，持续三周）表现出抗肿瘤作用[2]。

细胞增殖实验。降低FoxM1蛋白和mRNA的表达水平[1]。[1]
细胞类型： BT-474、MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞
测试浓度： 0-64 µM
孵育时间： 3天
实验结果： 抑制细胞生长，EC50值分别为18.03、17.66、27.33和27.92 µM，适用于BT-474、MCF7、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型：BT-474、MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468 细胞
测试浓度：0、10、20、40 µM
孵育时间：24 小时
实验结果：FoxM1 蛋白表达随剂量增加而降低，并以依赖性方式降低 A-Raf、B-Raf 和 C-Raf 的表达。

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细胞活力检测：将细胞（BT-474、MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-468）接种于 96 孔板（每孔 100 μL 培养基），孵育 24 小时。然后，向每个孔中加入 50 μL 含有不同浓度 Sepin-1 的培养基或仅含培养基的培养基。孵育 3 天后，向每个孔中加入 20 μL CellTiter-Blue® 试剂。孵育 6 小时后，使用酶标仪（激发波长 560 nm，发射波长 590 nm）测量荧光强度 (FI)。不含细胞的孔作为背景，未用 Sepin-1 处理的孔作为阳性对照。细胞活力 (%) 计算公式为 100 × ((Sepin-1 处理组荧光强度 - 背景荧光强度) / (阳性组荧光强度 - 背景荧光强度))。每组处理均进行三次重复，并在三个独立的实验中重复进行 [1]。
细胞迁移实验（Transwell）：将细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468）消化后，以 1 × 10⁵ 个细胞/mL 的浓度悬浮于无血清培养基中。将100 μL细胞悬液接种于24孔Transwell®小室的滤膜上，并在37°C孵育10分钟以使细胞沉降。在下室加入600 μL含或不含Sepin-1的培养基。37°C孵育24小时后，用棉签去除滤膜上未迁移的细胞。滤膜下侧的细胞用4%戊二醛固定，并用0.2%结晶紫染色。使用倒置显微镜在每个滤膜的五个随机视野中计数迁移细胞。该实验重复三次[1]。
伤口愈合实验：将MDA-MB-468细胞以每孔2 x 10⁵个细胞的密度接种于12孔板中，并孵育24小时。使用 200 μL 移液器吸头在每个孔中划出一条直线伤口。吸出培养基以去除碎片，并更换为含有或不含 Sepin-1 的培养基。分别在划伤后 0、24、48 和 72 小时拍摄图像。使用标尺测量伤口间隙距离，并计算伤口愈合百分比。该实验重复三次 [1]。
TUNEL 检测：将细胞接种于 6 孔板中，并用 0、20 或 40 μM Sepin-1 处理 24 小时。然后将细胞分离并离心涂片。根据制造商的方案，使用 DeadEnd 荧光 TUNEL 系统对涂片上的细胞进行固定、透化和标记。在荧光显微镜下观察涂片。在每个实验条件下随机选取七个视野计数TUNEL阳性细胞，并计算其百分比[1]。
反相蛋白芯片（RPPA）：细胞用Sepin-1处理24小时。制备全细胞裂解液，并送至MD安德森癌症中心的RPPA核心实验室进行蛋白表达水平分析[1]。
蛋白质印迹分析：细胞用Sepin-1处理24小时。制备蛋白裂解液，经凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜。用特异性一抗（例如，抗Separase、抗FoxM1、抗Rafs、抗Plk1、抗Cdk1、抗Aurora A、抗pericentrin、抗Lamin B1、抗caspase 3、抗caspase 7、抗PARP）和相应的二抗进行膜孵育。蛋白质条带被可视化并进行分析[1]。
定量PCR (qPCR) 分析：将细胞接种于10 cm培养皿中，并用不同浓度的Sepin-1处理24小时。使用RNeasy Plus Mini试剂盒提取总RNA。使用RT² First Strand试剂盒合成cDNA。使用RT² SYBR Green ROX qPCR Mastermix进行qPCR。分析并标准化基因表达水平（例如，FoxM1、A-Raf）[1]。

动物/疾病模型： SCID 米色小鼠（MCF7 异种移植）[2]
剂量： 10 mg/kg
给药途径： 静脉注射；每日一次，每周 5 天，持续 3 周
实验结果： 抑制肿瘤生长。

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[1]. Separase Inhibitor Sepin-1 Inhibits Foxm1 Expression and Breast Cancer Cell Growth. J Cancer Sci Ther. 2018;10(3):517.

[2]. Identification and Characterization of Separase Inhibitors (Sepins) for Cancer Therapy. J Biomol Screen. 2014 Jul;19(6):878-89.

Sepin-1 是一种小分子，被鉴定为分离酶（Separase）的强效非竞争性抑制剂。分离酶是一种蛋白酶，负责解开姐妹染色单体黏连，并在多种癌症中过度表达[1]。Sepin-1 在乳腺癌细胞中的抗增殖作用被认为是通过抑制细胞增殖而非凋亡来实现的[1]。其机制可能涉及 Sepin-1 诱导的 Raf 激酶家族成员（A-Raf、B-Raf 和 C-Raf）的下调。这可能减弱 Raf-Mek-Erk 信号级联，该级联负责磷酸化和激活 FoxM1。 FoxM1活性降低会通过正反馈环路减少自身基因及其靶基因（Plk1、Cdk1、Aurora A、Lamin B1、pericentrin）的表达，最终导致细胞周期抑制和生长停滞[1]。
研究发现，乳腺癌细胞系对Sepin-1的敏感性存在差异（管腔型与基底样型），管腔型细胞系（BT-474、MCF7）的EC₅₀值较低，且DNA损伤（TUNEL阳性）较基底样细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468）更为显著[1]。

C9H9N3O4

223.19

223.059

163126-81-6

2736269

Brown to reddish brown solid powder

1

92.2

0

5

0

16

338

0

CC1(N(C2=C([N+]1=O)C=CC(=C2)[N+](=O)[O-])[O-])C

YLVSVJDCTDBERH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C9H9N3O4/c1-9(2)10(13)7-4-3-6(12(15)16)5-8(7)11(9)14/h3-5H,1-2H3

2,2-dimethyl-5-nitro-3-oxidobenzimidazol-1-ium 1-oxide

Sepin-1 Sepin1 Sepin 1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~448.05 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (11.20 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。