TBA-354

Antitubercular agent

体外抗菌谱和耐药性产生频率。[1]
TBA-354对复制型结核分枝杆菌H37Rv的MIC与delamanid观察到的MIC大致相等，比Pa低约1个数量级（表1）。所有三种硝基咪唑对MBC与MIC相同的复制培养物都具有杀菌作用。在10%胎牛血清或4%BSA（白蛋白的生理等效浓度）存在的情况下，所有化合物对复制结核分枝杆菌的MIC变化最小（表1），在任何情况下都不超过含有0.5%BSA的标准培养基中获得的MIC的3倍。尽管这三种化合物对NR结核分枝杆菌（在低氧条件下测定）的活性略低于对复制型结核分枝杆菌的活性，但三种化合物对抗NR培养物的相对活性与复制型培养物的活性相似，无论这是通过恢复常氧时发光信号的恢复（LORA MIC）还是CFU（LORA MBC）来评估的（表1）。

所有三种化合物对结核分枝杆菌H37Rv等基因菌株的活性均保持不变，这些菌株对结核药物异烟肼（INH）、利福平（RIF）、链霉素（STP）和卡那霉素（KAN）具有耐药性（表2）。对于来自中国的10株药物敏感和耐药临床结核分枝杆菌分离株，TBA-354 MIC低于Pa对每株菌株的MIC。TBA-354在10株受试菌株中的MIC范围为<0.02至0.36μM，Pa为0.38至1.39μM（表3）。尽管在泛敏临床结核分枝杆菌分离株中观察到的TBA-354和Pa的MIC存在差异，但耐药菌株的MIC没有超过泛敏菌株的MIC。

所有三种化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的MIC均>50μM（表4），表明与Pa和delamanid类似，TBA-354是一种窄谱药物。TBA-354和Pa也被评估了对非结核分枝杆菌的活性，它们对牛型分枝杆菌保持了强效活性，但对大多数其他分枝杆菌种类没有。TBA-354对堪萨斯分枝杆菌的活性至少是Pa的7倍（表4）。当接种在含有0.025μM TBA-354的培养基上时，结核分枝杆菌H37Rv对TBA-354产生抗性的自发突变体出现的频率约为3×10−7（范围为2×10-6至1×10-7），这与宾夕法尼亚州观察到的自发突变体产生频率相似。

体内抗小鼠结核病活性。[1]
我们之前报道过，当在感染的急性或慢性阶段每天以100mg/kg的剂量给药，每周7天中的5天，持续3周时，使用低剂量气溶胶感染模型，所有三种硝基咪唑都显示出对小鼠结核病的疗效。如图3a所示，在感染急性期开始治疗时，TBA-354和delamanid在该试验中表现出显著的杀菌活性（P<0.001），与预处理对照组相比，肺部CFU减少了约1log10。两种药物的活性均高于Pa（P<0.001）；与未经治疗的对照组相比，Pa抑制了小鼠肺部结核分枝杆菌的生长，但没有将肺部CFU的数量减少到治疗前的水平以下。当在感染的慢性阶段开始治疗时（图3b），三种硝基咪唑的相对活性与在急性感染期间开始治疗时观察到的活性相似（图3a）。然而，与急性感染模型相比，慢性感染模型中的TBA-354和delamanid显示出更优的杀菌活性，与用这些化合物治疗后的预处理CFU相比，肺CFU明显减少2至3 log10。同样，TBA-354（P=0.007）和delamanid（P=0.018）的活性均高于Pa，但彼此之间没有显著差异（P=0.538）。

为了证实和扩展这些发现，我们使用相同的低剂量气溶胶感染模型，在治疗2、4和8周后测定肺部CFU，评估了TBA-354对慢性小鼠结核病的疗效。在这项研究中，TBA-354显示出对结核分枝杆菌的剂量和时间依赖性杀伤作用。在最低测试剂量（10mg/kg）下，与未经治疗的对照组相比，杀菌活性显著（P<0.001），在该剂量下，TBA-354显示的活性并不显著低于10mg/kg或30mg/kg的delamanid，仅在治疗持续时间为8周时显著低于100mg/kg的delamanid（P=0.033）（图4）。治疗8周后，30mg/kg的TBA-354比30mg/kg的delamanid对CFU的减少更大（P<0.001），这是实验中以相同剂量和相同治疗持续时间给药的两种化合物在疗效上观察到的唯一显著差异。对慢性感染小鼠的TBA-354进行了额外评估，其中未经处理的对照组肺部细菌载量比上述实验低约1log10。TBA-354在最低剂量3mg/kg下，治疗4周后肺CFU显著减少（P<0.001），在该剂量和10mg/kg下观察到的杀伤程度与100mg/kg的delamanid没有显著差异（数据未显示）。最后，在任何这些疗效研究中都没有观察到毒性（通过临床观察和体重监测进行评估）（数据未显示）。

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寻求基于两种或多种新型药物的新方案，以缩短或简化对药物敏感和耐药结核病的治疗。PA-824是一种硝基咪唑并恶嗪，目前正处于II期试验中，单独使用以及与新批准的贝达喹啉或吡嗪酰胺（含或不含莫西沙星）联合使用都显示出显著的早期杀菌活性。虽然PA-824的开发仍在继续，但已经发现一种潜在的下一代衍生物TBA-354的体外效力优于PA-824，代谢稳定性优于临床开发中的其他硝基咪唑衍生物delamanid。在本研究中，我们比较了PA-824和TBA-354作为单一疗法在初始强化和持续治疗阶段的小鼠模型中的活性，以及与贝达喹啉加吡嗪酰胺、舒他固体和/或氯法齐明联合使用的活性。单药治疗研究表明，TBA-354的效力是PA-824的5到10倍，但选定的突变体对PA-824和delamanid具有交叉抗性。联合研究表明，当TBA-354与贝达喹啉联合使用时，其效力是PA-824的2至4倍，当以与PA-824相当的剂量给药时，TBA-354显示出优异的杀菌效果。也许最重要的是，添加硝基咪唑显著提高了贝达喹啉和sutezolid的杀菌活性，无论是否添加吡嗪酰胺，这证实了每种药物在这种潜在的普遍有效的短程方案中的价值[2]。

在有氧和低氧条件下抗结核分枝杆菌的MIC和MBC。[1]
使用结核分枝杆菌H37Rv菌株。[1]
（i） 有氧条件（复制结核分枝杆菌）。[1]
使用微孔板alamarBlue测定法（MABA）测定MIC，如下所示。在37°C下，将培养物与受试化合物一起在96孔板中在200μl 7H12培养基中孵育7天。加入alamarBlue和吐温80，在37°C下继续孵育24小时。荧光分别在530/590nm的激发/发射波长下测定。MIC被定义为与对照组相比，荧光减少90%的最低浓度。

（ii）低氧条件（NR结核分枝杆菌）。[1]
使用低氧回收试验（LORA），MIC定义为化合物的最低浓度，在低氧下暴露于化合物10天后，经过28小时的有氧回收，与未处理的对照组进行比较，发光降低90%。MABA和LORA最小杀菌浓度（MBC）值是试验化合物的最低浓度，与7天（有氧）或10天（低氧）暴露开始时的CFU相比，在7天（需氧）或10天后（低氧）接触后，CFU减少了99%。

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针对结核分枝杆菌H37Rv等基因单耐药菌株的MIC。[1]
如上所述，通过MABA测定对利福平（ATCC 35838）、异烟肼（ATCC 35822）、链霉素（ATCC 35820）和卡那霉素（ATCC 35927）单药耐药的结核分枝杆菌H37Rv同源菌株的MIC。

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活动范围。[1]
牛分枝杆菌（ATCC 19210）、结核分枝杆菌（ATCC 19981）、堪萨斯分枝杆菌（A/C 12478）、吉尔夫分枝杆菌（NMC 43909）、偶然分枝杆菌（VTC 6841）、平凡分枝杆菌（ATSC 23292）和耻垢分枝杆菌（TTC MC2155）在Middlebrook 7H9肉汤中培养，肉汤中含有0.2%（体积/体积）甘油、0.05%吐温80和10%（体积/容量）白蛋白葡萄糖过氧化氢酶（BBL MiddlebrookADC富集，目录号212352）（7H9-ADC-TG）。金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）和大肠杆菌（ATCC 25922）在阳离子调节的Mueller Hinton（CAMH）肉汤中培养，白色念珠菌（ATCC 90028）在RPMI培养基中培养，直至570nm处的吸光度达到0.2至0.5。将培养物在96孔板的新鲜培养基中稀释1:5000至1:10000，并在37°C下与试验化合物一起孵育。耻垢分枝杆菌的孵化时间为3天，其他分枝杆菌为7天，白色念珠菌为36至48小时，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为16至20小时。对于白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，MIC被定义为与未处理的培养物相比，A570中降低≥90%的最低浓度。分枝杆菌的MABA MIC如上所述定义。

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血清/白蛋白对结核分枝杆菌MIC的影响。[1]
为了测试可以减少未结合的活性化合物的蛋白质结合是否改变了TBA-354和Pa的表观活性，在4%牛血清白蛋白（BSA）存在和10%胎牛血清存在的情况下，通过无补充蛋白质的MABA（如上所述）测定了化合物对结核分枝杆菌H37Rv的MIC（26）。请注意，基础培养基含有0.5%的BSA。

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针对耐药和药物敏感结核分枝杆菌临床分离株的MIC。[1]
结核分枝杆菌临床分离株来源于中国国家结核病参考实验室。细菌在Middlebrook 7H9肉汤中培养和测试，肉汤中含有0.2%（体积/体积）甘油、0.05%吐温80和10%（体积/容量）白蛋白葡萄糖过氧化氢酶。MABA MIC的定义如上所述。

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抗性发展的频率。[1]
在50 ml烧瓶中制备了四种结核分枝杆菌H37Rv的复制培养物，每种培养物含有10 ml Middlebrook 7H9肉汤加甘油、卡西酮和油酸白蛋白葡萄糖过氧化氢酶（OADC）补充剂，结核分枝杆菌的初始密度<104 CFU/ml，并通过在含有4×MIC试验化合物的培养基上镀100μl等分试样来监测是否存在预先存在的耐药细菌。然后将培养物在摇动下孵育2至3周，直至A570＞0.9（约2×109 CFU/ml）。从四种培养物中的每一种中，将100μl未稀释和1:10稀释的悬浮液等分试样（分别约为1×109 CFU/ml和1×108 CFU/ml）铺在10块7H11琼脂上，有和没有4×MIC的TBA-354。计算四种培养物的个体突变频率，并选择中值作为代表。

Caco-2细胞的双向渗透性。[1]
Caco-2渗透性测定是基于Hidalgo等人的方法开发的。简而言之，将含有Caco-2细胞的96孔多筛板培养21至25天。在酮康唑（100μM）存在和不存在的情况下，将1和10μM的TBA-354与Caco-2细胞单层在Hanks平衡盐溶液中加HEPES或吗啉乙磺酸（MES）（含储备溶液中终浓度为1%的二甲亚砜[DMSO]）在37°C下孵育40或60分钟。通过从顶端（A）侧和基底外侧（B）侧取等分试样，在两个方向上测量穿过细胞屏障的渗透率。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析TBA-354浓度（见下文“LC-MS/MS分析方法”）。

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血浆蛋白结合[1]
TBA-354与人、猴、狗、大鼠和小鼠血浆蛋白质的结合是用96孔平衡透析装置进行的，该装置具有12000至14000分子量的截留透析膜。将TBA-354以10μM添加到血浆侧，并在37°C下振荡8小时。每个样本都进行了两次评估。如下所述，通过LC-MS/MS测量TBA-354浓度。

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体外代谢。（i）肝微粒体中的代谢。[1]
1μM的TBA-354与大鼠、小鼠、狗、猴子或人肝微粒体（HLM）（0.3 mg/ml）在37°C下在磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中孵育1小时，该缓冲液具有NADPH再生系统（1 mM NADP+，5 mM葡萄糖6-磷酸[G6P]，1 U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶[G-6-PDH]）。HLM来自混合性别群体；所有其他物种都由混合的雄性微粒体组成。通过添加乙腈终止培养后，通过LC-MS/MS（见下文“LC-MS/MS分析方法”）分析每种提取物，以确定TBA-354的剩余浓度。阳性对照（丙咪嗪、普萘洛尔、特非那定和维拉帕米）在所有物种的微粒体培养后显示约30%至100%的损失。为了确定微粒体固有清除率，在NADPH再生系统的存在下，将1μM的TBA-354与人肝微粒体（0.3mg/ml）一起孵育，并在0、15、30、45和60分钟的孵育后测量母体化合物的剩余百分比。在该试验中，阳性对照（特非那定和维拉帕米）显示出较高的微粒体清除率（CLint为124和115 ml/min/mg）。

（ii）肝细胞代谢。[1]
将1μM的TBA-354与小鼠、大鼠、兔、狗、猴或人肝细胞（约1×106个细胞/ml）在37°C下孵育0、0.5、1、2和4小时。根据0.5、1-、2-和4-h孵育与0-h孵育的剩余TBA-354的相对浓度，评估TBA-354在人肝细胞中的代谢稳定性。如果测量到TBA-354的显著损失，则根据一级衰变反应计算肝细胞中TBA-354代谢的半衰期。阳性对照样品的结果表明，制备的肝细胞悬浮液中的酶是活性的。

（iii）重组人CYP的代谢。[1]
通过在NADPH（1 mM）存在下将1μM TBA-354与人重组CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4（0.1 nmol/ml）孵育0、15、30、45和60分钟，确定了TBA-354随时间变化的几种细胞色素P450（CYP）同工酶的代谢情况。

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抑制CYPs。[1]
将10μM的TBA-354（用于单浓度评估）与单个CYP异构体在37°C下在混合的HLM（0.25 mg蛋白质/ml）、磷酸盐缓冲液（100 mM，pH 7.4）、氯化镁（MgCl2）（5 mM）、NADPH（1 mM）和CYP探针底物（在大约Km处）中孵育20至30分钟。CYP探针底物和反应为CYP1A2的非那西丁脱烷基化、CYP2AD6的香豆素7-羟基化、CYP2B6的安非他酮羟基化、CY2C8的紫杉醇6′-羟基化、P42C9的双氯芬酸4′-羟化、CYP2C19的S-美芬妥英4′-羟基化成、CYP2D6的丁咯洛尔1′-羟基化作、CYP2E1的氯唑沙宗6-羟基化成、以及CYP3A4的咪达唑仑1′-羟化成和睾酮6-羟基化成。实验进行了两次。加入乙腈并在4°C下以3000至4000 rpm离心10分钟以去除蛋白质后，通过LC-MS/MS分析上清液中CYP探针代谢物的形成，并估算抑制百分比。为了测定TBA-354对CYP2C8、CYP2C19和CYP3A4（含有咪达唑仑和睾酮两种底物）的50%抑制浓度（IC50），将TBA-354（0.01、0.1、1、10和30μM）与HLM（0.3mg/ml）和NADPH（1mM）一起孵育。在37°C下孵育30分钟后，测量了在试验化合物存在和不存在的情况下CYP特异性底物代谢物的形成。酮康唑被用作CYP3A4抑制的阳性对照。为了评估时间依赖性抑制，在加入探针底物以测量CYP活性之前，将HLM与TBA-354在NADPH存在下预孵育30分钟（预孵育混合物未稀释）。

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CYPs的诱导。[1]
使用在含有2%BSA的培养基中培养的人肝细胞（3个供体）评估了10μM TBA-354诱导CYP酶（CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A）的潜力。用试验化合物处理新鲜铺板的人肝细胞（48孔板中约15万个细胞/孔）72小时。诱导处理后，通过LC-MS/MS测定CYP特异性探针代谢物的形成来测量CYP酶活性。计算CYP酶活力与载体对照相比的倍数。

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LC-MS/MS分析方法。[1]
为了测量体外Caco-2渗透性测定中TBA-354的浓度，使用连接到API 4000质谱仪（AB Sciex）的高效液相色谱（HPLC）20AD泵（岛津）。Phenomenex Luna C18（2）柱（5μm，50乘2 mm）用含有0.1%甲酸的水-乙腈（98:2至2:98，洗脱时间1.7分钟）流动相以0.5 ml/min的流速洗脱。TBA-354在m/z 437至252的转变处通过阳性多反应监测（MRM）模式进行监测。在m/z 214转变为91时监测烟酸苄酯作为内标。在TBA-354的微粒体代谢评估中，使用相同的分析方法来测量剩余的TBA-354。

在血浆蛋白结合试验中，在类似的LC-MS/MS条件下测量了TBA-354浓度。使用连接到Waters Quattro Micro质谱仪的安捷伦HP1100 LC系统。Atlantis C18柱（3μm，10×2.1 mm）用由水和甲醇组成的流动相洗脱，甲醇含有0.1%甲酸和10 mm甲酸铵（洗脱时间为2分钟内100%水对100%甲醇）。TBA-354在正MRM模式下监测，过渡m/z为437.3至252.5。

使用连接到Q-Trap 4000 MS/MS系统的岛津液相色谱仪测量肝细胞代谢培养中TBA-354的浓度。使用Phenomenex Luna C18柱（5.0μm，50×2.0mm）进行分离，并用由含0.1%甲酸的水-乙腈（7分钟内100%水至100%乙腈）组成的流动相以1ml/min的流速洗脱。在阳离子模式下监测TBA-354，转变m/z为437至252。Pa用作在360至175的过渡m/z下监测的内标。CYP抑制和诱导研究中使用了相同的LC-MS/MS系统。

在小鼠PK研究中，使用了Thermo Finnigan LC-TSQ质谱仪系统。在m/z 437.3到252.5的过渡期，用单反应监测（SRM）阳性模式监测TBA-354。检测线性范围为10ng/ml至1000ng/ml。

TBA-354 在小鼠体内的药代动力学研究。[1]
\n本研究采用灌胃法，分别以 3、30 和 100 mg/kg 的剂量，在雌性 BALB/c 小鼠中研究了 TBA-354（溶于 0.5% CMC）的药代动力学。在 48 小时内，每个时间点从三只小鼠采集血浆样本，并使用肝素钠作为抗凝剂。在另一项研究中，小鼠经静脉注射给予 2 mg/kg 的 TBA-354（溶于 40% 羟丙基-β-环糊精和 pH 3 的 50 mM 柠檬酸缓冲液），并在 24 小时内，使用含 EDTA 钾的试管采集血样（0.25 ml，每个时间点采集三个）。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定血浆浓度（见下文“LC-MS/MS分析方法”）。使用WinNonlin Phoenix v6.2软件，基于复合数据进行非房室药代动力学分析。\n

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\n\n小鼠体内疗效。[1]
\n按照先前描述的方法，用低剂量结核分枝杆菌Erdman株气溶胶感染体重约20 g的雌性BALB/c小鼠。该方案可使约50至100个结核杆菌沉积于肺部，随后将肺组织匀浆接种于7H11琼脂平板上，并测定菌落形成单位（CFU），以追踪感染过程。对照组仅用载体处理小鼠。 化合物如TBA-354每周用0.5% (w/v)羧甲基纤维素(CMC)配制成悬浮液，以便通过每日一次灌胃给予200 μl悬浮液来达到目标剂量。每周连续5天，每组6或7只小鼠给药。悬浮液在每日给药间隙储存于4°C。末次给药后3天处死小鼠，以最大程度地减少肺匀浆对培养基的残留。将双肺匀浆化，并用Hanks平衡盐溶液(HBSS)-Tween稀释，取等分试样接种于Middlebrook 7H11培养基上。在37°C培养3周后测定菌落形成单位(CFU)。为进行疗效数据的统计分析，采用Bonferroni法进行两两比较。\n

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\n\n抗菌药物。 [2]
\nINH、RIF、PZA、BDQ、PA-824、PNU 和 CFZ 的制备和配制方法与之前所述相同，但实验 4 中 CFZ 的配制方法与 BDQ 相同，均采用酸化的 20% 羟丙基-β-环糊精溶液。TBA-354 和 delamanid 的配制方法与 PA-824 相同，均采用环糊精胶束 (CM-2) 制剂。\n

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\n\n化疗。[2]
\n在治疗前，小鼠按随机分组方式分配至各实验组。实验 1、3 和 4 的治疗在感染后 13 至 14 天开始，实验 2 的治疗在感染后 42 天开始。治疗采用灌胃法，每日一次，每周 5 天。药物剂量分别为：异烟肼 (INH) 10 mg/kg、利福平 (RIF) 10 mg/kg、吡嗪酰胺 (PZA) 150 mg/kg、贝达喹啉 (BDQ) 25 mg/kg、哌拉西林/他唑巴坦 (PNU) 50 mg/kg 和氯法齐明 (CFZ) 20 mg/kg。\n

\n在实验 1 中，对照组小鼠接受 RIF+INH+PZA 治疗。实验组小鼠单独接受 PA-824 治疗（剂量分别为 10、30、100、300 或 600 mg/kg），或单独接受 TBA-354 或德拉马尼治疗（剂量分别为 3、10、30 或 100 mg/kg）。治疗持续长达 8 周。在实验 2 中，所有小鼠在治疗的前 4 周均接受 RIF+INH+PZA 治疗。之后，阴性对照组不接受任何治疗，阳性对照组接受利福平+异烟肼（RIF+INH）治疗，试验组分别接受50 mg/kg PA-824或10 mg/kg TBA-354单独治疗。总治疗持续时间为12周。\n

\n在实验3中，阳性对照组小鼠接受8周RIF+INH+吡嗪酰胺（PZA）治疗，随后接受最多8周RIF+INH治疗。其余小鼠接受贝伐珠单抗+吡嗪酰胺（BDQ+PZA）或贝伐珠单抗+哌拉西林（BDQ+PNU）治疗，单独或联合50 mg/kg PA-824或10或50 mg/kg TBA-354。在实验4中，小鼠接受贝伐珠单抗+哌嗪酰胺+氯苯那敏（BDQ+PZA+CFZ）或贝伐珠单抗+哌拉西林+哌拉西林（BDQ+PZA+PNU）治疗，单独或联合50 mg/kg PA-824或25或50 mg/kg TBA-354。另一组接受了 BDQ+PZA+CFZ+PNU 治疗。为了与之前的联合用药实验保持一致，在给予 BDQ 和/或 PZA（二者配制在一起）后立即给予 PA-824 和 TBA-354 或 CM-2 载体作为安慰剂。PNU 或 CFZ 在 ≥4 小时后给予。对于 BDQ+PZA+CFZ+PNU 方案，BDQ、PZA 和 CFZ 配制在一起并同时给药，PNU 在 4 小时后给予。在实验 3 中，药物给药持续时间长达 16 周；在实验 4 中，给药持续时间长达 8 周。\n

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\n\n耐药菌株的选择。 [2]在实验 1 中治疗 8 周后，将肺匀浆直接接种于含有浓度分别为 1、0.25 或 0.25 μg/ml 的 PA-824、德拉马尼或 TBA-354 的 7H11 琼脂平板上，以检测耐药突变株。为了评估硝基咪唑类药物之间的交叉耐药性，将来自两个最高剂量组各两只小鼠的耐药菌落刮取混合，并用玻璃珠匀浆。将所得悬浮液静置 30 分钟后，以 10 倍系列稀释法接种于含有 1 μg/ml PA-824 或 0.25 μg/ml 德拉马尼或 TBA-354 的平板上。

ADME 和 PK 特征。(i) ADME 特性的体外评价。[1]
采用体外 Caco-2 细胞双向渗透性试验评估 TBA-354 的吸收潜力及其与 P-糖蛋白 (P-gp) 的相互作用。在该试验中，TBA-354 在 1 μM 和 10 μM 浓度下均表现出高渗透性，表观渗透率 (Papp) 值（从顶端到基底端，即 A 到 B）>10 × 10−6 cm/s（表 5）。在有无 P-gp 抑制剂酮康唑的情况下，渗透率值相似，且在有无酮康唑的情况下，1 μM 和 10 μM TBA-354 的外排比率均 <2。结果表明 TBA-354 不是 P-gp 转运蛋白的底物。地高辛作为P-gp底物阳性对照，其Papp B/A/A/B比值为68倍，酮康唑可将其抑制至1.4倍。TBA-354在10 μM浓度下表现出中等至高的蛋白结合率，在人、猴、犬、大鼠和小鼠血浆中的平均血浆蛋白结合率分别为96.5%、94.6%、96.2%、95.9%和92.6%。本研究的回收率范围为86%至120%。
TBA-354在与肝微粒体、重组细胞色素P450 (CYP) 和肝细胞的体外孵育中代谢稳定或仅发生中等程度的代谢。所测试的CYP酶（CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4）对TBA-354的代谢作用无法检测到。TBA-354在体外微粒体孵育中稳定，在NADPH再生系统存在下，与人、猴、狗、大鼠或小鼠肝微粒体孵育1小时后，未检测到可测量的代谢。TBA-354在六种不同物种的肝细胞中的代谢程度中等（图1）。将1 μM的TBA-354与小鼠、大鼠、兔、狗、猴和人肝细胞孵育4小时后，未代谢的TBA-354仍是主要成分，分别占77.1%、87.7%、98.6%、82.9%、70.7%和54.5%。 TBA-354 在人肝细胞中的估计半衰期为 4.6 小时。与肝细胞孵育后的代谢物鉴定非常重要，并且已列入计划。

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小鼠药代动力学。[1]
在小鼠中进行了药代动力学研究。制剂、小鼠品系和给药途径的选择与小鼠疗效研究中使用的相同。单次口服 3、30 或 100 mg/kg 的 TBA-354 后，血清药物浓度达峰时间 (Tmax) 为 2 至 6 小时，末端半衰期 (t1/2) 相对较长，为 8 至 12 小时（图 2 和表 6）。血清药物最大浓度 (Cmax) 和浓度-时间曲线下面积（AUC0–inf）均随剂量增加而增加，但与剂量增加的线性关系略有不同，AUC0–inf 从 22.7 μg·h/ml 增加至 242 μg·h/ml，Cmax 从 1.6 μg/ml 增加至 12.8 μg/ml。静脉推注 2 mg/kg TBA-354 可评估分布容积并估算绝对生物利用度。比较相似剂量水平和浓度范围（口服 3 mg/kg 和静脉注射 2 mg/kg）下的 AUC0–inf 值表明，小鼠的绝对生物利用度约为 40%。小鼠体内表观分布容积 (Vz/F) 值为 1.61 升/千克，表明 TBA-354 可能分布于体液以外的组织中。

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潜在的药物相互作用。[1]
在人肝微粒体 (HLM) 中评估了 TBA-354 对 CYP2C8、CYP2C19 和 CYP3A4 的直接和时间依赖性抑制作用。TBA-354 对 CYP3A4 催化的睾酮 6-羟基化反应表现出较弱的抑制作用（30 μM 时抑制率为 40%），而未观察到对咪达唑仑 1′-羟基化的抑制作用。TBA-354 未直接抑制其他 CYP；TBA-354 对这些 CYP 的抑制 IC50 值均 >30 μM。在另一项研究中，10 μM TBA-354 对人肝微粒体 (HLM) 中 CYP 酶活性的抑制率分别为：CYP2A6 <10%，CYP1A2 14%，CYP2B6 20%，CYP2C9 33%，CYP2D6 26%，以及 CYP2E1 24%。在 NADPH 存在下，将 TBA-354 与 HLM 预孵育 30 分钟后，CYP3A4 催化的睾酮 6β′-羟基化反应受到抑制，IC50 值为 24 μM，这可能提示 CYP3A4 存在较弱的时间依赖性失活。然而，未观察到 CYP3A4 催化的咪达唑仑 1′-羟基化反应存在时间依赖性抑制。在所测试的三名人类肝细胞供体中，10 μM 的 TBA-354 均未显著诱导 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19 或 CYP3A 的表达（与溶剂对照组相比，诱导倍数小于或接近 2 倍）。在这些实验条件下，TBA-354 对细胞活力没有显著影响。

最后，在所有疗效研究中均未观察到毒性（通过临床观察和体重监测评估）（数据未显示）[1]。
与所有潜在的结核病药物一样，需要了解TBA-354的安全性和毒理学信息以及其临床药代动力学特性，以确定预期达到的临床疗效所需的血浆浓度是否能够实现，以及是否能够安全达到。据报道，德拉马尼可延长QT间期，这已成为多种结核病药物的副作用，使联合用药方案的实施变得复杂。TBA-354的安全性特征及其所有方面都需要结合可能的联合用药进行仔细考虑，以便对该化合物的潜在用途进行恰当的评估。然而，现有数据表明，TBA-354有潜力成为下一代用于治疗结核病的硝基咪唑类药物，应进一步研究以进行更全面的评估。目前正在进行进一步的研究，以评估其在结核病临床前模型中的疗效，以及药代动力学、安全性和毒理学研究。[1]

[1]. In Vitro and In Vivo Activities of the Nitroimidazole TBA-354 against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2015 Jan;59(1):136-44.

[2]. Contribution of the Nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the Activity of Novel Regimens in Murine Models of Tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2015 Jan;59(1):129-35.

TBA-354 是一种小分子药物，目前处于 I 期临床试验阶段，并有 1 项在研适应症。硝基咪唑类药物是一类很有前景的新型抗结核药物。硝基咪唑-噁唑类药物德拉马尼（OPC-67683，商品名 Deltyba）正在进行治疗耐多药结核病的 III 期临床试验，而硝基咪唑-噁嗪类药物 PA-824 也即将进入治疗药物敏感性和耐药性结核病的 III 期临床试验。TBA-354（SN31354[(S)-2-硝基-6-((6-(4-三氟甲氧基)苯基)吡啶-3-基)甲氧基)-6,7-二氢-5H-咪唑并[2,1-b][1,3]噁嗪]）是一种含吡啶的联芳基化合物，在初步啮齿动物研究中显示出对慢性小鼠结核病的卓越疗效和良好的生物利用度。经过广泛的药物化学研究，TBA-354被选为潜在的下一代抗结核硝基咪唑类药物。本文进一步评估了TBA-354的药代动力学特性及其对结核分枝杆菌的活性。TBA-354对复制型和非复制型结核分枝杆菌均具有窄谱杀菌活性，体外实验表明其效力与德拉马尼相似，且高于PA-824。添加血清蛋白或白蛋白不会显著改变其活性。TBA-354对结核分枝杆菌H37Rv同源单耐药菌株以及临床药物敏感和耐药分离株均保持活性。自发耐药突变体的频率为3 × 10⁻⁷。体外和体内（小鼠）研究证实，TBA-354具有高生物利用度和长消除半衰期。体外研究表明，TBA-354发生药物相互作用的风险较低。低剂量气溶胶感染小鼠急性及慢性结核病模型显示，TBA-354 具有时间和剂量依赖性的体内杀菌活性，其效力至少与德拉马尼相当，且优于 PA-824。其优异的效力和预测其适合每日一次口服给药的药代动力学特征表明，TBA-354 值得进一步研究，以期成为下一代硝基咪唑类药物。[1]

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总之，这些实验证实并扩展了先前的研究，证明了含有 BDQ、PNU 和硝基咪唑类药物的新型药物组合具有为普遍有效的短程治疗方案奠定坚实基础的潜力，该方案能够有效治疗结核病，且不受现有药物耐药性的影响。当感染菌株仍对吡嗪酰胺敏感时，加入这种杀菌剂有望进一步缩短疗程。尽管这些方案在小鼠中显著缩短治疗疗程的潜力不能直接推及人类结核病，但本文提出的结果无疑支持未来开展临床试验，以研究这些方案及其他类似方案的疗效。本研究也证实了先前的研究结果，即TBA-354的效力优于PA-824。在单药治疗和联合用药中，这种新一代硝基咪唑类药物在等效剂量下均优于PA-824，包括其对杀菌效果的贡献。后续研究将确定TBA-354是否比PA-824和德拉马尼更有效。未来需要开展临床和临床前研究，以评估能否在安全且耐受性良好的剂量下达到足够的药物暴露量。[2]

C19H15F3N4O5

436.341414690018

436.099

C, 52.30; H, 3.47; F, 13.06; N, 12.84; O, 18.33

1257426-19-9

1257426-19-9;

49836057

White to off-white Solid powder

1.5±0.1 g/cm3

570.0±60.0 °C at 760 mmHg

298.5±32.9 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.623

3.02

104.22

0

10

5

31

614

1

FC(F)(F)OC1=CC=C(C2=CC=C(CO[C@H]3CN4C(OC3)=NC([N+]([O-])=O)=C4)C=N2)C=C1

ZXSGSFMORAILEY-HNNXBMFYSA-N

InChI=1S/C19H15F3N4O5/c20-19(21,22)31-14-4-2-13(3-5-14)16-6-1-12(7-23-16)10-29-15-8-25-9-17(26(27)28)24-18(25)30-11-15/h1-7,9,15H,8,10-11H2/t15-/m0/s1

(S)-2-nitro-6-((6-(4-(trifluoromethoxy)phenyl)pyridin-3-yl)methoxy)-6,7-dihydro-5H-imidazo[2,1-b][1,3]oxazine

TBA-354; TBA 354; TBA-354; 1257426-19-9; 911T37M2WY; UNII-911T37M2WY; ((6S)-6-((6-(4-(Trifluoromethoxy)phenyl)-3-pyridyl)methoxy)-6,7-dihydro-5H-imidazo(2,1-b)(1,3)oxazin-2-yl)azinic acid; (sn31354((S)-2-Nitro-6-((6-(4-trifluoromethoxy)phenyl)pyridine-3-yl)methoxy)-6,7-dihydro-5H-imidazo(2,1-b)(1,3)oxazine)); SN31354; TBA354; SN31354; SN-31354; SN 31354

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~229.18 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.73 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.73 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.73 mM) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 10% DMSO+40% PEG300+5% Tween-80+45% Saline: 2.5 mg/mL (5.73 mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。