SKL2001 free base

别名: SKL2001Wnt Agonist II SKL-2001 SKL 2001 SKL-2001

目录号: V7468 纯度: ≥98%

COA 产品数据产品说明书 SDS

SKL2001 (SKL-2001) 是一种新型、有效的 Wnt/β-catenin 信号通路激动剂，具有抗肿瘤活性。

SKL2001 free base CAS号: 909089-13-0
产品类别: Wnt（beta）-catenin

产品仅用于科学研究，不针对患者销售

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Nature 2025, 643(8070):192-200.

Nature 2024 Dec 18.

Nature 2021, 597(7874):119-125.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

Science Adv 2022: 8, eabm9427.

Nat Neurosci 2024, 27:1468-1474.

Science Adv 2025, 11(33):eadr5199.

Nat Metab 2024, 6: 1108-1127.

Cell Stem Cell 2024, 31:106-126.e13.

Nature 597, 119–125 (2021)

Cell Stem Cell 2020,26(6):845-861.e12.

Science Trans Med 2023,15(701):eadd7872.

STTT 2023,8(1):91.

Cell Reports 2023,42(4):112313

Science Trans Med 2023, 15: eadd7872.

Cancer Cell 2021,39(4):529-547.e7.

Cancer Discov 2022,12(4):1106-1127.

Immunity 2023,56(3):620-634.e11.

Immunity 2024,57:2651-2668.e12.

J Am Chem Soc 2022,144:21831-21836.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

Science Adv 2022:8,eabm9427.

Nature 2021,597(7874):119-125.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

PNAS Nexus 2022,1(3):pgac063.

ACS Nano 2023,17(10):9110-9125.

Biomaterial 2023 Sep16:302:122333.

产品描述
生物活性&实验参考方法
化学信息
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产品描述

SKL2001 (SKL-2001) 是一种新型强效的 Wnt/β-catenin 信号通路激动剂，具有抗肿瘤活性。SKL2001 可破坏 Axin/β-catenin 相互作用，从而稳定细胞内 β-catenin。

SKL2001（5-呋喃-2-基-异恶唑-3-羧酸（3-咪唑-1-基-丙基）酰胺）是一种 Wnt/β-catenin 通路的小分子激活剂，是从 27 万种化合物的筛选中发现的。它通过增加细胞内 β-catenin 蛋白水平并抑制 β-catenin 在 Ser33/37/Thr41 和 Ser45 位点的磷酸化来上调 β-catenin 反应性转录，而不影响 CK1 或 GSK-3β 酶活性。

SKL2001 破坏 Axin/β-catenin 相互作用，导致 β-catenin 稳定。它促进成骨细胞分化，抑制间充质干细胞向脂肪细胞分化。[1]

生物活性&实验参考方法

靶点	Axin (disrupts Axin/β-catenin interaction) [1] β-catenin (stabilizes by inhibiting phosphorylation, no IC50/Ki/EC50 provided) [1] CK1 (no inhibition, no IC50) [1] GSK-3β (no inhibition, no IC50) [1]
体外研究 (In Vitro)	SKL2001虽然对NF-κB、p53报告基因活性或GSK-3β活性没有影响，但它是Wnt/β-catenin通路激动剂，并且可以上调Wnt/β-catenin通路下游靶点Axin2的表达。通过刺激Wnt/β-catenin通路，SKL2001可诱导成骨细胞分化（20和40 μM），并抑制前脂肪细胞分化（5、10和30 μM）。在3T3-L1细胞中，SKL2001（5、10和30 μM）可稳定细胞内β-catenin[1]。SKL2001（40 μM）可显著抑制HCT116球体的增殖，且这种抑制作用是可逆的，与细胞毒性无关。 SKL2001 可诱导 HCT116 球体进入细胞周期阻滞状态。SKL2001 (40 μM) 可增强 E-钙黏蛋白的表达和球体的形成 [2]。在 HEK293 报告细胞中，SKL2001 (10-30 μM) 以剂量依赖的方式上调 TOPflash 报告基因的活性，而不影响 FOPflash 或 NF-κB/p53 报告基因的活性。[1] SKL2001 (10 和 30 μM) 可增加胞质和核内 β-catenin 蛋白水平，而不改变 β-catenin mRNA 水平。 [1] SKL2001（10 和 30 μM）抑制 β-catenin 在 Ser33/37/Thr41 和 Thr41/Ser45 位点的磷酸化（与仅抑制 Ser33/37/Thr41 位点的 LiCl 不同）。[1] SKL2001（浓度高达 10 μM）在体外不影响 GSK-3β 介导的 β-catenin 磷酸化；而 BIO（5 μM）则能有效抑制该磷酸化。[1] 在 10 μM 浓度下，SKL2001 不抑制包括 GSK-3β 在内的一系列重组激酶，而对照抑制剂 Novo 则选择性地抑制 GSK-3β。 [1] SKL2001在GST pull-down实验中破坏了Axin/β-catenin的相互作用，该实验使用纯化的Axin片段（362-500）和GST-β-catenin（20 μM SKL2001与Axin竞争结合β-catenin）。[1] 在HEK293细胞中进行的共免疫沉淀实验表明，SKL2001（40 μM）阻止了Axin与β-catenin的结合。[1] Axin的过表达消除了SKL2001介导的CRT激活和β-catenin稳定。SKL2001无法激活Axin缺失的SNU475细胞中的CRT。 [1]在ST2间充质干细胞中，SKL2001（10-40 μM）呈剂量依赖性地增加TOPflash活性、细胞内β-catenin（胞质和核）水平以及β-catenin的免疫荧光染色强度。[1]SKL2001（10-40 μM）增加ST2细胞和人原代间充质干细胞中的碱性磷酸酶（ALP）活性。[1]SKL2001（10-40 μM）上调ST2细胞中成骨细胞标志物ALP、Runx2和I型胶原的mRNA表达。[1]SKL2001（10-40 μM，处理10天）增加ST2细胞的矿化作用（通过茜素红染色评估）。 [1]在3T3-L1前脂肪细胞中，SKL2001（5-30 μM）抑制了MDI诱导的PPARγ和C/EBPα的表达，并减少了脂滴的积累（油红O染色）。[1]
酶活实验	体外激酶活性测定：将纯化的 GST-β-catenin (100 ng) 与纯化的 GSK-3β 和 CK1 在指定浓度的 SKL2001 或 BIO (5 μM) 存在下孵育。使用抗磷酸化 β-catenin (Ser33/37/Thr41) 抗体进行蛋白质印迹分析；印迹膜用抗 β-catenin 抗体进行复染作为上样对照。[1] 重组激酶活性分析：激酶活性测定采用 Millipore 公司的 KinaseProfiler 试剂盒，并按照制造商的方案进行。使用 10 μM 的 SKL2001 对一系列重组激酶进行活性测定； Novo（1-(4-氨基呋喃-3-基)-5-二烷基氨基甲基-1H-[1,2,3]三唑-4-羧酸）用作选择性GSK-3β抑制剂对照。[1] GST下拉实验：将纯化的β-catenin-GST与40 μM SKL2001混合于含有预平衡谷胱甘肽-琼脂糖4B珠的ADBII缓冲液中，于4°C下轻柔旋转孵育1小时。加入指定量的Axin片段（362-500），于4°C下孵育2小时。离心收集珠子，用PBS洗涤5次，并重悬于LDS上样缓冲液中。通过Western blotting分析β-catenin，通过银染分析Axin。 [1] 银染：将SDS-PAGE凝胶置于固定液（50%甲醇，12%乙酸）中固定90分钟，用50%乙醇洗涤（2×20分钟），在感光液（0.02% Na2S2O3）中孵育1分钟，用水冲洗3次，在硝酸银溶液（1% AgNO3和0.75 ml/l甲醛（37%））中孵育20分钟，用水冲洗2次，在显色液（Na2CO3，0.0004% Na2S2O3，0.5 ml/l甲醛（37%））中显色至条带出现，最后用1%乙酸终止反应。[1]
细胞实验	HEK293报告基因细胞系构建：使用稳定转染hFZ-1表达质粒和TOPflash（β-catenin/Tcf依赖性荧光素酶报告基因）的HEK293细胞进行筛选。对照细胞稳定转染FOPflash（突变型β-catenin/Tcf结合元件）。将细胞以10,000个/孔的密度接种于384孔板中，培养24小时后，加入终浓度为20 μM的化合物。15小时后，检测萤火虫荧光素酶活性。[1] 荧光素酶活性检测：将细胞与TOPflash或FOPflash和pCMV-RL质粒共转染。用SKL2001处理15小时后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。 [1] 蛋白质印迹分析：制备胞质和核组分。蛋白质经4-12%梯度SDS-PAGE电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂牛奶封闭，然后分别与抗β-catenin、抗磷酸化β-catenin（Ser33/37/Thr41）、抗磷酸化β-catenin（Thr41/Ser45）、抗Axin或抗肌动蛋白抗体孵育，最后与HRP标记的二抗孵育，并使用ECL系统显色。[1] 半定量RT-PCR：使用Trizol试剂提取总RNA。进行cDNA合成、逆转录和PCR。扩增的DNA在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，并用溴化乙锭染色。使用的引物包括β-catenin、GAPDH、ALP、Runx2和I型胶原蛋白。 [1] 免疫荧光分析：将培养在玻璃腔室载玻片上的ST2细胞用DMSO或SKL2001处理15小时，用PBS洗涤，用4%甲醛固定，用0.3% Triton X-100透化，用4%牛血清白蛋白封闭1小时，用抗β-catenin抗体染色，并通过共聚焦显微镜进行分析。[1] 碱性磷酸酶（ALP）活性测定：将ST2细胞用载体或SKL2001处理72小时。使用碱性磷酸酶Opt试剂盒测定细胞裂解液中的ALP活性，并以蛋白质含量进行标准化。 [1]茜素红染色：将ST2细胞用指定浓度的SKL2001处理10天，用50%乙醇固定，并用1%茜素红染色。[1]油红O染色：将3T3-L1前脂肪细胞在SKL2001存在下用MDI（地塞米松和胰岛素）诱导分化7天。用PBS冲洗细胞，在4℃下用3.7%多聚甲醛固定1小时，用1%油红O（溶于60%异丙醇）染色10分钟，用60%异丙醇分化，并在相差显微镜下观察。 [1] 免疫沉淀：将HEK293细胞瞬时转染β-catenin和Axin-flag，并用SKL2001（40 μM）处理15小时。取200 μg细胞裂解液，加入1 μg抗体和蛋白A-琼脂糖，在缓冲液A（10 mM HEPES pH 7.4，1.5 mM MgCl2，10 mM KCl，0.5 mM DTT）中于4℃孵育过夜。免疫复合物用PBS洗涤5次，在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸，并通过Western blotting检测。[1]
参考文献	[1]. Small molecule-based disruption of the Axin/β-catenin protein complex regulates mesenchymal stem cell differentiation. ell Res. 2012 Jan;22(1):237-47. [2]. SKL2001 suppresses colon cancer spheroid growth through regulation of the E-cadherin/β-Catenin complex. Biochem Biophys Res Commun. 2017 Nov 25;493(3):1342-1348.
其他信息	Wnt/β-catenin通路激动剂；结构已在第一篇文章中描述。 SKL2001是一种新型Wnt/β-catenin通路小分子激动剂。其作用机制涉及直接破坏Axin/β-catenin蛋白复合物，且不依赖于GSK-3β抑制。分子建模预测SKL2001与β-catenin结合位点与Axin相同，通过与β-catenin的Phe253和Lys292残基相互作用而结合。SKL2001通过阻止Axin与β-catenin结合，抑制CK1和GSK-3β介导的β-catenin在Ser45和Ser33/37/Thr41位点的磷酸化，从而导致β-catenin稳定和核内积累，并随后激活下游靶基因（例如Axin2）。在间充质干细胞中，这会导致成骨细胞生成增加（ALP、Runx2、I型胶原蛋白和矿化作用增强）和脂肪细胞分化抑制（PPARγ、C/EBPα和脂质积累减少）。SKL2001可用作研究涉及Wnt/β-catenin通路生物学过程（例如细胞分化、干细胞更新和组织再生）的可控试剂，并且是治疗与该通路异常调控相关的疾病（例如骨骼疾病）的潜在候选药物。其非活性衍生物SKL11324既不破坏Axin/β-catenin相互作用，也不激活该通路。[1]

*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性

化学信息 & 存储运输条件

分子式	C14H14N4O3
分子量	286.291
精确质量	286.106
元素分析	C, 58.74; H, 4.93; N, 19.57; O, 16.77
CAS号	909089-13-0
PubChem CID	16003447
外观&性状	White to off-white solid powder
密度	1.4±0.1 g/cm3
沸点	595.7±50.0 °C at 760 mmHg
闪点	314.1±30.1 °C
蒸汽压	0.0±1.7 mmHg at 25°C
折射率	1.655
LogP	0.37
tPSA	86.1
氢键供体(HBD)数目	1
氢键受体(HBA)数目	5
可旋转键数目(RBC)	6
重原子数目	21
分子复杂度/Complexity	355
定义原子立体中心数目	0
SMILES	O=C(C1C=C(C2=CC=CO2)ON=1)NCCCN1C=CN=C1
InChi Key	PQXINDBPUDNMPE-UHFFFAOYSA-N
InChi Code	InChI=1S/C14H14N4O3/c19-14(16-4-2-6-18-7-5-15-10-18)11-9-13(21-17-11)12-3-1-8-20-12/h1,3,5,7-10H,2,4,6H2,(H,16,19)
化学名	5-(Furan-2-yl)-N-(3-imidazol-1-ylpropyl)-1,2-oxazole-3-carboxamide
别名	SKL2001Wnt Agonist II SKL-2001 SKL 2001
HS Tariff Code	2934.99.9001
存储方式	Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month
运输条件	Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

溶解度数据

溶解度 (体外实验)	DMSO : ≥ 96.66 mg/mL (~337.63 mM)
溶解度 (体内实验)	配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。配方 2 中的溶解度:* ≥ 2.5 mg/mL (8.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。

溶解度 (体外实验)

DMSO : ≥ 96.66 mg/mL (~337.63 mM)

溶解度 (体内实验)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。

制备储备液		1 mg	5 mg	10 mg
	1 mM	3.4930 mL	17.4648 mL	34.9296 mL
	5 mM	0.6986 mL	3.4930 mL	6.9859 mL
	10 mM	0.3493 mL	1.7465 mL	3.4930 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;

4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。

计算器

质量

浓度

体积

分子量*

计算重置

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度，具体如下：

计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度

参见示例

使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示：
假如化合物的分子量为350.26 g/mol，在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少？

在分子量（MW）框中输入350.26
在“浓度”框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
在“体积”框中输入5，然后选择正确的单位（mL）
单击“计算”按钮
答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式，您可以计算体积和浓度。

浓度 (起始)

体积 (起始)

浓度 (终)

体积 (终)

计算重置

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如，可以输入C1、C2和V2来计算V1，具体如下：

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液？
使用方程式C1V1=C2V2，其中C1=10mM，C2=25μM，V2=25 ml，V1未知：

在C1框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
在C2框中输入25，然后选择正确的单位（μM）
在V2框中输入25，然后选择正确的单位（mL）
单击“计算”按钮
答案62.5μL（0.1 ml）出现在V1框中

分子式

分子量

g/mol

计算重置

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成，具体如下：

注：化学分子式大小写敏感：C12H18N3O4 c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量（分子量）的说明：

要计算化合物的分子量 (摩尔质量)，请输入化学/分子式，然后单击“计算”按钮。

分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义：

分子质量（或分子量）是一种物质的一个分子的质量，用统一的原子质量单位（u）表示。（1u等于碳-12中一个原子质量的1/12）
摩尔质量（摩尔重量）是一摩尔物质的质量，以g/mol表示。

配液体积

质量

配液浓度

计算重置

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
单击“计算”按钮
答案显示在体积框中

动物体内实验配方计算器（澄清溶液）

第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量）

给药剂量 mg/kg

动物平均体重 g

每只动物给药体积 μL

动物数量

第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶/难溶于水的化合物），不同的产品和批次配方组成不同，如对配方有疑问，可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外，请注意这只是一个配方计算器，而不是特定产品的确切配方。

% DMSO

% Tween 80

% ddH₂O

计算重置

计算结果:

工作液浓度： mg/mL；

DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。

体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH₂O，混匀澄清。

注意： (1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

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Identification of SKL2001 as a small-molecule activator of Wnt/β-catenin signaling. (A) Screening of compounds that inhibit Wnt/β-catenin signaling. (B) Chemical structure of SKL2001. (C) Dose-dependent response for CRT activation with increasing concentrations of SKL2001. HEK293 reporter and control cells were incubated with the indicated concentrations of SKL2001 for 15 h and luciferase activity was determined. The results are shown as the average of three experiments; the bars indicate standard deviations. (D) Cytosolic and nuclear proteins were prepared from HEK293 reporter cells treated with either vehicle (DMSO), Wnt3a CM, LiCl (20 mM) or SKL2001 (10 and 30 μM) and were then subjected to western blotting with anti-β-catenin antibody. The blots were reprobed with anti-actin antibody as a loading control. (E) Semi-quantitative RT-PCR for β-catenin, and GAPDH was performed with total RNA prepared from HEK293 reporter cells treated with the vehicle (DMSO) or indicated concentrations of SKL2001 for 15 h.[1].Gwak J, et al. Small molecule-based disruption of the Axin/β-catenin protein complex regulates mesenchymal stem cell differentiation. ell Res. 2012 Jan;22(1):237-47.

SKL2001 inhibits N-terminal β-catenin phosphorylation without affecting GSK-3β activity. (A) HEK293 reporter cells were incubated with either vehicle (DMSO), Wnt3a CM, LiCl (20 mM) or SKL2001 (10 and 30 μM). Cytosolic fractions were prepared and subjected to western blot analysis with anti-phospho-p45/41-β-catenin, anti-phospho-p33/37/41-β-catenin or anti-β-catenin antibody. The same amount of β-catenin was loaded in each lane. (B) SKL2001 does not affect GSK-3β-mediated β-catenin phosphorylation. GST-β-catenin (100 ng) was incubated with purified GSK3β and CK1 at the indicated concentrations of SKL2001 or BIO (5 μM). The samples were analyzed by western blotting with anti-phospho-p33/37/41-β-catenin antibody. The blot was reprobed with anti-β-catenin antibody as a loading control. (C) Recombinant kinase activity at 10 μM of SKL2001 or Novo. Kinase assays were performed as described in Materials and Methods.[1].Gwak J, et al. Small molecule-based disruption of the Axin/β-catenin protein complex regulates mesenchymal stem cell differentiation. ell Res. 2012 Jan;22(1):237-47.

SKL2001 disrupts the Axin/β-catenin interaction. (A) The effect of SKL2001 on Axin expression. Cytosolic proteins were prepared from HEK293 reporter cells treated with either vehicle (DMSO) or the indicated concentrations of SKL2001 and were then subjected to western blotting with anti-Axin and anti-β-catenin antibodies. (B) SKL2001 competes with Axin for binding to β-catenin. The indicated amounts of Axin fragment (362-500) were added to GST-β-catenin (200 ng) with a constant amount of SKL2001 (20 μM) and then pull-down with glutathione-sepharose bead. Unbound proteins were washed away, and the complexes were visualized by silver staining. (C) HEK293 cells were co-transfected with Axin-flag (6 μg) and wild-type β-catenin (18 μg) and then incubated with SKL2001 (40 μM) for 15 h. Whole-cell extracts were immunoprecipitated with the anti-β-catenin antibody. Normal IgG was used as a negative control. The proteins in the β-catenin complex were analyzed by western blotting with anti-β-catenin and anti-flag antibodies. (D) HEK293 cells were transfected with Axin-flag (24 μg) and then incubated with the indicated concentration of SKL2001. Cytosolic proteins were subjected to western blotting with anti-flag and anti-β-catenin antibodies. In A and D, the blots were reprobed with anti-actin antibody as a loading control.[1].Gwak J, et al. Small molecule-based disruption of the Axin/β-catenin protein complex regulates mesenchymal stem cell differentiation. ell Res. 2012 Jan;22(1):237-47.