T56-LIMKi (T5601640)

LIMK2
T56-LIMKi (T5601640) primarily targets LIM kinase 2 (LIMK2) with high specificity, and also inhibits LIMK1 [1]
T56-LIMKi (T5601640) acts as an inhibitor of both LIMK1 and LIMK2, interfering with their kinase activity towards the substrate cofilin [2]

体外活性：T56-LIMKi（也称为 T5601640）是 LIMK2（LIM 激酶 2）的有效选择性抑制剂，在细胞（Panc-1 细胞）测定中 IC50 为 35.2 μM。 T56-LIMKi 以高特异性抑制 LIMK2，并且与 LIMK1 几乎没有或没有交叉反应。 T56-LIMKi 降低磷酸化丝切蛋白 (p-cofilin) 水平，从而抑制多种癌细胞系的生长，包括胰腺癌、神经胶质瘤和神经鞘瘤细胞系。在裸鼠 Panc-1 异种移植模型中，T56-LIMKi 减小了 Panc-1 肿瘤中的肿瘤大小和 p-cofilin 水平。 LIM 激酶是重要的细胞骨架调节剂，在癌症表现和神经元疾病中发挥着重要作用。 LIMK 在多种神经发育障碍以及癌症生长和转移中也发挥着重要作用。因此，T56-LIMKi 有潜力被开发为癌症治疗和神经元疾病的候选药物。激酶测定：T56-LIMKi（也称为 T5601640）是 LIMK2（LIM 激酶 2）的有效选择性抑制剂，在细胞（Panc-1 细胞）测定中 IC50 为 35.2 μM。细胞测定：如前所述，从 NF1+/- 小鼠中制备 NF1 敲除小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)。 MEF、HeLa、Panc-1 和 U-87 细胞在含有 10% 胎牛血清 (FCS)、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/ml 的 Dulbeccos 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中生长链霉素。细胞在 37°C、95% 空气和 5% CO2 的潮湿气氛中孵育。人 NF1 MPNST 细胞系 ST88-14 获自 Nancy Ratner 博士（辛辛那提大学）并维持在 RPMI/15% FCS 中。 A549细胞维持在含有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的营养混合物F-12Ham中。对于生化和蛋白质印迹测定，细胞按每 10 厘米培养皿 5×105 个细胞或每 6 孔板 15×104 个细胞铺板，免疫荧光按每 18 毫米玻璃盖玻片 7500 个细胞铺板。对于生长抑制测定，将细胞按每 24 孔板 5×103 铺板。所有处理方法均在文本或图形图例中指定。

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1. 用50 μM的T56-LIMKi (T5601640)处理稳定表达LIMK2的HeLa细胞2小时，可显著降低磷酸化丝切蛋白（p-cofilin）水平（以β-微管蛋白归一化，P < 0.05，P < 0.01），而对表达LIMK1的HeLa细胞几乎无影响[1]
2. T56-LIMKi (T5601640)以细胞系特异性方式抑制多种癌细胞系（Panc-1、U87、ST88-14）的增殖，处理6天后，对胰腺癌细胞Panc-1的抑制效果最显著（平均值±标准误，n = 9，P < 0.05，P < 0.01），对A549细胞则无明显抑制作用[1]
3. 在NF1敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，T56-LIMKi (T5601640)以剂量依赖的方式降低p-cofilin水平（50 μM浓度下抑制作用显著，P < 0.05，P < 0.01），且该效应会被ROCK抑制剂Y-27632掩盖[1]
4. 在NF1⁻/⁻ MEFs中，T56-LIMKi (T5601640)可剂量依赖性地降低p-cofilin水平（通过蛋白质印迹法检测，以β-微管蛋白归一化，平均值±标准差，n = 3，P < 0.05，P < 0.01），并在处理5天后抑制细胞增殖（平均值±标准误，n = 9，P < 0.01，P < 0.001）[2]
5. T56-LIMKi (T5601640)可诱导NF1⁻/⁻ MEFs中的肌动蛋白应力纤维解聚，具有应力纤维的细胞比例显著降低（平均值±标准差，n = 3张玻片，P < 0.05，P < 0.01）[2]
6. 该抑制剂在划痕实验中可阻断NF1⁻/⁻ MEFs的迁移，与对照组相比，划痕间隙宽度的保留率显著升高（平均值±标准差，n = 9，P < 0.05）[2]
7. T56-LIMKi (T5601640)在软琼脂实验中可抑制NF1⁻/⁻ MEFs的锚定非依赖性集落形成，培养14天后集落数量显著减少（平均值±标准差，n = 5，P < 0.001）[2]
8. T56-LIMKi (T5601640)与salirasib（FTS）联合处理对NF1⁻/⁻ MEFs的增殖和应力纤维形成具有协同抑制作用[2]

T56-LIMKi 在体内抑制 cofilin 磷酸化和 Panc-1 肿瘤缩小。与对照组相比，用 T56-LIMKi (60 mg/kg) 治疗的小鼠肿瘤体积显着减小。裸 CD1-Nu 小鼠（6 周龄）被安置在屏障设施中，光照/黑暗周期为 12 小时。食物和水随意供应。第 0 天，将溶于 0.1 ml PBS 的 5 × 106 Panc-1 细胞植入皮下 (sc)，位于右股骨关节上方。用卡尺测量Sc肿瘤，并且每4-5天记录一次动物体重。使用公式计算肿瘤体积：[长×宽]×[(长+宽)/2]。当肿瘤体积达到 0.06−0.07 cm3（治疗第 0 天）时，将小鼠随机分为三组。对照小鼠用 CMC（载体）喂养，T56-LIMKi 治疗的小鼠每天接受 30 或 60 mg/kg 的 T56-LIMKi（通过口服 0.1 ml 含 0.5% w/v CMC）称重，然后在裂解缓冲液中匀浆（10% w/v），如前所述。通过 SDS-PAGE 测定每种裂解物样品（60 μg 蛋白质）中 p-肌动蛋白丝切蛋白、肌动蛋白丝动蛋白和 β-微管蛋白的总量，然后用特异性抗体进行免疫印迹。所有动物程序均符合国际法律和政策。

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1. 在裸鼠Panc-1异种移植瘤模型中，口服给予60 mg/kg的T56-LIMKi (T5601640)，持续35天可显著降低肿瘤体积（平均值±标准误，n=8，P < 0.05），处理组的肿瘤重量也低于溶媒对照组[1]
2. T56-LIMKi (T5601640)可降低Panc-1移植瘤中的p-cofilin水平（以总cofilin归一化，平均值±标准误，n=8，P < 0.05），证实其在体内可与靶点结合并发挥作用[1]
3. 接受T56-LIMKi (T5601640)处理的小鼠体重未出现显著变化，表明该药物在测试剂量下具有良好的耐受性[1]

T56-LIMKi（也称为 T5601640）是一种强大且集中的 LIMK2（LIM 激酶 2）抑制剂，在使用 Panc-1 细胞的细胞测定中表现出 35.2 μM 的 IC50。

T56-LIMKi 在体内可引起 Panc-1 肿瘤缩小和 cofilin 磷酸化抑制。使用 T56-LIMKi (60 mg/kg) 治疗的小鼠的肿瘤体积显着低于对照小鼠[1]。

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1. HeLa细胞p-cofilin分析实验：将稳定表达LIMK1、LIMK2或空载体（pcDNA3）的HeLa细胞血清饥饿24小时，再用50 μM的T56-LIMKi (T5601640)处理2小时。制备细胞裂解液，通过蛋白质印迹法定量p-cofilin、总cofilin和β-微管蛋白的水平，结果以β-微管蛋白归一化并表示为未处理对照组的百分比（平均值±标准差，n = 3）[1]
2. 癌细胞增殖实验：将Panc-1、A549、U87和ST88-14细胞接种于培养板，用不同浓度的T56-LIMKi (T5601640)或0.1% DMSO（对照）处理。培养6天后直接计数细胞以评估增殖情况，数据以平均值±标准误呈现（n = 9）[1]
3. NF1敲除MEFs的p-cofilin及ROCK抑制剂实验：将NF1敲除的MEFs血清饥饿24小时，用不同浓度的Y-27632处理24小时，随后在含10%胎牛血清的培养基中加入50 μM T56-LIMKi (T5601640)处理2小时。通过蛋白质印迹法分析细胞裂解液中的p-cofilin水平，以β-微管蛋白归一化（平均值±标准差，n = 3）[1]
4. NF1⁻/⁻ MEFs增殖实验：将NF1⁻/⁻ MEFs接种并与不同浓度的T56-LIMKi (T5601640)或对照共同培养5天，计数细胞并绘制抑制曲线（平均值±标准误，n = 9）[2]
5. 肌动蛋白应力纤维染色实验：将NF1⁻/⁻ MEFs接种于6孔板（2.5×10⁴细胞/孔），血清饥饿（0.5%胎牛血清）后用T56-LIMKi (T5601640)处理24小时。固定并透化细胞后，用罗丹明-鬼笔环肽染色，在每张玻片上计数100个细胞中具有应力纤维的细胞比例（平均值±标准差，n = 3）[2]
6. 划痕迁移实验：将野生型和NF1⁻/⁻ MEFs接种于35 mm培养皿（1.5×10⁵细胞/皿），血清饥饿（0.5%胎牛血清）后用50 μM T56-LIMKi (T5601640)或对照处理。制作划痕并在不同时间点测量间隙宽度，数据以初始间隙宽度的百分比表示（平均值±标准差，n = 9）[2]
7. 软琼脂集落形成实验：将NF1⁻/⁻ MEFs接种于含不同浓度T56-LIMKi (T5601640)的软琼脂中，培养14天后对集落进行染色和计数，结果以平均值±标准差呈现（n = 5）[2]

小鼠：将T56-LIMKi溶解于0.5%羧甲基纤维素溶液中。将Panc-1异种移植瘤注射到小鼠体内。7天后开始治疗。对照组小鼠仅灌胃给予溶剂（0.5% CMC），而两个实验组小鼠每日口服给予无毒剂量的T56-LIMKi（30或60 mg/kg）[1]。

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1. Panc-1异种移植瘤模型：将Panc-1胰腺癌细胞皮下植入裸鼠右侧腹部。肿瘤形成后，将小鼠分为治疗组（n=8），并以60 mg/kg的剂量通过未指明的途径（暗示为口服）给予T56-LIMKi (T5601640)，持续35天。定期测量肿瘤体积并记录体重以评估毒性。治疗后，切除肿瘤，称重并拍照；制备肿瘤裂解液，用于通过蛋白质印迹法分析p-cofilin [1]

1. 在裸鼠中，以 60 mg/kg 的剂量连续给药 35 天，T56-LIMKi (T5601640) 耐受性良好，治疗期间未观察到体重发生显著变化 [1]

[1]. Novel LIMK2 Inhibitor Blocks Panc-1 Tumor Growth in a mouse xenograft model. Oncoscience. 2014 Jan 1;1(1):39-48. eCollection 2014.

[2]. Computer-based identification of a novel LIMK1/2 inhibitor that synergizes with salirasib to destabilize the actin cytoskeleton. Oncotarget. 2012 Jun;3(6):629-39.

1. T56-LIMKi (T5601640)是通过计算分子建模（基于EphA3和LIMK2活性位点之间的结构相似性）和经典生物化学技术相结合的方法鉴定的[1][2]
2. 该抑制剂通过阻断LIMK2介导的cofilin磷酸化发挥作用，从而激活cofilin并随后重塑肌动蛋白细胞骨架，进而抑制癌细胞增殖、迁移和肿瘤生长[1]
3. T56-LIMKi (T5601640)对LIMK2的特异性远高于LIMK1，使其成为研究LIMK2在癌症和神经系统疾病中特异性功能的宝贵工具[1]
4. T56-LIMKi (T5601640)与salirasib（一种Ras抑制剂）联合用药该药物对NF1缺陷细胞中的肌动蛋白细胞骨架不稳定和细胞增殖抑制具有协同作用，提示其在神经纤维瘤病和癌症的联合治疗中具有潜在应用价值[2]

C19H14F3N3O3

389.33

389.098

C, 58.62; H, 3.62; F, 14.64; N, 10.79; O, 12.33

924473-59-6

9438169

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

403.4±45.0 °C at 760 mmHg

197.8±28.7 °C

0.0±0.9 mmHg at 25°C

1.618

2.85

84.2

2

7

4

28

572

0

O=C(C1=CC(C)=NO1)NC1C=C(C(NC2C=C(C(F)(F)F)C=CC=2)=O)C=CC=1

XVOKFRPKSAWELK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H14F3N3O3/c1-11-8-16(28-25-11)18(27)24-14-6-2-4-12(9-14)17(26)23-15-7-3-5-13(10-15)19(20,21)22/h2-10H,1H3,(H,23,26)(H,24,27)

3-methyl-N-[3-[[3-(trifluoromethyl)phenyl]carbamoyl]phenyl]-1,2-oxazole-5-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO:≥ 40 mg/mL
Water:
Ethanol:

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。