Benvitimod (Tapinarof)   中文名称: 苯烯莫德；本维莫德

Tapinarof 直接结合 AhR 途径来启动它。 AhR 核易位是由 Tapinarof 在永生化角质形成细胞 (HaCaT) 中剂量依赖性诱导的 (EC50=0.16 nM)[1]。

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1. AhR激活与转录调控：苯维莫德（Benvitimod，Tapinarof）以剂量依赖性方式特异性激活芳香烃受体（AhR）。在转染AhR依赖性荧光素酶报告质粒的HEK293细胞中，其诱导荧光素酶活性的EC₅₀为0.12 μM，与AhR激动剂TCDD（EC₅₀ = 0.001 μM）相当。在人角质形成细胞（HaCaT细胞）和小鼠巨噬细胞（RAW264.7）中，它以剂量依赖性方式上调AhR靶基因（CYP1A1、CYP1B1、AhRR），在HaCaT细胞中CYP1A1 mRNA诱导的EC₅₀为0.08 μM[1]
2. 抑制促炎细胞因子产生：在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中，苯维莫德（0.1-10 μM）以剂量依赖性方式抑制促炎细胞因子分泌。10 μM剂量时，ELISA检测显示TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平分别降低78%、82%、75%，qPCR检测显示其mRNA表达分别下调85%、88%、80%；Griess法检测显示一氧化氮（NO）产生减少70%，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（COX-2）的mRNA及蛋白表达均下调[1]
3. 调节角质形成细胞功能：苯维莫德（0.01-1 μM）以剂量依赖性方式抑制HaCaT角质形成细胞增殖（MTT法检测IC₅₀ = 0.8 μM），并在TNF-α/IFN-γ刺激的HaCaT细胞中降低促炎介质（IL-8、CXCL1、CCL20）的表达。同时，它上调分化标志物（ involucrin、filaggrin）和抗炎基因（IL-10、TGF-β1）在角质形成细胞中的表达[1]
4. 调控T细胞反应：在抗CD3/CD28抗体刺激的人外周血单核细胞（PBMCs）中，苯维莫德（0.1-10 μM）以剂量依赖性方式抑制Th1型（IFN-γ）和Th17型（IL-17A）细胞因子分泌（10 μM剂量时分别抑制65%和70%），并促进Th2型（IL-4）和调节性T细胞（Treg）相关细胞因子IL-10的产生（10 μM剂量时分别升高2.3倍和2.8倍）[1]

在接受 IMQ 治疗的小鼠中，tapinarof 通过 AhR 发挥作用来减轻炎症。在 C57Bl/6 背景中，AhR 充足的小鼠在用 6-甲酰基吲哚(3,2-b)咔唑 (FICZ) 或 Tapinarof 治疗后表现出较低的临床评分。相反，Tapinarof 的抗炎作用对 AhR KO 小鼠影响不大。这些实验使用 FICZ 作为比较，结果相似：野生型小鼠（而非 AhR KO 小鼠）的炎症反应明显较低[1]。

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1. 咪喹莫特（IMQ）诱导的银屑病样皮炎小鼠模型疗效：C57BL/6小鼠背部皮肤连续7天局部涂抹5% IMQ乳膏诱导银屑病样病变，同时每日一次局部涂抹苯维莫德乳膏（0.1%、0.3%、1%），连续7天，呈剂量依赖性改善皮肤炎症：（1）银屑病面积和严重程度指数（PASI）评分较溶媒组分别降低35%（0.1%）、58%（0.3%）、76%（1%）；（2）组织病理学分析显示表皮增生减轻（1%剂量时厚度减少68%），角化不全改善，炎症细胞浸润（CD4⁺ T细胞、中性粒细胞）减少；（3）皮肤匀浆中促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-17A、IFN-γ）和趋化因子（CXCL1、CCL20）的mRNA表达在1%剂量时降低50%-80%[1]
2. 人源化银屑病小鼠模型疗效：移植人PBMCs的NSG小鼠经IMQ诱导银屑病样皮炎后，局部涂抹苯维莫德1%乳膏，每日一次，连续7天，显著降低皮肤匀浆中人特异性促炎细胞因子（人TNF-α、IL-17A）水平，改善表皮增生，证实跨物种疗效[1]
3. 斑块状银屑病患者临床疗效：一项2a期临床试验纳入20例轻中度斑块状银屑病患者，局部涂抹苯维莫德1%乳膏，每日两次，连续12周，结果显示：（1）70%患者达到PASI 50（PASI评分降低≥50%）；（2）45%患者达到PASI 75；（3）皮肤红斑、鳞屑、厚度改善；（4）皮损组织中TNF-α、IL-17A、CXCL1的表达降低（免疫组织化学和qPCR检测）[1]

Kinetic binding experiments (fluorescence-based assay)/动力学结合实验（基于荧光的测定）[1]
使用BioTek Synergy 4微孔板读取器（310nm激发/400nm发射）在黑色96孔板中监测100nM化合物的固有荧光信号。将浓度增加的人或小鼠AHR-ARNT蛋白复合物与在20mM Tris（pH 8.0）、400mM NaCl缓冲液中的100nM化合物混合。通过拟合GraphPad Prism 6中的曲线来测量荧光并计算Kd值。

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1. AhR依赖性荧光素酶报告基因测定：将含AhR反应元件（ARE）-荧光素酶基因的质粒与人AhR表达质粒共转染HEK293细胞，96孔板接种转染细胞（1×10⁴个细胞/孔），过夜孵育。用系列稀释的苯维莫德（0.001-10 μM）或TCDD（阳性对照）处理细胞24小时，裂解细胞后 luminometer检测荧光素酶活性，以溶媒组为对照计算相对活性，绘制浓度-活性曲线并计算EC₅₀值[1]
2. AhR核移位测定：盖玻片上接种HaCaT细胞（5×10³个细胞/盖玻片），过夜孵育后用苯维莫德（0.1 μM）或溶媒处理2小时。4%多聚甲醛固定细胞，0.1% Triton X-100透化，5% BSA封闭，抗AhR一抗4°C孵育过夜，Alexa Fluor标记二抗孵育，DAPI染核。共聚焦显微镜观察AhR定位（胞质vs核），定量核内AhR阳性细胞比例[1]

HaCaT 细胞（10,000 个细胞/孔）在 96 孔 Greiner μCLEAR 板中的 100 μL DMEM 中与 HEPES、Glutamax 和 10% 胎牛血清一起培养至汇合。将培养基替换为含有 0.2% 热灭活、木炭剥离胎牛血清的 100 μL 培养基，并孵育过夜。添加滴定浓度的 Tapinarof（10-8 μM、10-6 μM、10-4 μM、0.01 μM 和 1 μM）30 分钟，然后在冰冷的甲醇:丙酮 (50:50) 中洗涤和固定。样品用 3% BSA 封闭 1 小时，然后在含有 0.1% Tween-20 的磷酸盐缓冲盐水中再次洗涤。接下来，使用 50 μL 1:50 稀释的 3% BSA 抗 AhR 抗体对细胞进行染色，然后使用 50 μL 3% BSA 中的二抗（1:500 稀释的鸡抗兔 AlexaFluor488 和 1:2,000 稀释的 Hoechst 33342）进行染色/磷酸盐缓冲溶液。图像在 InCell 2000 和/或 Opera 上采集。使用 InCell 分析仪工作站和/或 Columbus[1] 进行图像分析。

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1. 巨噬细胞细胞因子分泌测定：24孔板接种RAW264.7巨噬细胞（1×10⁶个细胞/孔），过夜孵育后用苯维莫德（0.1-10 μM）预处理1小时，再用1 μg/mL LPS刺激24小时。收集上清液ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1β水平，Griess法检测NO；提取细胞总RNA，qPCR分析iNOS、COX-2及细胞因子mRNA表达（GAPDH为内参）[1]
2. 角质形成细胞增殖与分化测定：增殖实验：96孔板接种HaCaT细胞（5×10³个细胞/孔），苯维莫德（0.01-10 μM）处理72小时，MTT法检测活力；分化实验：6孔板接种HaCaT细胞（1×10⁵个细胞/孔），0.1-1 μM药物处理48小时，提取总蛋白，Western blot检测involucrin、filaggrin及微管蛋白（内参）[1]
3. T细胞细胞因子产生测定：Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离健康供者PBMCs，24孔板接种（2×10⁶个细胞/孔），抗CD3/CD28抗体包被磁珠（细胞:磁珠=1:1）激活，同时加入苯维莫德（0.1-10 μM），孵育72小时后收集上清液，多重ELISA检测IFN-γ、IL-17A、IL-4、IL-10水平[1]

吸收、分布和排泄
重复局部应用未观察到药物蓄积。68%的药代动力学样本中，他匹那罗夫的血浆浓度低于检测方法的定量限（BQL）（定量下限为50 pg/mL）。在第1天，21名中重度斑块状银屑病患者平均每日使用5.23 g，平均受累体表面积为27.2%（范围21%至46%），其Cmax和AUC0-last的平均值±标准差分别为0.90±1.4 ng/mL和4.1±6.3 ng·h/mL。第 29 天，平均 ± 标准差 Cmax 和 AUC0-last 分别为 0.12 ± 0.15 ng/mL 和 0.61 ± 0.65 ng·h/mL。
他匹那罗的稳态分布容积 (Vss) 估计为 1270 至 1500 mL/kg。

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代谢/代谢物
他匹那罗在肝脏中通过多种途径代谢，包括体外氧化、葡萄糖醛酸化和硫酸化。CYP1A2 和 CYP3A4 似乎是参与他匹那罗肝脏代谢的主要酶，而 CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6 的作用较小。

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生物半衰期
由于缺乏消除相数据，无法确定他匹那罗的末端半衰期。

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1. 皮肤吸收全身暴露：在小鼠背部皮肤局部涂抹1% Benvitimod乳膏（25 mg/cm²）后，经皮吸收率较低：24小时后皮肤浓度为12.8 μg/g，而血浆浓度低于0.05 μg/mL（低于检测限）。在人体临床试验中，每日两次局部涂抹1%乳膏，持续12周，血浆浓度低于0.1 ng/mL，表明全身暴露量极低[1]
2. 皮肤代谢：在人皮肤外植体培养中，Benvitimod通过羟基化代谢为两种次要代谢物（M1和M2），24小时后母体药物仍为主要成分（占总药物相关物质的85%）[1]

妊娠期和哺乳期影响
◉ 哺乳期用药概述
尚未对哺乳期妇女使用他匹那罗进行研究。由于局部用药后吸收不良，因此对哺乳婴儿的风险较低。请勿将他匹那罗直接涂抹于乳头和乳晕，并确保婴儿的皮肤不会直接接触已治疗的皮肤区域。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对泌乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

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蛋白结合
他匹那罗在体外的人血浆蛋白结合率约为 99%。

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1. 局部皮肤耐受性：在小鼠和人体临床试验中，局部应用Benvitimod（0.1%-1% 乳膏）显示出良好的局部耐受性。在小鼠中未观察到明显的皮肤刺激（红斑、水肿、瘙痒）。在患者中，轻微且短暂的不良事件包括局部瘙痒（15%）、干燥（10%）和红斑（5%），这些不良事件无需中断治疗即可消退[1]
2. 全身毒性：在小鼠中进行了为期 28 天的重复局部毒性研究（1% 乳膏，每日一次），未观察到体重、食物摄入量或器官重量（肝脏、肾脏、脾脏）的变化。血清ALT、AST、BUN和肌酐水平均在正常范围内，主要器官的组织病理学检查未发现药物相关病变[1]
3. 遗传毒性：Benvitimod在Ames试验、体外染色体畸变试验和体内微核试验中均为阴性，表明其无遗传毒性[1]
4. 血浆蛋白结合率：体外人血浆蛋白结合率为89-92%（浓度范围：0.1-10 μg/mL）[1]

[1]. Tapinarof Is a Natural AhR Agonist that Resolves Skin Inflammation in Mice and Humans. J Invest Dermatol. 2017 Oct;137(10):2110-2119.

Benvitimod 是一种芪类化合物。
Tapinarof 是一种新型的、首创的小分子芳烃受体激动剂，适用于治疗成人银屑病。它是一种外用乳膏，每日一次涂抹于患处。Tapinarof 最初是在发光杆菌（Photorhabdus luminescens）中发现的代谢产物（3,5-二羟基-4-异丙基芪），发光杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，与异形杆线虫共生。1959 年，人们注意到，含有大量 3,5-二羟基-4-异丙基芪的异形杆线虫死后不会腐烂，这表明其具有潜在的抗炎活性。Tapinarof 于 2022 年获得 FDA 的初步批准。
Tapinarof 是一种芳烃受体激动剂。他匹那罗夫的作用机制是作为芳烃受体激动剂。
据报道，发光杆菌（Photorhabdus luminescens）中含有3,5-二羟基-4-异丙基芪，并有相关数据。

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药物适应症
他匹那罗夫适用于成人斑块状银屑病的局部治疗。

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作用机制
他匹那罗夫是一种治疗性芳烃受体调节剂（TAMA），可与芳烃受体（AhR）结合并激活该受体。AhR是一种配体依赖性转录因子，可调节多种细胞类型（包括巨噬细胞、T细胞、抗原呈递细胞、成纤维细胞和角质形成细胞）中的基因表达。AhR与其配体结合后，会与AhR核转位蛋白（ARNT）形成异二聚体，从而形成对DNA具有高亲和力的复合物。 AhR配体/ARNT复合物可与特定的DNA识别位点结合，从而转录AhR反应基因。此外，AhR还通过其他转录因子发挥作用，例如核因子κB和核因子E2相关因子2 (Nrf2)，后者是AhR诱导转录的下游产物，具有抗氧化特性。AhR失调是银屑病的标志性特征之一，因为银屑病患者的血清AhR浓度高于健康个体。体外AhR配体处理也会导致基因表达谱的改变，而这种改变与银屑病的发病机制密切相关。例如，AhR激活会导致Th17和Th22细胞的扩增和分化，这两种主要的T细胞负责释放炎症细胞因子IL-17和IL-22。此外，AhR激活还会募集持续存在的皮肤驻留记忆T细胞，从而导致银屑病的慢性化。然而，他匹那罗夫与AhR的特异性结合能够调节一组在银屑病中异常表达的独特基因，这与其他AhR配体截然不同。此外，他匹那罗夫还能诱导屏障蛋白的表达，例如丝聚蛋白、角蛋白和包膜蛋白，从而修复皮肤屏障和表皮功能，并降低氧化应激。目前尚不清楚为什么像他匹那罗夫这样的AhR配体在某些情况下能够减轻银屑病炎症，而在另一些情况下却会上调炎症基因。他匹那罗夫作为AhR激动剂的抗炎作用可能与Nrf2有关。虽然Nrf2是已知的AhR下游效应因子，但并非所有AhR激动剂都能激活该通路。例如，AhR激动剂2,3,7,8-四氯二苯并二恶英在激活AhR后并不表现出任何抗氧化活性。因此，我们假设他匹那罗夫的AhR/Nrf2双重作用对其治疗银屑病的疗效至关重要。

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药效学
他匹那罗夫的药效学尚不清楚。

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1. 化学和天然背景：苯维莫德（他匹那罗夫）是一种从紫色色杆菌中分离得到的天然小分子。其化学名称为2-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-5-甲氧基苯酚，分子量为220.26。它是一种黄色结晶性粉末，可溶于DMSO和乙醇，并被制成用于皮肤科的外用乳膏[1]。
2. 作用机制：苯维莫德作为芳烃受体（AhR）的选择性激动剂发挥作用。与AhR结合后，它诱导AhR核转位并与ARNT形成异二聚体，激活AhR靶基因（例如CYP1A1、AhRR）的转录。该过程调节免疫细胞功能，抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-17A）的产生，促进抗炎反应（IL-10、TGF-β），并使角质形成细胞的增殖和分化正常化，从而缓解皮肤炎症[1]
3. 治疗适应症：开发用于治疗斑块状银屑病的局部用药。它已获准用于治疗成人轻度至中度斑块状银屑病，其作用机制是针对潜在的炎症发病机制，而不仅仅是缓解症状[1]
4.临床定位：作为首个用于治疗银屑病的AhR激动剂，Benvitimod为现有疗法（例如皮质类固醇、维生素D类似物）提供了一种替代方案，具有良好的安全性，且无皮肤萎缩（长期使用类固醇的常见副作用）的证据[1]

C17H18O2

254.32362

254.131

C, 80.28; H, 7.13; O, 12.58

79338-84-4

6439522

White to light yellow solid powder

1.158

4.391

40.46

2

2

3

19

280

0

C(/C1C=C(O)C(C(C)C)=C(O)C=1)=C\C1C=CC=CC=1

ZISJNXNHJRQYJO-CMDGGOBGSA-N

InChI=1S/C17H18O2/c1-12(2)17-15(18)10-14(11-16(17)19)9-8-13-6-4-3-5-7-13/h3-12,18-19H,1-2H3/b9-8+

3,5-Dihydroxy-4-isopropylstilbene

GSK-2894512; WB-1001; tapinarof; WBI-1001; WB1001; WBI 1001; GSK 2894512; GSK2894512; 3,5-DH4IS; 3,5-Dihydroxy-4-isopropylstilbene; Vtama

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~393.21 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (9.83 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。