Trichostatin A (TSA)   中文名称: 曲古柳菌素A

HDAC ( IC50 = 1.8 nM )
Histone Deacetylases (HDACs) (Class I: HDAC1, HDAC2, HDAC3; Class II: HDAC6, HDAC7) with IC50 values ranging from 10-100 nM (exact subtype-specific IC50 [1]
- Histone Deacetylases (HDACs) (pan-HDAC inhibition, preferential activity against Class I HDACs) with an EC50 of ~30 nM for inhibition of HDAC activity in HeLa nuclear extracts [2]
- Histone Deacetylases (HDACs) (HDAC1, HDAC2, HDAC4) with Ki values of 15 nM, 20 nM, and 50 nM respectively[3]
- Histone Deacetylases (HDACs) (Class I HDACs as primary targets) with IC50 of ~25 nM for HDAC1-mediated histone deacetylation [4]
- Histone Deacetylases (HDACs) (pan-inhibition of Class I/II HDACs, no activity against Class III HDACs/sirtuins) with IC50 of ~18 nM for total HDAC activity in human cancer cell lysates [5]

体外活性：Trichostatin A 抑制八种乳腺癌细胞系的增殖，包括 MCF-7、T-47D、ZR-75-1、BT-474、MDA-MB-231、MDA-MB-453、CAL 51 和SK-BR-3 的平均 IC50 为 124.4 nM（范围为 26.4-308.1 nM），对表达 ERα 的细胞系比对 ERα 阴性细胞系具有更强的效力。 Trichostatin A 在所有乳腺癌细胞系中类似地抑制 HDAC 活性，平均 IC50 为 2.4 nM（范围，0.6-2.6 nM），并导致明显的组蛋白 H4 过度乙酰化。与 Trapoxin (TPX) 和 Chlamydocin 有效抑制 HDAC1 或 HDAC4 但不抑制 HDAC6 不同，Trichostatin A 抑制这些 HDAC 的程度相似，IC50 分别为 6 nM、38 nM 和 8.6 nM。曲古抑菌素 A (100 ng/mL) 处理通过将 p300 和 PCAF 募集到结合 DNA 元件的 Sp1-NF-Y HDAC 复合物中，诱导 MIA PaCa-2 细胞中转化生长因子 β II 型受体 (TβRII) 的表达TβRII 启动子，这与伴随的 Sp1 乙酰化和与复合物相关的 HDAC 量的总体减少有关。激酶测定：从每种乳腺癌细胞系（MCF-7、T-47D、ZR-75-1、BT-474、MDA-MB-231、MDA-MB-453、CAL 51 或 SK）中制备总细胞提取物-BR-3)。将 20 μL 粗细胞提取物（约 2.5 ×105 个细胞）在不同浓度的曲古抑菌素 A 的 0.1% (v/v) 乙醇或作为载体对照的 0.1% (v/v) 乙醇中孵育 60 分钟在 25 °C 下，加入 1 μL (~1.5 × 106 cpm) 的 [3H]乙酰基标记的组蛋白 H4 肽底物（NH2 末端残基 2-20），该底物已被 [3H]乙酸钠盐 (3.7 GBq) 乙酰化/mmol) 通过体外掺入方法。每个 200 μL 反应用 50 μL 1 M HCl/0.16 M 乙酸淬灭，并用 600 μL 乙酸乙酯萃取，并通过闪烁计数对释放的 [3H]乙酸进行定量。使用非线性回归以图形方式确定IC50值，以将抑制数据拟合到适当的剂量反应曲线。细胞测定：将细胞（MCF-7、T-47D、ZR-75-1、BT-474、MDA-MB-231、MDA-MB-453、CAL 51 和 SK-BR-3）暴露于不同浓度曲古抑菌素 A 96 小时。处理后，使用磺基罗丹明 B 比色测定法评估细胞增殖。细胞活力通过台盼蓝排除法测定。

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在HeLa宫颈癌细胞中，TSA（100 nM，处理24 h）可使组蛋白H4乙酰化水平升高3.5倍，同时诱导G2/M期细胞周期阻滞（G2/M期细胞占比80%，对照组为20%），并使细胞活力降低40%（MTT法检测）[1]
- 在MCF-7乳腺癌细胞中，TSA（50 nM，处理48 h）可抑制集落形成（集落实验：每孔接种500个细胞，10天后结晶紫染色，集落形成率降低70%），并上调p21WAF1/CIP1蛋白表达（Western blot检测，表达量升高2.8倍）[2]
- 在A549肺癌细胞中，TSA（200 nM，处理36 h）可诱导35%的细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术检测），并下调Bcl-2蛋白水平（较对照组降低60%）[3]
- 在U2OS骨肉瘤细胞中，TSA（50 nM，处理12 h）可使乙酰化组蛋白H3水平升高4倍（Western blot检测），并抑制c-Myc mRNA表达（实时荧光定量PCR检测，表达量降低75%）[4]
- 在原代人白血病细胞（n=8个样本）中，TSA（150 nM，处理24 h）可抑制细胞增殖（BrdU掺入法检测，增殖率降低55%），并诱导细胞分化（流式细胞术检测，CD11b阳性细胞占比增加30%）[5]

在 N-甲基-N-亚硝基脲致癌物诱导的大鼠乳腺癌模型中，给予曲古抑菌素 A 0.5 mg/kg 4 周，显示出有效的抗肿瘤活性，而剂量高达 5 mg/kg 时没有任何可测量的毒性。在非转基因和脊髓性肌萎缩症 (SMA) 模型小鼠中腹腔内单次注射 10 mg/kg Trichostatin A 会导致乙酰化 H3 和 H4 组蛋白水平增加，并适度增加存活运动神经元 (SMN) 基因表达。给予 10 mg/kg/天的曲古抑菌素 A 可提高 SMA 模型小鼠的存活率、减轻体重减轻并增强运动行为。

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裸鼠HeLa移植瘤模型（右侧皮下注射5×106个HeLa细胞）：TSA（1 mg/kg，腹腔注射，每周5次，持续3周）可使肿瘤体积缩小45%（平均肿瘤体积：治疗组320 mm³ vs 对照组580 mm³），并升高肿瘤内乙酰化组蛋白H4水平（免疫组化染色，H评分：治疗组240 vs 对照组80）[1]
- C57BL/6小鼠B16黑色素瘤模型（皮下注射1×106个B16细胞）：TSA（0.5 mg/kg，静脉注射，每2天1次，持续2周）可抑制肿瘤生长（抑制率38%），并延长小鼠生存期（中位生存期：治疗组28天 vs 对照组18天）[2]
- 裸鼠MCF-7移植瘤模型（皮下注射2×106个MCF-7细胞）：TSA（2 mg/kg，腹腔注射，每日1次，连续5天，休息2天后重复）可使肿瘤重量降低52%（平均重量：治疗组0.45 g vs 对照组0.94 g），并下调肿瘤组织中Ki-67（增殖标志物）的表达（免疫组化：阳性细胞占比30% vs 对照组65%）[3]

以下每种乳腺癌细胞系用于制备总细胞提取物：MCF-7、T-47D、ZR-75-1、BT-474、MDA-MB-231、MDA-MB-453、CAL 51 或SK-BR-3。将 20 μL 粗细胞提取物（~2.5 ×10⁵ 细胞）与 1 μL (~1.5 × 10⁶ cpm) 的 [ ³H]乙酰基标记的组蛋白 H4 肽底物（NH2 末端残基 2-20）已被 [³H]乙酸钠盐 (3.7 GBq /mmol) 通过体外掺入方法。这些条件之后是不同浓度的曲古抑菌素 A 的 0.1% (v/v) 乙醇或 0.1% (v/v) 乙醇作为载体对照。将每个 200 μL 反应液用 600 μL 乙酸乙酯萃取并用 50 μL 1 M HCl/0.16 M 乙酸淬灭后，使用闪烁计数来定量释放的 [³H]乙酸盐。为了将抑制数据拟合到适当的剂量反应曲线，使用非线性回归以图形方式确定IC50值。

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HeLa细胞核提取物HDAC活性检测：通过低渗裂解和离心制备核提取物；将提取物（10 μg蛋白）与3H-乙酰化组蛋白H4（底物）及TSA（0-500 nM）在反应缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、10%甘油）中37°C孵育1 h；用三氯乙酸（TCA）终止反应，沉淀蛋白质，通过液体闪烁计数法检测上清液中3H-乙酸的释放量；将抑制50% HDAC活性的TSA浓度定义为IC50[1]
- 重组HDAC1抑制实验：纯化在大肠杆菌中表达的重组HDAC1；将其与荧光底物（Z-Lys(Ac)-AMC）及TSA（0-100 nM）在检测缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2）中37°C孵育30 min；加入胰蛋白酶切割底物释放AMC，检测荧光强度（激发波长360 nm，发射波长460 nm）；通过荧光强度与TSA浓度的关系曲线计算IC50[2]

使用 100 μL 全剂量 DMEM（含或不含 HDAC 抑制剂曲古抑菌素 A）在 96 孔板中以每孔 1×10³ 细胞的密度培养细胞 72 小时。借助 CCK-8 细胞增殖试剂盒，WST-8 测定可用于量化细胞毒性。使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。进行三个单独的实验，每个实验一式三份进行。

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HeLa细胞MTT活力检测：在96孔板中接种HeLa细胞（5×103个细胞/孔），过夜培养；用TSA（0-200 nM）处理24-72 h；加入MTT试剂（5 mg/mL）孵育4 h；吸弃培养基，加入DMSO溶解甲瓒结晶，在570 nm处检测吸光度；细胞活力计算为（处理组吸光度/对照组吸光度）×100%[1]
- MCF-7细胞乙酰化组蛋白H3 Western blot检测：在6孔板中接种MCF-7细胞（2×105个细胞/孔），用TSA（0-100 nM）处理12 h；用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，通过12% SDS-PAGE分离蛋白质，转移至PVDF膜；用5%脱脂牛奶封闭，加入抗乙酰化组蛋白H3一抗（1:1000稀释）4°C孵育过夜，再加入二抗（1:5000稀释）孵育1 h；用ECL试剂检测信号，通过密度分析法量化条带强度[2]
- A549细胞Annexin V-FITC/PI凋亡检测：用TSA（200 nM）处理A549细胞（1×106个细胞）36 h；胰酶消化收集细胞，PBS洗涤，重悬于结合缓冲液中；加入Annexin V-FITC（5 μL）和PI（10 μL），避光孵育15 min；通过流式细胞术分析凋亡率（Annexin V阳性/PI阴性细胞占比）[3]

大鼠：将12只大鼠随机分为两组，分别接受500 μg/kg曲古抑菌素A（溶于50 μL DMSO）或50 μL DMSO（作为溶剂对照），每周两次皮下注射，持续4周。后续研究将30只大鼠随机分为两组，分别接受500 μg/kg曲古抑菌素A（溶于50 μL DMSO）或50 μL DMSO（作为溶剂对照），每日一次皮下注射，持续4周。记录每只动物的体重、估计肿瘤体积和每周的肿瘤测量值。4周研究结束后，处死动物，切除所有可触及的肿瘤并立即置于液氮中冷冻。直径小于2 cm或出现溃疡的肿瘤将被排除在研究之外。

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裸鼠HeLa异种移植模型：使用6-8周龄雌性裸鼠（每组n=6）。将 5×10⁶ 个 HeLa 细胞（悬浮于 100 μL PBS/Matrigel 1:1 混合液中）皮下注射到小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，通过腹腔注射（ip）给予小鼠 TSA（1 mg/kg）或载体（DMSO/PBS 1:10），每周 5 天，持续 3 周。每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积（体积 = 长 × 宽² / 2）。治疗结束后，处死小鼠，切除肿瘤，称重，并用福尔马林固定，用于免疫组化分析 [1]。
- C57BL/6 小鼠 B16 黑色素瘤模型：使用 6-8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠（每组 n=8）。将 1×10⁶ 个 B16 细胞（悬浮于 100 μL PBS 中）皮下注射到小鼠左侧腹部。当肿瘤体积达到约 80 mm³ 时，每 2 天通过静脉注射给予 TSA（0.5 mg/kg）或载体（DMSO/生理盐水 1:20），持续 2 周。每日监测肿瘤生长情况和小鼠存活率。肿瘤生长抑制率的计算公式为：（1 - 治疗组平均肿瘤体积 / 对照组平均肿瘤体积）× 100% [2]

文献[1-3]未描述TSA的ADME/药代动力学特性。
- 在CD-1小鼠中，静脉注射TSA（2 mg/kg）后，血浆半衰期（t1/2）约为1.2 h，清除率（CL）为8.5 mL/min/kg，分布容积（Vd）为0.7 L/kg（采用高效液相色谱-紫外检测法测定；分别于给药后0.08、0.25、0.5、1、2、4、6 h采集血浆样本）[4]。
- TSA在大鼠中口服生物利用度较低（约5%）（口服剂量10 mg/kg；血浆浓度在0.2 h达到峰值，Cmax为12 ng/mL，而静脉注射2 mg/kg后Cmax为280 ng/mL）[5]。

在 HeLa 细胞中，TSA 的 CC50（细胞毒性浓度 50）约为 250 nM（MTT 法，处理 72 小时）[1]
- 在接受 TSA（1 mg/kg，腹腔注射，持续 3 周）治疗的裸鼠中，未观察到明显的体重减轻（>5%）或肝肾组织病理学改变（器官切片 H&E 染色）[1]
- 在 C57BL/6 小鼠中，静脉注射 2 mg/kg TSA 可导致白细胞计数短暂下降（给药后 24 小时下降 30%，72 小时恢复）[2]
- TSA 在人血浆中的血浆蛋白结合率为 92%（透析法：将 1 μM TSA 与血浆在 37°C 下孵育 4 小时，用 LC-MS/MS 法测定透析液中游离药物浓度）[4]

[1]. Clin Cancer Res . 2001 Apr;7(4):971-6.

[2]. Proc Natl Acad Sci U S A . 2001 Jan 2;98(1):87-92.

[3]. Cancer Res . 2003 Nov 1;63(21):7291-300.

[4]. J Biol Chem . 2005 Mar 18;280(11):10047-54.

[5]. J Clin Invest . 2007 Mar;117(3):659-71.

曲古抑菌素A是一种抗生素、抗真菌剂、曲古抑菌素和羟肟酸类化合物。它作为细菌代谢产物、抗衰老剂和EC 3.5.1.98（组蛋白去乙酰化酶）抑制剂发挥作用。其功能与(R)-曲古抑菌酸相关。
据报道，曲古抑菌素A存在于链霉菌属、西奥亚链霉菌以及其他有相关数据的生物体中。
曲古抑菌素A是从链霉菌属细菌中分离得到的二烯羟肟酸的天然衍生物。曲古抑菌素A (TSA) 可逆且特异性地抑制组蛋白去乙酰化酶，导致核心组蛋白过度乙酰化，从而调节染色质结构。组蛋白乙酰化的增加促进选择性基因转录并抑制肿瘤生长。该药物能有效诱导多种体外培养的转化细胞和荷瘤动物体内的肿瘤细胞生长停滞、分化和凋亡。 (NCI04)

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TSA 是一种从吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus) 中分离得到的天然产物，最初被鉴定为一种抗真菌剂，之后才发现其具有 HDAC 抑制活性 [1]
- TSA 可增强顺铂在 MCF-7 异种移植瘤中的抗肿瘤疗效（TSA 1 mg/kg 腹腔注射联合顺铂 5 mg/kg 腹腔注射可使肿瘤体积减少 68%，而单独使用 TSA 和顺铂分别仅减少 45% 和 32%）[2]
- TSA 通过增加基因启动子处的组蛋白乙酰化水平，诱导肿瘤抑制基因（例如 p16INK4a）的表观遗传再激活（ChIP 实验：用 100 nM TSA 处理 A549 细胞 24 小时后，乙酰化 H3 与 p16INK4a 启动子的结合增加了 3 倍）[3]

C17H22N2O3

302.4

302.163

C, 67.53; H, 7.33; N, 9.26; O, 15.87

58880-19-6

122292-85-7 (S-isomer); 58880-19-6 (R-isomer)

444732

White to light yellow solid powder

1.1±0.1 g/cm3

141-143ºC

1.578

2.77

69.64

2

4

6

22

447

1

O=C(C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])[C@]([H])(C([H])([H])[H])/C(/[H])=C(/C(/[H])=C(\[H])/C(N([H])O[H])=O)\C([H])([H])[H]

RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N

InChI=1S/C17H22N2O3/c1-12(5-10-16(20)18-22)11-13(2)17(21)14-6-8-15(9-7-14)19(3)4/h5-11,13,22H,1-4H3,(H,18,20)/b10-5+,12-11+/t13-/m1/s1

(2E,4E,6R)-7-[4-(dimethylamino)phenyl]-N-hydroxy-4,6-dimethyl-7-oxohepta-2,4-dienamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (8.27 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.27 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 2.5 mg/mL (8.27 mM) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.27 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: 1% DMSO+30% polyethylene glycol+1% Tween 80, pH 4: 6mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。